Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Zelluläre Ionentransport durch die Überwachung der intrazellulären pH-Wert oft beurteilt werden kann (pH_ich(). Genetisch bieten codiert pH-Indikatoren (GEpHIs) optische Quantifizierung von intrazellulären pH in intakten Zellen. Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung von intrazellulären pH durch zelluläre ex Vivo Leben-Bildgebung von Malpighian Tubuli von Drosophila Melanogaster mit pHerry, ein Pseudo-ratiometrischen genetisch codiert pH-Indikator.

Epitheliale Ionentransport unbedingt systemische Ion Homöostase sowie Wartung von wesentliche zelluläre elektrochemischen Gradienten. Intrazelluläre pH-Wert (pH_ich) wird von vielen Ionen-Transporter beeinflusst und somit pH_ich Überwachung ist ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung der Transporter Aktivität. Moderne genetisch codierte pH-Indikatoren (GEpHIs) bieten optische Quantifizierung der pH-Wert_ich in intakten Zellen auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Dieses Protokoll beschreibt in Echtzeit Quantifizierung der zellulären_ich pH-Wertes in Malpighian Tubuli (MTs) von Drosophila Melanogaster durch ex-Vivo Leben-Bildgebung von pHerry, ein Pseudo-ratiometrischen GEpHI mit einem p-K_ein gut geeignet zum Nachverfolgen von Änderungen der pH-Wert in der Zellflüssigkeit. Extrahierten Erwachsenen Fliege MTs bestehen aus morphologisch und funktionell unterschiedliche Abschnitte der einzellige Schicht Epithelien und dient als Modell für die Untersuchung von epithelialen Transport zugänglich und genetisch gefügig. GEpHIs bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen pH-Sensitive fluoreszierende Farbstoffe und ionenselektive Elektroden. GEpHIs können unterschiedliche Zellpopulationen beschriften, sofern entsprechende Promotor Elemente verfügbar sind. Diese Kennzeichnung ist besonders nützlich in ex Vivo, in Vivound in Situ Präparate, die von Natur aus heterogen sind. GEpHIs erlauben auch die Quantifizierung der pH_i im intakten Gewebe im Laufe der Zeit ohne Notwendigkeit einer Behandlung oder Gewebe Externalisierung wiederholte Farbstoff. Der Hauptnachteil des aktuellen GEpHIs ist die Tendenz zu aggregieren in cytosolischen Einschlüssen in Reaktion auf Gewebeschäden und Überexpression zu konstruieren. Diese Mängel, Lösungen und die Vorteile des GEpHIs werden in diesem Protokoll durch Bewertung der basolateralen (H⁺) Protonentransport in funktionell unterschiedliche Haupt- und Ganglion Zellen der extrahierten Fliege MTs demonstriert. Die Techniken und Analyse beschrieben sind leicht anpassbar an eine Vielzahl von Wirbeltieren und Wirbellosen Vorbereitungen und die Raffinesse des Assays kann von der Lehre Labs, um komplizierte Bestimmung der Ionen-Fluss über spezifische Transporter skaliert werden.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Quantifizierung von intrazellulären pH (pH_i) mit einer genetisch codierte pH-Indikator (GEpHI) zu beschreiben und zeigen, wie diese Methode zur basolateralen H⁺ Transport in einem Modell Insekt (D. Beurteilung herangezogen werden können Melanogaster) renal Struktur, Malpighian Röhrchen (MT). MTs dienen als die Ausscheidungsorgane der Fruchtfliege und sind funktionell ähnlich der Säugetier-Nephron in einigen wesentlichen Punkten¹. MTs sind als 2 Paare der Tubuli (Front- und Seitenzahnbereich) in den Thorax und Abdomen der Fliege angeordnet. Die einzelligen epitheliale Röhre von jeder MT besteht aus metabolisch aktiven wichtigsten Zellen mit deutlichen apikalen (luminalen) sowie basolateralen (Salzhaushalts) Polarität und eingefügten Ganglion Zellen. Vorderen MTs bestehen aus 3 morphologisch, funktionell und entwicklungsgeschichtlich verschiedene Segmente, vor allem die anfängliche geweitet, Segment, Übergangs-Segment und sekretorischen Hauptsegment, verbindet die Harnleiter-². Auf der zellulären Ebene Trans-epithelialen Ionentransport in das Lumen wird erreicht, indem eine apikale Plasmamembran V-ATPase³ sowie eine Alkali-Metall/H⁺ -Wärmetauscher und einen basolateralen Na⁺-K⁺-ATPase⁴, nach innen-Gleichrichter-K⁺ Kanäle⁵, Na⁺-getrieben Cl⁻/HCO₃⁻ Wärmetauscher (NDAE1)⁶und Na⁺-K⁺-2 Cl⁻ Cotransporter (NKCC; Ncc69)⁷, während Ganglion Zellen Cl^– vermitteln und Wassertransport^8,9. Dieses komplexe, aber zugänglich physiologische System bietet hervorragende Möglichkeiten zur Untersuchung der endogenen Ion Transportmechanismen in Kombination mit den vielfältigen genetischen und Verhaltensstörungen Toolsets von Drosophila.

Die Gründe für dieses Protokoll war ein genetisch formbar System für das Studium der epithelialen Ionentransport mit Potenzial für die Integration von Zelle zu Verhalten und Export von Werkzeugen zu Fremdsystemen Modell zu beschreiben. Ausdruck von pHerry¹⁰, erlaubt ein GEpHI abgeleitet aus einer Fusion von grünen pH-Sensitive Super-Ekliptik pHluorin^11,12 (SEpH) und rote pH-unempfindliche mCherry¹³, in MTs Quantifizierung der H⁺ Transport in MT-Einzelzellen durch die hohe K⁺/nigericin Kalibrierung Technik¹⁴. Wie viele Ionen-Transporter H⁺ äquivalente bewegen, dient Quantifizierung der intrazellulären pH_ich als eine funktionelle Darstellung der Ionenbewegung über eine Vielzahl von Transportern. Die Drosophila MT-Modell-System bietet auch genetische Werkzeuge in gewebespezifischen Transgene¹⁵ und RNA-Interferenz (RNAi)¹⁶ Ausdruck, die zelluläre Bildgebung mit ganz-Orgel-Assays¹⁷ kombiniert werden können ^{, 18 , 19} der Röhrchen-Funktion, erstellen Sie eine robusteste Toolset mit vertikalen Integration von Molekülen zu Verhalten. Dies steht im Gegensatz zu vielen anderen Protokollen zur Beurteilung epithelialen Biologie, wie historisch solche Messungen auf komplizierte verlassen haben und erschreckend, Mikro-Dissektion, anspruchsvolle ionenselektive Elektroden^20,21, und teure pH-sensitiven Farbstoffen²² mit restriktiven laden Anforderungen und schlechte zelluläre Spezifität in heterogenen Geweben. GEpHIs wurden verwendet, um ausgiebig pH_ich in einer Vielzahl der Zelle Arten²³messen. Frühwerk ausgenutzt die inhärente pH-Empfindlichkeit von Green Fluorescent Protein (GFP) pH-Wert_ich in kultivierten Epithelzellen²⁴ überwachen, aber zwei Jahrzehnte habe GEpHIs verwendet in Neuronen²⁵, Glia²⁶, Pilze²⁷ , und Pflanzenzellen²⁸. Die Kombination des Potenzials für zelluläre targeting der genetischen Konstrukte durch die GAL4/UAS Ausdruck System¹⁵ und die physiologische Zugänglichkeit der Drosophila MT machen dies eine ideale Vorbereitung für Untersuchungen von pH_ich Regulierung und epithelialen Ionentransport.

pH-Wertes_ich wurde seit Jahrzehnten untersucht und ist lebenswichtig. Die MT-Vorbereitung bietet ein stabiles Modell zur Physiologie des pH-Wertes_ich Lehren aber auch anspruchsvolle Untersuchungen von pH_i Verordnung ex-Vivo - und in Vivo. Dieses Protokoll beschreibt Quantifizierung der H⁺ -Bewegung in der basolateralen Membran der Epithelzellen der Drosophila MT mit NH₄Cl Puls Säure laden Technik²¹, aber als pH-Indikator ist genetisch codiert, können diese Methoden und ihre theoretischen Rahmen zur Vorbereitung zu Transgenese und live-Imaging angewendet werden.

Alle Schritte in diesem Protokoll ist von der Mayo Clinic (Rochester, MN) Tiernutzung Richtlinien entsprechen.

1. fliegen Tierhaltung

1. Raise fliegt und Satz kreuzt nach standard Tierhaltung²⁹.
   Hinweis: Fluoreszierende Reporter Ausdruck durch das GAL4/UAS-System ist proportional zur Temperatur und somit Aufzucht Temperatur einstellbar um Ausdruck Ebene zu ändern. Während hohe Expression Ebenen oft zu einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis führen ist diese Bedingung ebenfalls erhöhte cytosolische und Organellen Aggregate zugeordnet, wenn mit GFP Fusion rot fluoreszierende Protein (RFP) wie z. B. pHerry^{10konstruiert, 30,31}. Wenn Aggregation unvermeidbar ist, ist die Quantifizierung durch ausführen noch möglich Kalibrierungen in jedem Experiment und Normalisierung der Daten zeigen, so dass ein Fluoreszenz-Verhältnis von 1,0 pH_ich 7.0 entspricht (siehe Punkt 7.4 Hinweis auf Kalibrierung unten).
2. Legen Sie Kreuze der homozygot CapaR-GAL4³² Männer homozygot UAS-pHerry¹⁰ jungfräulichen Weibchen und homozygot c724-GAL4² Männchen homozygot UAS-pHerry jungfräulichen Weibchen Bildgebung erlauben der pH-Wert_ich in Haupt und Ganglion Zellen des Mt beziehungsweise. Platz 6 UAS-pHerry Weibchen mit 3 GAL4-Männchen in frisches Fläschchen von Essen und lassen Sie zu Paaren bei 28 ° C.
   Hinweis: Larven sollte deutlich in 4D und Erwachsene beginnt zu Eclose ganzen Tag 10.
3. Frauen fliegen auf Bewegungsapparate sammeln und beiseite stellen und Alter für 10d bei 28 ° C.
   Hinweis: Das Timing des Experimentierens kann angepasst werden, um restriktiven Verhaltens Assays (z. B. die Ramsay Sekretion Assay^17,19) entsprechen, die intrazellulären pH live Imaging korreliert werden. Männlichen fliegen können verwendet werden, aber Tubuli von Weibchen sind oft größer und robuster.

2. Vorbereitung des Poly-L-Lysin-Folien.

1. Zeichnen Sie einen 40 x 20 mm Rahmen mit einem hydrophoben PAP-Stift um die Spitze des standard 75 x 25-mm-Dias und beiseite stellen und für 15 min bei RT. Einsatz große Deckgläsern trocknen, wenn die Folien nicht kompatibel sind mit imaging-Optik.
2. 2 mL der Stammlösung 0,01 % Poly-L-Lysin (PLL) auf jeder Folie übertragen und beiseite für 1 h bei RT
3. Entfernen Sie überschüssige PLL mit einer Pipette. Speichern Sie die Lösung in ein 50 mL konische Fläschchen für die zukünftige Verwendung. Shop bei 4 ° C.
4. Aspirieren Sie jede verbleibende Lösung mit einer Vakuumleitung. Die gesamte Folie Oberfläche, damit keine Lösung auf den Folien bleibt überfahren Sie die Vakuumleitung.
5. RT vor dem Gebrauch die Folien beiseite für 1 zusätzliche h festgesetzt. Speichern Sie die Folien trocken bei RT für bis zu 1 Monat in einem Standardfolie Buch.

3. Vorbereitung sezieren Gericht und Glasstäben

1. Hinzugeben Sie 0,5 mL Elastomer Härtemittel bis 4,5 mL Elastomer Basis in 35 x 10 mm Polystyrol Petrischale bei RT zu einer Tiefe von 5 mm. Mix mit einem Einweg-Pipettenspitze. Lassen Sie Elastomer, O/N bei RT heilen
   Hinweis: Elastomer sollte klar und frei von Luftblasen. Lichtung Blasen kann erleichtert werden, indem man Elastomer-Platten in einem Vakuum Glas für 10-15 min nach dem Gießen.
2. Halten Sie einen 5 mm Durchmesser Glasstab zwischen den Händen zu und schmelzen Sie die Mitte des Stabes bei einer beleuchteten Bunsenbrenner, und ziehen Sie die Enden auseinander. Als das Glas ziehen schmilzt mehr schnell zu produzieren ein dünn (0,1 mm) und konische Welle (Abbildung 1).
   Hinweis: Ein Winkel von 45° auf dem Schaft ist oft hilfreich im Umgang mit Tubuli. Dies kann erreicht werden, indem einerseits zu senken, da der schaft gezogen wird (siehe Abbildung 1).
3. Brechen Sie die dünne Welle in der Mitte mit der stumpfen Seite einer Rasierklinge einschneidig Kohlenstoffstahl. Inspizieren Sie das dünne Ende des Stabes sezierenden Rahmen um sicherzustellen, dass der Bruch sauber ist.

Abbildung 1: Herstellung von Glasstäben für den Umgang mit Malpighian Tubuli.
A - E. Prozess der Erwärmung und ziehen einen Glasstab zu produzieren eine Verjüngung und Winkel geeignet für den Umgang mit MTS Pfeile bezeichnen Richtung und das Ausmaß von Gewalt angewendet werden. F. Foto eines entsprechend gefertigten Glas-Tool. Maßstabsleiste = 10 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

4. Vorbereitung der Lösungen und Perfusion System

Hinweis: Perfusion Systeme unterscheiden sich von Hersteller. Dieses Protokoll basiert auf eine Schwerkraft-gefütterten 8-Kanal offenen Behälter mit einer Eingabe Durchflussregler Rate und eine Vakuum-driven Abfluss, aber die Methode der Montage, die MTs wie hier beschrieben mit einer Perfusion System arbeiten angepasst werden können.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
   1. Aliquoten Schneider Medium (40 mL in 50 mL konische Röhrchen) und bei 4 ° C.
   2. Lösungen (d.h. Insekt Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (iPBS) und iPBS mit NH₄Cl) bei RT Bedarf gemäß Tabelle 1). Warmen Lösungen für RT vor Gebrauch am Tag des Experiments.
      Hinweis: iPBS iPBS mit 40 mM NH₄Cl in großen Mengen (1 L oder mehr) vorbereitet und werden bei 4 ° c gelagert
   3. Bereiten Sie 8 Kalibrierlösungen in 500 mL Volumen bei pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 und 9.0 gemäß Tabelle 1 und bei 4 ° C. PH-Wert der jeweiligen Lösung durch Titration mit N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) und HCl einstellen.
   4. Am Tag der Experimente warm 5 mL Aliquots der Kalibrierlösungen auf RT und Lager Nigericin Lösung (20 mM Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) hinzufügen, um eine Endkonzentration von 10 µM zu produzieren.
      Achtung: Behandeln Sie Nigericin mit Handschuhen. Behandeln Sie alle Geräte, der in Kontakt mit Nigericin als Einweg kommt. Nigericin bleibt auf Glas und Kunststoff und gefährden biologische Präparate, wenn Ausrüstung wiederverwendet wird.
2. Perfusion System:
   1. Grundieren Sie die Perfusion System füllen Sie alle Behälter mit DdH₂O (Abbildung 2). Öffnen Sie die Kanäle eins zu einem Zeitpunkt zu allen Linien proximal zu Rate Durchflussregler füllen lassen.
      Hinweis: Es möglicherweise notwendig, Luft in den Leitungen zu löschen, um den ins Stocken geratenen Kanal öffnen und mit einem Kolben zu Laufwerk fließen aus dem Reservoir.
   2. 2 Kanäle zu öffnen und DdH₂O abtropfen lassen. Sobald der Behälter fast leer sind, füllen Sie den ersten Tank mit iPBS und den zweiten Behälter mit NH₄Cl-gepulste iPBS. Durchflussmenge auf maximum mit Rate Durchflussregler und lassen Sie jede Lösung für 1 min um den distalen Linien füllen fließen, dann stoppen Sie die Strömung (Abbildung 2).
   3. Position 2 Sätze von Löten "helfende Hände" Klemmen auf der bildgebenden Mikroskoptisch. Legen Sie eine Klammer auf jeder Seite der imaging-Plattform.
   4. Vorsichtig erhitzen die distalen 0,5 Zoll ein Stück Kapillare Glas (innen-ø 1,5 mm, Außendurchmesser 0,86 mm, Länge 100 mm) über dem Bunsenbrenner. Erstellen Sie eine 45 °-Biegung, indem das distale Ende, durch die Schwerkraft zu biegen und das Glas von der Flamme entfernen, sobald der gewünschte Winkel erreicht ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem zweiten Stück der Kapillare Glas.
   5. Gebogenes Glaskapillaren in der in-Flow Line und Vakuum angeschlossen Abfluss Line bzw. einfügen aus und klebe sie in die "helfende Hände" mit der bildgebenden Bühne des Mikroskops (Abbildung 3) ausrichten.

Abbildung 2: Perfusion System und Imaging-Konfiguration.
Komponenten für die physiologische Beurteilung des MT basolateralen Transportfunktion durch gleichzeitige Leben Fluoreszenz imaging und schnelle Lösung Austausch. Gasleitungen gezeigt sind optional und Ausbau der Experimente zur Bewertung der HCO₃^– Transport zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Flow schematische Darstellung der Perfusion Apparat für NH₄Cl Puls experimentiert.
Pfeile zeigen Fließweg und Ventil Schaltpunkte. Lösung zieht von Reservoir zur Probe durch Schwerkraft und wird durch Vakuum-Saug die Probenkammer in den Abfall Kolben entnommen. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

(5) Sezieren von Erwachsenen Drosophila vorderen Malpighian Tubuli.

1. Die Dissektion Schüssel sammeln und zog Glasstab aus Abschnitt 3, eine PLL-beschichtete Folie aus Abschnitt 2, eine selbstklebende Perfusion-Brunnen-Teiler, Vakuum Fett, ein 4 x 2" Streifen des Versiegelns Film, 2 Paar #5 feinen Pinzette und 40 mL Aliquote des Mediums und RT iPBS eiskalte Schneider.
2. Verbreiten Sie Vakuum Fett auf das Dichtband zu, und drücken Sie den Klebstoffen Perfusion-Brunnen-Teiler auf das Band an die Unterseite mit Fett bestreichen. Abziehen des Klebstoffen Perfusion-Brunnen-Teilers und Fett-Side-Down auf der Oberseite eine PLL beschichtete Folie legen. Entfernen des Perfusion-Brunnen-Teilers um einzelne Probe Brunnen in hydrophoben Fett verfolgt verlassen.
3. Platz 200 µL RT iPBS in das Fett umgeben auf der PLL beschichtete Folie gut und bewegen Sie den Schlitten unter das Stereoskop.
4. Platz FH-pHerry/CapaR-GAL4 fliegen in einem leeren fliegen Fläschchen und für 10 min auf Eis zu betäuben.
   Hinweis: Diese Methode der Anästhesie, im Gegensatz zu CO₂, sorgt dafür, dass die fliegen nicht austrocknen.
5. Gießen Sie eiskalte Schneider Medium in die sezierenden Schüssel und verwenden Sie feine Pinzette, um eine Fliege narkotisierten weibliche in die Schüssel unter einem sezierenden Stereoskop übertragen.
6. Halten Sie die Fliege durch den Brustkorb mit einer Zange und die andere um sanft den hinteren des Bauches greifen. Ziehen Sie den hinteren der Fliege mit der Pinzette kurz, bewusste Bewegungen. Sobald der Enddarm sichtbar ist, greifen das distale Ende und den Darm und MTs frei von der zugrunde liegenden Tracheen durch den Enddarm vom Körper durch sich wiederholende, kurze Schlepper ziehen.
   Hinweis: Die vordere und hintere MTs werden angezeigt wo sie auf die Kreuzung der Mitteldarm und Enddarm durch den Harnleiter treffen. Das erste paar der MTs zu freien Willen wahrscheinlich werden die hinteren Tubuli werden wie sie den Enddarm umschließen. Diese können werden ignoriert (Abb. 4A).
7. Kneifen Sie aus der vorderen MTs in den Harnleiter mit feinen Zangen, sobald der zweite Satz von MTs des Bauches ist. Dies wird der vorderen MTs aus dem Bauch heraus zu trennen und schließen Sie den Harnleiter.
8. Die kostenlose anterior MTs mit gezogenem Glas-Stab durch die Rute unter den Harnleiter schieben, so dass die Tubuli auf beiden Seiten fallen abholen. Heben Sie die MTs gerade nach oben aus der Lösung.
9. Drehen Sie den Glasstab so, dass die MTs und Harnleiter eingehalten an der Unterseite der Rute werden und den Harnleiter gerade nach unten auf die Folie senken. Befestigen Sie den Harnleiter und verschließen Sie die distalen Enden der MTs durch den Harnleiter nach unten drücken, auf der Glas-Folie (Abbildung 4 b). Manipulieren Sie die MTs nicht mehr als nötig. Der MTs sollte sich in der Lösung mit den Harnleiter zur Folie verankert schweben.
10. Verwenden Sie das feine Ende der Glasstab jedes Röhrchen vorsichtig über die Oberfläche der Folie zu fegen. Stemmen Sie die Rute gegen die Folie zu vermeiden, brechen die Röhrchen und schieben Sie den Stab über den oberen Teil des Röhrchens, Umzug distal nach proximal, Anfügen die volle Länge der einzelnen Röhrchen an der Oberfläche der PLL-beschichtete Folie (Abbildung 4).
11. Ort der Klebstoff Perfusion-Brunnen-Teiler zurück auf der Folie bilden eine kleine flüssigkeitsgefüllte weit über die montierten Röhrchen.
12. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch. Positionieren Sie den Zufluss und Abfluss Kapillaren über die ein- und Auslassöffnung der Durchblutung gut, beziehungsweise.
    Hinweis: Der gut-Teiler kann ggf. eine offene Perfusion Kammer aufgehört werden. In diesem Fall können der Zufluss und Abfluss Kapillaren auf gegenüberliegenden Seiten der eine Bildgebung gut ausgerichtet werden.

6. Überprüfung von Imaging-Protokoll und Röhrchen Gesundheit

Hinweis: Dieses Protokoll wird durchgeführt auf einem invertierten Weitfeld-Epifluorescent Mikroskop mit GFP (SEpH) und RFP (mCherry) Filter-Sets (470/40 nm Anregung (ex), 515 nm Langpass-Emission (Em), 500 nm dichroitischen und 546/10 nm ab 590 nm Langpass-Em, 565 nm dichroitischen), ein 10 X / 0,45 Luft Ziel, eine monochrome Kamera für live-Bild-Aufnahme und imaging-Software. Das Protokoll kann für jeden aufrechten angepasst werden oder Mikroskop mit automatisierter Filter Wechsel zwischen GFP und RFP Optik und Bild Software zur Datenerfassung, invertiert, obwohl optimale Belichtungszeiten, Lichtintensität und binning Parameter variieren. In allen Analyse sollte der Fluoreszenzintensität analysiert werden als mittlere Pixel Intensität in der Region of Interest (ROI), nach Hintergrundabzug in jedem Kanal mit einem ROI mit keine Fluoreszenz angrenzend an das Signal ROI enthält.

1. Schalten Sie das Mikroskop, Lichtquelle und imaging-System.
2. Offen damit verbundenen imaging-Software.
3. Blick durch das Okular und Fokus manuell einzustellen, bis das Lumen der MT unter Durchlicht sichtbar ist.
4. Klicken Sie auf Registerkarte "Acquisition" Bildanalyse-Software und wählen Sie "2 x 2" in der "Binning" Pull-Down-Menü im Abschnitt "Acquisition Mode".
5. Legen Sie ein 5 %-Graufilter in den Lichtweg Beleuchtung Licht reduzieren und minimieren Immunofluoreszenz.
6. Die GFP (SEpH) Kanal im Menü "Programme", klicken Sie auf "Live" das Fluoreszenzsignal über die Kamera zu beobachten.
7. Stellen Sie den Schieberegler "Time" um die Belichtungszeit so einstellen, dass die hellsten Pixelwerte im Histogramm Intensität ca. 40 % des maximalen Wertes sind, dann klicken Sie auf "Stopp", um die Beleuchtung zu stoppen.
8. Wiederholen Sie Schritte 6,6-6,7 in der Ausschreibung (mCherry) Kanal und bestätigen das Vorhandensein von dilatierten ersten Segment des vorderen MT und das Fehlen der cytosolischen mCherry Aggregate (indikativ für Gewebeschäden oder Überexpression) (Abbildung 4).
   Hinweis: Dilatierte Segment sollte klar ersichtlich, da es am proximalen Segment der Röhrchen und der Durchmesser des inneren Lumens dieses Segments ~ 20 µm größer als die der angrenzenden Übergangszeit Segment ist. 2 x 2 Pixel binning ist oft ausreichend, aber kann erhöht werden, um die erforderliche Beleuchtungsstärke weiter zu reduzieren. Typische Belichtungszeiten liegen zwischen 150 und 800 ms/Kanal. Verwenden Sie so wenig Licht wie möglich, um Immunofluoreszenz zu minimieren. Minimierung der Immunofluoreszenz ist entscheidend für die Verwendung von Dual-Fluorophor Indikatoren wie pHerry, wie die zwei Fluorophore unabhängig, Bleichen kann somit ungültig Verhältnis Kalibrierung.
9. Aktivieren Sie ein Zeitraffer bildgebenden Protokoll durch Klicken auf das Kontrollkästchen "Time Series".
10. Passen Sie die "Dauer" im Pulldown-Menü im Abschnitt "Time Series" auf 10 min und den "Intervall" Regler auf 0 um die gesamte Erfassungszeit mit einer maximale Bildrate Erwerb einzustellen. Ein total Erfassungsrate von 0,2 Hz ist oft ausreichend.
11. Überprüfen Sie die RFP (mCherry) Felder im Abschnitt "Kanäle" und GLP (SEpH).
12. Öffnen Sie die iPBS-Linie des Systems der Perfusion durch Aktivierung der entsprechenden Stellungsregler und starten Sie die Image-Protokoll durch Klicken auf "Start-Experiment". Nach 1 min, wechseln Sie zu NH₄Cl-Puls-Lösung für 20 s durch das entsprechende Ventil öffnen und Schließen der iPBS-Linie, dann zurück nach iPBS mit NH₄Cl Linie schließen und erneuten Öffnen der iPBS-Ventil. Lassen Sie das volle bildgebende Protokoll vor dem Anhalten der Perfusion System abgeschlossen.
    Hinweis: Time-Lapse Analyse sollte zeigen, eine stabile mCherry und ein SEpH Signal erhöht sich im Beisein von NH₄Cl, stillt nach Auswaschung und allmählich erholt.
13. Durchführen Sie eine 2-Punkt-Kalibrierung.
    1. Gut Teiler Weg von der zugrunde liegenden Folie abziehen und entfernen Sie der kapillaren Durchblutung und Klemmen aus der Bildgebung gut.
    2. Die Bildgebung mit einer 200 µL Pipette gut 200 µL Kalibrierung iPBS (pH 7.4, 10 µM Nigericin) zuweisen. Die Lösung aus der Bildgebung mit der Pipette entfernen, dann mit einem anderen 200 µL der Kalibrierlösung ersetzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4 Mal, um Komplettlösung Austausch zu gewährleisten.
    3. Inkubieren Sie die Vorbereitung in Kalibrierlösung für 30 min vor Bildgebung. Wiederholen Sie die Image-Protokoll mit den gleichen Parametern in Schritten 6,6-6.11 ermittelt, mit der Änderung von nur 1 min Bild zu erfassen.
       Hinweis: Der Perfusion System und Kapillaren werden in diesem Schritt nicht benötigt und sollte nicht an die Bildgebung auch zu vermeiden, dass die Kapillaren zu Nigericin.
    4. Die Bildgebung mit einer 200 µL Pipette gut 200 µL Kalibrierung iPBS (pH 9,0, 10 µM Nigericin) hinzufügen. Die Lösung aus der Bildgebung mit der Pipette entfernen, dann mit einem anderen 200 µL der Kalibrierlösung ersetzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4 Mal, um Komplettlösung Austausch zu gewährleisten.
    5. Inkubieren Sie die Vorbereitung in die zweite Kalibrierlösung für 10 min vor Bildgebung. Wiederholen Sie die Image-Protokoll wie in Schritt 6.13.3.
    6. Überprüfen Sie den aufgenommene Bildstapel in Bildanalyse-Software zu bestätigen, dass keine Pixel in jedem Kanal gesättigt sind, indem Sie auf "Meine ROI" und scrollen obwohl Bildstapel mit dem "Frame"-Slider beobachtend, die keine Werte in der Intensität Histogramm berichtet den Maximalwert nachweisbaren zu erreichen. Wenn keine Frames Pixel, die die maximale nachweisbare Intensität erreichen enthalten, reduzieren Sie die Belichtung Zeit oder Beleuchtung Intensität und wiederholten Abschnitt 6.
       Hinweis: Sobald hergestellt, bildgebenden Parameter zwischen Experimenten oder Kalibrierung nicht ändern, sofern Punkt Kalibrierungen sind in jeder Vorbereitung verwendet werden (siehe Punkt 8.3).
14. Analysieren Sie den Bildstapel um Fluoreszenz Intensität und Fluoreszenz-Verhältnis (SEpH/mCherry) als Funktion der Zeit zu zeichnen.
    1. Klicken Sie auf "Meine ROI" und wählen Sie das Freiform-Werkzeug. Halten Sie mit der linken Maustaste eine ~ 50 µm Länge des Mt. zu verfolgen Rechts klicken Sie und den ROI zeichnen abzuschließen, dann wiederholen Sie in einem Gebiet neben der MT einen Hintergrund ROI (Abb. 5A) definieren.
    2. Klicken Sie auf "Mittlere Intensität" unter "Messungen." Erstellen Sie eine Tabelle der Intensitätswerte durch Klicken auf "Export > Datentabelle > erstellen."
    3. Klicken Sie auf die Konfiguration-Zahnrad-Symbol und wählen Sie deaktivieren alle Parameter mit Ausnahme von "Time" und "Meine Intensität." Mit der rechten Maustaste der Registerkarte für die neu erstellte Tabelle, wählen Sie "Speichern unter", und die Daten als CSV-Datei exportieren.
       Hinweis: Ähnliche Messungen können auch mit freier Software wie ImageJ vorgenommen werden.
    4. Öffnen Sie eine Tabelle und importieren Sie die Datentabelle zu, wählen Sie die Registerkarte "Daten" gefolgt von "Vom Text".
    5. Verwenden Sie Funktionen in der Tabellenkalkulation, um die SEpH Hintergrundintensität von SEpH Signalintensität zu jedem Zeitpunkt zu subtrahieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das mCherry-Signal.
    6. Plot-jeder Kanal Intensität als Funktion der Zeit durch die Auswahl der Spalten, in denen die Zeit und Intensitätsdaten Hintergrund korrigiert und dann klicken "Einfügen > Scatter (Charts) > streuen mit geraden Linien" (Abb. 5 b).
    7. Verwenden Sie Arbeitsblattfunktionen, um SEpH/mCherry Fluoreszenz Verhältnis zu jedem Zeitpunkt zu berechnen.
    8. Grundstück-Fluoreszenz-Verhältnis als eine Funktion der Zeit durch die Auswahl der Spalten, in denen die Zeit und Verhältnis Daten und klicken dann auf "Einfügen > Scatter (Charts) > streuen mit geraden Linien" (Abbildung 5).

7. vollständige Kalibrierung des pHerry in Malpighian Tubuli Ex Vivo.

1. Zerlegen Sie und montieren Sie eine neue Reihe von anterior MTs, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
2. Tauschen Sie iPBS für Kalibrierung iPBS (pH 7.4, 10 µM Nigericin), wie in Schritt 6.13.2 beschrieben. 30 min inkubieren.
3. Suchen Sie die MTs und sammeln Sie Bildpaare SEpH/mCherry wie in 6.1-6.11 beschrieben. Ersetzen Sie die Lösung durch ein weiteres Lager der Kalibrierung iPBS beschriebene in Schritt 6.13.4., 10 min warten und Bild wieder. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die SEpH/mCherry-Verhältnis in allen Lösungen abgebildet worden ist. Erhalten pH 9,0 Bilder dauern, wie das Exemplar selten erholt sich von hohen pH-Wert.
4. Plot-Fluoreszenz Verhältnis von SEpH, mCherry von Kalibrierungen in acht Proben als Funktion der auferlegten pH_ich wie im Schritt 6.14.9 beschrieben. Passen Sie die Kalibrierdaten mit einer Boltzmann Kurve voll Kalibrierfunktion nach Gleichung 1 (Abbildung 5) zu erhalten. Wenn die Daten nicht übereinstimmen, Plotten Sie Kalibrations-Sets von jeder Probe normalisiert, so dass ein Fluoreszenz-Verhältnis von 1,0 pH_i 7.0 entspricht und erneut analysieren Sie (Abb. 5E).
   Hinweis: Wenn der letzte Prozess notwendig ist einzelne Experimente benötigen ihren eigenen inneren Punkt Kalibrierungen³³ (siehe Quantifizierung folgenden Verfahren (Schritt 8.3)).
5. Gleichung 1
   
   Wo R = SEpH/mCherry-Verhältnis und eine₁,₂, X_ound Dx sind Kurve Formstück-Parameter, minimale Fluoreszenz-Verhältnis, maximale Fluoreszenz-Verhältnis, pK_ein, und Breite der Funktion darstellt bzw.. X_o = scheinbare pK_eine der pHerry, die zwischen 7.1 und 7.4 je nach Zelltyp und genaue Kalibrierung Bedingungen variieren kann.

(8) Quantifizierung der basolateralen Säure Extrusion von Ex Vivo Malpighian Röhrchen Epithelien.

1. PHerry exprimierenden stellate Bildzellen und Principal pHerry exprimierenden Zellen gleichzeitig.
   1. Sezieren Sie vorderen MTs von einer FH-pHerry/CapaR-GAL4 -Fliege zu, wie in Abschnitt 5 beschrieben, aber nicht übertragen Sie MTs von der sezierenden Schneider Medium für die Bildgebung gut.
   2. Vorderen MTs von einer FH-pHerry/c724-GAL4 -Fliege in der sezierenden Tonschüssel mit dem in Abschnitt 5 beschriebenen Verfahren zu sezieren.
   3. Übertragen Sie die 2 Sätze von MTs in der gleichen imaging sowie 5,8-5.11 beschrieben.
      Hinweis: Wenn die Arme der MTs auf der Folie zu fegen, legen die MTs UAS-pHerry/c724-GAL4 und der FH-pHerry/CapaR-GAL4 -Tubuli nahe beieinander so pHerry exprimierenden Haupt- und Ganglion Zellen im gleichen Feld (visualisiert werden können Abbildung 6A).
2. Wenden Sie das NH₄Cl Prepulse wie in Schritt 6.12 beschrieben an.
   Hinweis: Wenn konsistente Kalibrierung (Abbildung 4 b) nicht erreicht werden konnte, durchführen einer Punkt-Kalibrierung indem pH_i auf 7.0 am Ende jedes Experiments mit Kalibrierung iPBS (pH 7,0, 10 µM Nigericin, 30 min Inkubation) nach der Klebstoff Perfusions-Brunnen-Teiler und die Perfusion Ausrüstung wurden entfernt.
3. Kalibrieren Sie Spuren von Ganglion und wichtigsten Zellen verschiedener MT-Segmente (mit dem absoluten oder normalisierte Verhältnis je nach Bedarf) mit Gleichung 2 und analysieren Sie die Erholungsphase nach NH₄Cl Rückzug durch die Anwendung der exponentiellen Zerfall Funktionen mit Software zur statistischen Analyse und Kenntnis nehmend von den Verfall-Konstante (τ) (Abb. 6 b).
   Gleichung 2
   
   Wo R = SEpH/mCherry-Verhältnis und eine₁,₂, X_ound Dx Kurve Formstück-Parameter durch Kalibrierung in Schritt 7.4 (Gleichung 1) bestimmt sind.
   1. Berechnen Sie sauren Extrusionsgeschwindigkeit (J_{H +}, siehe Gleichung 3) als Funktion der pH-Wert_ich , um Variationen in ruhenden pH_ich und Säure zwischen Vorbereitungen³⁴laden zu berücksichtigen. Verwenden der Exponentialfunktionen im Schritt 8.3 abgeleitet, um die Ableitung von pH_ich zeitlich in jedem Zeitintervall zu berechnen.
      Gleichung 3
      
   2. Berechnen Sie die intrinsische Pufferkapazität (β-_i; Gleichung 4) von der Zellflüssigkeit bei der pH_ich von Anfang an jedes Intervall im Schritt 8.3.1 basierend auf bisherigen Literatur (siehe Gleichung 4).
      Hinweis: Bei Drosophila, die gründlichste Charakterisierung von β_ich stammt aus Larven motorischen Nerv Klemmen³⁵ und diese Daten können davon ausgegangen werden, für MT Zellen in Ermangelung anderer verfügbarer Daten zu halten.
      Gleichung 4
      
   3. Berechnen Sie das Produkt von β_T (aus Schritt 8.3.2)_und DpH_ich/dt (aus Schritt 8.3.1) um J_{H +} (Gleichung 3) festzustellen.
      Hinweis: In nominell Bikarbonat-freien Lösungen wie beschrieben in diesem Protokoll, Bikarbonat-abgeleitete Pufferkapazität (β-_b) wird angenommen, dass ~ 0 mM. Insgesamt Pufferkapazität (β_T) ist die Summe der β_{ich βb}und somit β_{ich =} β_T in Ermangelung von HCO₃^–Co₂³⁶.
   4. Plot J_{H +} in Abhängigkeit von dem pH-Wert_ich am Anfang jedes Zeitintervall wie in Schritt 6.14.9 beschrieben.
   5. Bereich für alle Datensätze, die in pH_ich mittels statistischer Analysesoftware überlappen zuweisen Sie exponentiellen Zerfall Funktionen. Vergleichen Sie die Preise des Wandels der daraus resultierenden Funktionen, sauren Extrusion Preise zwischen Zellen und MT Segmente (Abbildung 6) zu vergleichen.
      Hinweis: Die am besten geeignete Funktion für Kurvenanpassung verwendet möglicherweise nicht immer einem exponentiellen. Weitere Funktionen können ersetzt werden, wenn sie die Güte der Anpassung verbessern.
   6. Berechnen Sie Säure flux (siehe Gleichung 5) als Funktion der pH-Wert_ich , um Variationen in Form und Größe der Zellen zu berücksichtigen.
      Gleichung 5
      
      Hinweis: Zellengröße können entweder direkt in Bilder gemessen oder angenähert. Wichtigsten Zellen darstellbar als Hälften ein hohles Rohr mit den folgenden Abmessungen: Innendurchmesser 24 µm; Außendurchmesser 48 µm; Höhe 50 µm. Transitional Ganglion Zellen sind variabel aber als Zylinder mit Höhen von 50 µm und einem Durchmesser von 10 µm etwa dargestellt werden können. Letzten Absatz des Vertreters Ergebnisse unten zu sehen.
   7. Bereich für alle Datensätze, die in pH_ich mittels statistischer Analysesoftware überlappen zuweisen Sie exponentiellen Zerfall Funktionen. Vergleichen Sie die Preise des Wandels der daraus resultierenden Funktionen, saure Flussmittel zwischen Zellen und MT Segmente (Abbildung 6) zu vergleichen.

Gesundes Gewebe und korrekte Kennzeichnung der vorderen MTs sind entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Während der Dissektion sollte darauf geachtet werden, nicht direkt berühren die MTs und einzige Griff führt sie durch den Harnleiter als greifen die MTs direkt zum Bruch (– Abbildung 4A B). Wenn MTs flach auf der Folie gekehrt werden, die Tubuli darf so wenig wie möglich berührt werden und überflüssige Bewegung vermieden, da dies schädigt einzellige Epithelschicht (Abbildung 4). Richtig seziert zeigen vorderen MTs gleichmäßige Verteilung der roten und grünen Fluoreszenz durch das Zytosol der Epithelzellen und morphologisch unterschiedlichen Röhrchen Segmente. Tubuli durch unsachgemäße Perfusion beschädigt oder falsche Handhabung zeigt Aggregation der rote Fluoreszenz mit keine gekoppelten grüne Aggregate und unidentifizierbaren posterior MTs erscheint einheitliche Morphologie aus dem proximalen Ende blind auf den distalen Harnleiter (Abbildung 4) . 

Einwandfreie Funktion des pHerry bestätigt werden muss aber physiologische Bewertung sowie Morphologie. Die zweckmäßigste Methode bestätigen richtigen pH-Sensor soll ein NH₄Cl Puls gelten. Unter diesen Bedingungen die grünen SEpH Signal melden die erwarteten pH-Wert-Änderungen (ein Anstieg der pH-Wert_ich während den Puls als NH₃ betritt die Zelle, eine stufenweise Abnahme während der Puls als NH₄⁺ durch K⁺ Transporter betritt und Kanäle, und einer schnellen Versauerung und allmähliche Erholung auf NH₄Cl Rückzug²¹, während das rote mCherry Signal konstant bleiben sollte (Abb. 5A– B). Das Ausmaß der Veränderungen im SEpH Signal variieren mit Protokoll und Zelltyp sollte, das mCherry Signal jedoch in allen Fällen stabil. Änderungen in der mCherry-Signal während der einzelnen Experimente zeigen Bewegungsartefakte oder progressive Generation von Sensor-Aggregate durch Zellschäden. Diese Quantifizierung der pH-Wert_ich verhindert und muss vermieden werden. Nach Abschluss der NH₄Cl Puls es ist wichtig, eine 2-Punkt-Kalibrierung durchführen (Kalibrierung iPBS, pH 7,4 und 9,0, 10 µM Nigericin) bestätigen einen ruhenden pH_ich in der Nähe von 7,4 und sicherstellen, dass die aktuellen bildgebenden Parameter nicht zur Sättigung führen Fluoreszenz-Detektion bei Fluoreszenz bei pH 9.0 (Abbildung 5) maximiert wird. Wenn pH-Wert deutlich unter 7.4 ruht, sollte das Protokoll mit gesunden MTs wiederholt werden; und wenn Sättigung bei pH 9.0 auftritt, sollte das Protokoll mit niedriger Intensität oder Exposition Leuchtzeit wiederholt werden. Sobald ausreichende bildgebenden Parameter bestimmt werden, sollte sie nicht zwischen Experimenten oder Kalibrierungen geändert werden, wenn die absolute Fluoreszenz-Verhältnisse sollen verwendet werden. Während die Pseudo-ratiometrischen Natur des pHerry eine Methode der Bewegungskorrektur in Zubereitungen, die anfällig für Bewegung oder Veränderungen in der Zelle Durchmesser bereitstellen kann, erfordert die absolute Quantifizierung der pH-Wert_ich vollständige systematische Korrelation von pHerry SEpH / mCherry Verhältnis zur pH-Wert_ich durch die Nigericin/High-K⁺ -Technik. Die Kalibrierung des pHerry bei gesunden Vorbereitungen sollten konsistent Kalibrierkurven mit einer scheinbaren pK_eine 7,1-7,4 je nach Zelle Art und Kalibrierung (Abbildung 5) produzieren. Für Zubereitungen in welche, die mcherry Aggregation unvermeidbar ist, Normalisierung der Ratio-Werte so, dass ein Fluoreszenz-Verhältnis von 1,0 pH-Wert entspricht sollte_ich 7.0 ähnlich (Abb. 5E) Ergebnissen. Wenn Punkt Kalibrierungen und normalisierte Kurven verwendet werden, imaging-Parameter kann für jede Zubereitung optimiert werden. 

Kalibrierte pH_ich Spuren können verwendet werden, um pH Regulationsmechanismus zwischen Zelltypen zu vergleichen. Das GAL4/UAS-Expressionssystem in Drosophila kann verwendet werden, pHerry in Haupt und Ganglion Zellen des vorderen MT (Abb. 6A) zum Ausdruck bringen. pH-Wertes_ich kann durch Säure-Loading Zellen mit NH₄Cl Impulsen und Quantifizierung der Einziehungsquote pH_ich beurteilt werden. Dies kann erreicht werden durch den Einbau von Exponentialfunktionen, der Erholungsphase in verschiedenen experimentellen Bedingungen, die konstante Zerfall (τ) zu extrahieren, wie Zellen mit schneller H⁺ -Efflux eine raschere Erholung (und damit geringere Werte von τ) angezeigt werden. Basierend auf dieser Analyse, scheinen Ganglion Zellen der MT robuster Säure Extrusion als wichtigsten Zellen (Abb. 6 b) haben. Diese Analyse wird halten, solange die ruhenden pH_ich, Ausmaß der Säure be- und Pufferkapazität ähneln zwischen Versuchsgruppen. Wenn diese Bedingungen nicht erfüllt sind, ist es jedoch notwendig, entfallen auf die Beobachtung, dass intrinsische Pufferkapazität des Zytosol (β-_i) aus vielen Zellen selbst ist pH-abhängig^35,37,38 und somit die Änderungsrate pH_ich bei unterschiedlichen pH_i möglicherweise nicht direkt vergleichbar. In solchen Fällen passen Exponentialkurven an folgende Phase Säure Extrusion ein NH₄Cl Puls und vorher festgelegten Schätzungen der intrinsischen Pufferkapazität (β-_i) können verwendet werden um die sauren Extrusionsgeschwindigkeit (J_{H +}) zu zeichnen als Funktion der pH-Wert_ich und kompensierten Geschwindigkeit der sauren Extrusion (Gleichungen 3 & 4) bestimmt. Sobald Unterschiede in Säure be- und ruhen pH_ich berücksichtigt werden, denn offensichtlich ist Säure Extrusion in den wichtigsten Zellen des Übergangs Segments überschreiten, Ganglion Zellen (Abbildung 6). Während überzeugend, diese Analyse befasst sich nicht gemessene pH-Wert_ich ist eine Funktion des Volumens während saure Extrusion über die Plasmamembran eine Funktion der Membranfläche ist. Division J_{H +} von der Fläche zum Volumenverhältnis der Zelle von Interesse erbringt Werte in Mol Säure-Äquivalente pro Einheitsfläche pro Zeiteinheit (Gleichung 5), wodurch die Berichtigung für Unterschiede in der Zellengröße und Morphologie. Etwa zwei wichtigsten Zellen umfassen den Umfang der MT in der Übergangszeiten Segmenten und so können einzelne Zellen als die Hälfte aus einem Rohr (Innendurchmesser 24 µm; Außendurchmesser 48 µm Höhe 50 µm) modelliert werden. Ganglion Zellen sind kleiner und neigen dazu, in der Übergangszeit Segment des MT²stabförmige. Exakte Quantifizierung von Fläche und Volumen ist schwierig, aber auch konservative Annäherungen des Übergangs stellate Zelle Form (Zylinder mit einer Höhe von 50 µm und einem Durchmesser von 10 µm) zeigen eine Fläche zum Volumenverhältnis mindestens 2 x der wichtigsten Zellen. Berücksichtigung dieser zeigt, dass der stellate Zelle Acid Flux deutlich unter dem des Übergangs wichtigsten Zellen liegt und in der Tat nähert sich das erste Segment wichtigsten Zellen (Abbildung 6).

Abbildung 4: Dissektion der Erwachsenen Drosophila vorderen Malpighian Tubuli.
A. schematische Darstellung der anterioren MT Entfernung mit 2 Paar feine Pinzetten in gekühlten Schneider Medium. "A. Röhrchen" = Anterior Mt. "P. Röhrchen" = posterior Mt. B. Prozess der abrufen und Montage extrahiert MTs mit dünnen Glasstäben. C. Prozess des Festhaltens der vollen Länge des MTs auf einer Folie für Bildgebung und physiologische Beurteilung extrahiert. D. Vertreter Weitfeld-Bilder von der SEpH (470/510 nm ex / Em) und mCherry (556/630 nm ex / Em) FH-pHerry angetrieben CapaR-GAL4 Darstellung gesunde anterior MTs, vorderen MTs beschädigt durch unzureichende Durchblutung und misidentified posterior MTS. beachten Sie, dass gesunde anterior MTs eine klare dilatative blinde erste Segment, eine verengte Übergangszeit Segment mit relativ erhöhten Ausdruck der UAS-pHerry wenn CapaR-GAL4und einem distalen Main angetrieben anzeigen Segment. MTs Display spürbar Aggregate mCherry Fluoreszenz mit keine entsprechenden SEpH Fluoreszenz beschädigt. Posterior MTs sind einheitlich im Durchmesser mit keine morphologisch unterschiedliche Segmente. Maßstabsleiste = 50 µm. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Validierung und Kalibrierung von pHerry in Malpighian Tubuli.
A. Vertreter Weitfeld-Bilder von der SEpH (470/510 nm ex / Em) und mCherry (556/630 nm ex / Em) Komponenten des FH-pHerry angetrieben von CapaR-GAL4 Darstellung gesunde anterior MTS "ROI" Markierungen signalisieren Region von Interesse. "BG" Marken Hintergrund Region von Interesse, die anschließend aus dem Signal ROI in den gleichen Kanal abgezogen wurde. Maßstabsleiste = 50 µm. B. Relative Fluoreszenz Änderungen SEpH und mCherry Signale von pHerry als Reaktion auf eine 20 s 40 mM NH₄Cl Puls. Beachten Sie, dass das mCherry Signal stabil ist, während die SEpH Signal einen charakteristischen Anstieg während der Puls zeigt (indikativ für Alkalisierung, d.h. erhöhte pH_ich) und einem starken Rückgang bei der Auswaschung (indikativ der Versauerung, d.h. verringerte pH_ich). C. Fluoreszenz Verhältnis von pHerry (SEpH/mCherry) berechnet aus den Daten in B mit zusätzlichen Daten nach 30 min Inkubation in Kalibrierung iPBS (10 µM Nigericin, 130 mM K⁺, pH 7,4 und 9.0). D. Kalibrierkurve aus absoluten pHerry Verhältnis aufgebaut (SEpH / mCherry) als Funktion der pH-Wert_ich während der Exposition gegenüber Kalibrierung iPBS gepuffert, einer der acht pH-Werte auferlegt. Graue Kreise sind Einzelwerte Form 8 Vorbereitungen. Schwarze Quadrate und Bars sind mittlere ±SD. Kurve Boltzmann passt. E. dieselbe Daten wie in D so normalisiert, dass Fluoreszenz-Verhältnis bei pH 7,0 ist 1.0. Kurve wird sigmoidale Kurvenanpassung (siehe Punkt 7.4, Gleichung 1) geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: Quantifizierung der sauren Extrusion in Malpighian Röhrchen Epithelien.
A. Weitfeld-Bild der SEpH Fluoreszenz (von pHerry) in den wichtigsten Zellen des vorderen MT (links, getrieben von CapaR-GAL4 -Treiber) und Ganglion Zellen des vorderen MT (rechts, angetrieben durch c724-GAL4). Beachten Sie, dass Ganglion Zellen stabförmige im ersten Segment, variabel in der Übergangszeit Segment sind und deutliche zelluläre Projektionen im Hauptsegment zeigen. Maßstabsleiste = 100 µm. B. Kalibriert, pH_ich Veränderungen in Reaktion auf eine 20 s 40 mM NH₄Cl Puls in den Regionen von Interesse in eine (wichtigsten Zellen der Übergangszeit Segment, wichtigsten Zellen des ersten Segments und Ganglion Zellen des Übergangs Segments) gekennzeichnet. Gestrichelte Kurven zeigen, dass einzelne exponentielle passt auf sauren Erholungsphase nach NH₄Cl Rückzug angewendet von der angegebenen Verfalls (τ) konstante Werte abgeleitet werden. C. Säure Extrusionsgeschwindigkeit (J_{H +}) dargestellt, wie eine Funktion pH_i abgeleitet von der exponentiellen in B. gesehen passt Siehe Schritt 8.3.1 für J_{H +} Berechnung (Gleichung 3). Gestrichelte Kurven sind exponentielle passt auf jedes Grundstück Daten im Bereich der Überlappung pH_ich gekennzeichnet durch das graue Feld angewendet. D. saure Flussmittel aufgetragen wie eine Funktion pH_i abgeleitet von der exponentiellen gesehen in B und Gleichung 5passt. Gestrichelte Kurven sind exponentielle passt auf jedes Grundstück Daten im Bereich der Überlappung pH_ich gekennzeichnet durch das graue Feld angewendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Experimentelle fliegen Lösungen.
iPBS-Lösungen sind bei Raumtemperatur vorbereitet und pH-Wert wird durch Titration mit HCl und NaOH. Kalibrierlösung wird mit HCl und NMDG titriert. Puffer der Kalibrierlösung variiert je nach gewünschten pH-Wert [2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES) für pH = 4.0-6.0; 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) für pH = 6,5-7,5; N-[Tris (Hydroxymethyl) Methyl] -3-Aminopropanesulfonic Säure (TAPS) für pH = 8,0-9,0]. Alle Werte in mM, außer pH (ohne Einheitenangabe) und Osmolalität (Mmol/kg). Lager Nigericin in DMSO wird Kalibrierlösungen, eine Endkonzentration von 10 µM kurz vor dem Einsatz hinzugefügt.

Tabelle 2: Liste der veröffentlichten cytosolischen GEpHIs
Erregung Maxima, Emission Maxima und scheinbare pK_ein Werte sind ungefähre Angaben und können je nach Expressionssystems, bildgebendes Verfahren und Kalibrierverfahren. FLIM = Fluoreszenz Lifetime imaging Microscopy. NIR = nahes Infrarot.

Der Erfolg der Quantifizierung der pH-Wert_ich in Drosophila MTs hängt ganz von der Gesundheit der extrahierten MTs und die Qualität der Montage und Zerlegung (Abbildung A – C). So ist der sorgsame Umgang mit Gewebe wie beschrieben zwingend. Folien, die frisch in PLL beschichtet Folien wesentlich Hilfe MT Montage, wie sie neigen dazu, viel mehr Kleber als die zuvor ausgesetzt waren auf Lösung. Sorgfältige Montage hilft auch bei der Identifizierung der unterschiedlichen MT Segmente (Abbildung D). Gesunde MTs erleichtern Kalibrierung von pHerry und funktionale Bewertung durch Verringerung der mCherry Aggregation und nachgiebig viel konsistenter Quantifizierung der sauren Extrusion, bzw.. In einigen Fällen ist die Vermeidung mCherry Aggregation nicht möglich da die experimentellen Bedingungen von Natur aus MT Epithelien beschädigen oder erhebliche Überexpression des fluoreszierenden Reporters zu produzieren. In diesen Fällen normalisiert eine Pseudo-ratiometrischen Kalibrierung Fluoreszenz Verhältnis 1,0 entspricht pH_ich 7.0, und Punkt-Kalibrierungen erlauben Quantifizierung (Abbildung E). Darauf sollte geachtet werden, bei der Durchführung von Kalibrierungen Punkt zu vermeiden, dass die ständige Elemente der Bildgebung und Perfusion zu Nigericin als die Ionophore auf Glas und Kunststoff haftet. Sogar Pseudo-ratiometrischen Kalibrierung kann nicht für Umstände in denen induziert eine experimentelle Manipulation Zellschädigung während eines Experiments, d.h. diese Schäden bewirkt eine scheinbare Progressive Zunahme der mCherry Fluoreszenz während des Experiments. In diesen späteren SEpH-Fluoreszenz-Signal kann mit einer normalisierten Kalibrationskurve verwendet werden und zeigen Kalibrierungen, mit dem Vorbehalt, die die Bildgebung für Bewegungsartefakte und fokale Veränderungen nicht mehr korrigiert werden.

GEpHIs tragen mehrere allgemeine Einschränkungen im Vergleich zur Quantifizierung der pH-Wert_ich mit Fluoreszenz-Farbstoffen. Farbstoff Retention kann als Indikator für die Membran Integrität und Zelle Gesundheit³⁹verwendet werden, aber keine entsprechenden Assay ist GEpHIs einsatzbereit. Als solche muss die Vorbereitung-Gesundheit durch unabhängige Mittel überwacht werden, wenn Zellschäden vorhergesagt wird, um Ergebnisse zu verwirren. GEpHIs erlauben möglicherweise Bildgebung von minimal gestört in Vivo Vorbereitungen aber Gewebe Integrität von Natur aus begrenzt experimentelle Manipulationen und kann Kalibrierungen unmöglich zu zeigen. Eine weitere spezifische Einschränkung innewohnt mit pHerry und anderen cytosolischen dual Fluorophor-pH-Indikatoren (z. B. ClopHensor⁴⁰) leitet sich von zwei Fluorophore tendenziell verändern ihre Fluoreszenz unabhängig von einander und pH_ich . RFP Aggregation Artefakte sind die bedeutendste Manifestation dieser Einschränkung aber Quantifizierung kann auch durch Immunofluoreszenz von einem oder beiden Fluorophore beeinträchtigt werden. So imaging Protokolle viel angepasst werden, um Immunofluoreszenz, zu minimieren, die zu lange Belichtungszeiten und Erfassungsraten führen kann < 0,2 Hz. lange Belichtungszeiten fehl, rasche pH-Wert_ich melden verschiebt. SEpH Fluoreszenz zeigt lineare Korrelation pH_ich von pH 6,8-7,8 in den meisten Präparaten, aber die Genauigkeit solcher Messungen hängt die Genauigkeit von Nigericin/High-K⁺ -Technik. Nigericin wirkt wie ein K⁺/h⁺ -Ionophore und korrekte Kalibrierung setzt auf Äquilibrierung extrazelluläre [K⁺] mit intrazellulären [K⁺]. Schätzungen der intrazellulären [K⁺] sind nicht verfügbar oder für alle experimentellen Systemen leicht erhältlich. Genauigkeit der pH-Wert_ich Quantifizierung werden nur so zuverlässig wie Schätzungen der intrazellulären [K⁺], obwohl relativer Veränderungsraten in pH_ich konsistent ist. Intrazelluläre [H]⁺] Diese Beschränkung und die inverse logarithmischen Beziehung der pH-Wert_ich geschenkt, es ist immer vorzuziehen, Berichtsdaten als Veränderungsraten von pH_ich, saure Extrusionsgeschwindigkeit (J_{H +}, Abbildung 6), oder saure Flussmittel (Abbildung 6) als absolute Veränderung im pH-Wert_ich. Analyse der Daten wie saure Flussmittel hat den zusätzlichen Vorteil der Berichtigung für Unterschiede in der Oberfläche sind Volumen-Verhältnis zwischen Zelltypen.

Mehrere Einsprüche müssen geschätzt werden, beim Dolmetschen Daten von Erwachsenen MT Vorbereitung in diesem Protokoll beschrieben fliegen. Die morphologische Unterscheidung der Initial, Übergang und Hauptsegmente ist wahrscheinlich eine Vereinfachung für die wahre Vielfalt der funktionale und genetische Domänen in der MTs-²vorhanden. Darüber hinaus während dieses Protokoll entworfen, um die Funktion des basolateralen Acid Transporter zu erkennen ist es möglich, dass apikalen Transport pH_i Messungen sowie beeinflussen kann. Abdichtung der Harnleiter bei der Montage der MTs (Schritt 5.9) sorgt dafür, dass Lösung der Austausch in erster Linie an der basolateralen Oberfläche tritt aber Para-Mobilfunk und apikalen Bewegung von Ionen kann pH_i noch beeinflussen, wie basolateralen Transport letztlich verändert die zytoplasmatischen Seite von Lumen/cytosolischen Ionen-Gradienten. Absolute Trennung der apikalen und basolateralen Funktion kann erreicht werden, indem unabhängig Vorrichtung der luminalen und basolateralen Oberflächen von MT, aber solche Methoden sind wesentlich mehr technisch anspruchsvoll, da sie Mikropipette Kanülierung^{41 erfordern} .

GEpHIs präsentieren viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden zur Messung der pH-Wert_, und diese stärken werden verstärkt, wenn kombiniert mit der genetischen Formbarkeit und low-cost der Drosophila MT Vorbereitung. Quantifizierung der pH-Wert_ich hat historisch geltend gemacht fluoreszierende Farbstoffe wie (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)²² oder komplizierte elektrophysiologische Bewertung über ionenselektive Elektroden^{20 ,21}. Wie pHerry genetisch codiert ist, kann in bestimmten zellulären Populationen von spezifischen Promotoren ausgedrückt werden, (wie hier in wesentlichen und Ganglion Zellen des Mt, Abbildung 6veranschaulicht) und ist geeignet, um in jedem Gewebe unterliegen Transgenese verwenden, Transfektion oder virale-vermittelte Infektion. Farbstoffe sind begrenzt durch Kosten für individuelle Vorbereitungen und potenziell komplizierte Anwendungsprotokolle, die keine Zelle Besonderheit in heterogenen Geweben zu vermitteln. Ionenselektive Elektroden erfordern spezialisierten Ausrüstung für Herstellung und Messung, während pHerry erfordert nur Weitfeld-Epifluorescent-Mikroskopie mit konventionellen GFP und RFP Filtersätze. Verwendung von Farbstoffen und Elektroden notwendig körperliche sowie optische Anbindung an das Gewebe von Interesse, während GEpHIs in frisch entnommenen Gewebe und über Zeit in Vivoüberwacht werden können. Die Möglichkeit für live Imaging in intakten Vorbereitungen ist von besonderem Interesse bei schönem Beurteilung der Zellphysiologie_ich pH-Wertes wie keine andere Technologie Quantifizierung der pH-Wert_ich in Anwesenheit von endogenen Pufferung Mechanismen.

Die Drosophila Erwachsenen MT Vorbereitung präsentiert viele attraktive Funktionen für Interessenten an zelluläre pH-Wert Regulierung und Ionen-Transport. Drosophila -Zucht ist kostengünstig und Tools wie genetisch codierte Biosensor Konstrukte und RNAi Ausdruck Einsätze stehen aus einer Vielzahl von Lager-Zentren (Bloomington Drosophila Stock Center an der Indiana University; Drosophila Forschung in Wien). Drosophila MTs bestehen aus einer einzigen Schicht von polarisierten Epithelzellen, wodurch sie ideal für die Untersuchung der Ionentransport berührt. Basolateralen Transport kann leicht geprüft werden (wie hier gezeigt) aber vollständige Bewertung der apikalen und basolateralen Ionenbewegung mit Mikropipette Kanülierung⁴¹möglich ist. Darüber hinaus Organfunktion Proben wie Ramsay Sekretion Assay¹⁷ und der luminalen Kalzium-Oxalat Ablagerung¹⁸ gut charakterisierten sind und Korrelation von epithelialen Zellphysiologie, Modelle der Flüssigkeit Sekretion zu ermöglichen und Nephrolithiasis, beziehungsweise. Während diese Features Möglichkeiten für robuste Analyse bieten, macht die Low-Cost und breite Verfügbarkeit der Epifluorescent Mikroskopie der Drosophila MT-Modell ideal für Demonstrationen der zellulären und ganz-Orgel Physiologie im Unterrichten von Laboratorien.

Beherrschung dieser Methoden ermöglicht die Quantifizierung des pH-Wertes_ich durch basolateralen H⁺ flux in Erwachsenen Drosophila MTs, eine zugängliche und dennoch robuste Modell der Ttransepitelialen Ion zu transportieren. Verwendung von GEpHIs kultiviert wie pHerry leicht an pH-_i -Verordnung in anderen Wirbellosen Zelltypen beurteilen kann Säugerzellen und in-Vivo -Vorbereitungen. Entwicklung von neuen GEpHIs folgen, dass genetisch codierte Kalzium Indikatoren, wahrscheinlich mit neuen Generationen des sichtbaren Spektrums überspannt und Bewältigung der aktuellen Einschränkungen z. B. Aggregation Artefakte^{30,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49}. GEpHIs wurden bereits ausführlich berichten der mitochondrialen Matrix pH^50,51verwendet und subzelluläre gezielte Strategien existieren, um Biosensoren endoplasmatische Retikulum⁵², Kern ^{lokalisieren 53}, synaptischen Vesikel^12,43, und der zytoplasmatischen⁵⁴ und Außenflächen der zellulären Plasmamembran⁵⁵ (siehe Tabelle 2 für eine Liste der veröffentlichten Reagenzien). Als solche werden Werkzeuge zur Verfügung stehen sie vertikale Integration der subzellulären pH-Wertes mit anderen Aspekten der Zellphysiologie, wie Ca^{2 +} Handling und intrazelluläre Signal- und ganze Organfunktion über eine Vielzahl von Wirbeltieren ermöglichen und Wirbellosen Vorbereitungen.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH DK092408 und DK100227, Herst AJR wurde von T32-DK007013 unterstützt. Möchten die Autoren danken Dr. Julian A.T. Dow für die CapaR-GAL4 und c724-GAL4 Drosophila Bestände. Wir danken auch Jacob B. Anderson für die Unterstützung, die Aufrechterhaltung der experimenteller fliegen Kreuzungen.