用荧光基因编码的 ph 指示剂对果蝇氏小管上皮细胞内 ph 值的光学定量

细胞离子传输通常可以通过监测细胞内 ph 值(ph 值_i)来评估。基因编码的 ph 值指标(GEpHIs)提供了细胞内 ph 值的光学定量。本议定书详细介绍了细胞内 ph 值的量化, 通过蜂窝状的前体活成像的氏管的果蝇与 pHerry, pseudo-ratiometric 基因编码的 pH 指标。

上皮离子转运对系统离子稳态和基本细胞电化学梯度的维持至关重要。细胞内 ph 值 (ph 值_i) 受许多离子转运体的影响, 因此监测 ph 值_i是评估转运体活动的有用工具。现代基因编码的 ph 指标 (GEpHIs) 提供了在细胞和亚细胞尺度上的完整单元的 ph 值_i的光学定量。本议定书描述 real-time 定量的细胞 pH_i调节在氏管 (MTs) 的果蝇通过ex 活体成像 pHerry, pseudo-ratiometric GEpHI 与 pK非常适合跟踪胞中的 pH 值变化。提取的成人蝇 MTs 是由形态和功能分明的单细胞层上皮的部分组成, 并可作为一个容易接近的和基因驯服的研究上皮运输模型。GEpHIs 提供了一些优于传统 pH 敏感荧光染料和离子选择电极的优势。GEpHIs 可以标记不同的细胞数量提供适当的启动子元素可用。此标记在ex 体内、体内和原位准备工作中特别有用, 它们本质上是异构的。GEpHIs 也允许定量的 pH 值_i在完整的组织, 而无需重复染料治疗或组织外化。当前 GEpHIs 的主要缺点是在组织损伤和构造表达的反应中, 聚集在胞浆包裹体中的倾向。这些缺点, 它们的解决方案, 和 GEpHIs 的内在优势, 通过评估侧质子 (H) 在功能分明的主要和星状细胞中提取的飞行 MTs 的传输来证明.所描述的技术和分析可以很容易地适应各种各样的脊椎动物和无脊椎动物的准备工作, 而且化验的复杂程度可从教学实验室扩展到通过特定转运体对离子通量的复杂测定。

本议定书的目的是用基因编码的 ph 指示剂 (GEpHI) 描述细胞内 ph 值 (ph 值_i) 的量化, 并演示这种方法如何用于评估模型昆虫中的侧 H⁺传输 (D。腹氏管 (MT) 的肾脏结构。MTs 作为果蝇的排泄器官, 在几个关键方面与哺乳动物肾单位的功能相似,¹。在苍蝇的胸腔和腹部, MTs 排列为2对小管 (前后)。每个 MT 的单细胞上皮管由新陈代谢活性主细胞组成, 具有明显的顶端 (腔) 和侧 (腔) 极性, 以及夹层星状细胞。前 MTs 由3形态、功能和发育的不同部分组成, 特别是最初的扩张段、移行段和分泌主段, 它们连接到输尿管的²。在细胞尺度的跨上皮离子传输到流明是由一个顶端的等离子膜 V atp 酶³和一个碱金属/H⁺换热器以及一个侧 Na⁺-K-atp 酶⁴,内整流 K⁺通道⁵, Na⁺驱动 Cl⁻/小贩₃⁻交换器 (NDAE1)⁶和 Na⁺-K⁺2Cl⁻ cotransporter (NKCC;Ncc69)⁷, 而星状细胞介导 Cl^-和水传输^8,9。这一复杂但容易接近的生理系统提供了极好的机会, 研究内源性离子转运机制时, 结合了不同的遗传和行为工具的果蝇。

这个协议的基本原理是描述一个遗传可塑性的系统研究上皮离子运输有潜在的集成从细胞到行为和出口的工具到其他模型系统。pHerry¹⁰的表达式, GEpHI 从绿色 ph 值敏感的 super-ecliptic pHluorin^11、12 (SEpH) 和红色 ph 不敏感的 mCherry¹³的融合中派生而来, 在 MTs 中允许量化 H⁺传输单 MT 细胞通过高 K⁺/尼日利亚校准技术¹⁴。由于许多离子转运体移动了 H⁺当量, 细胞内 pH 值_i的量化是通过各种转运体的离子运动的功能表征。果蝇MT 模型系统还提供了功能强大的基因工具在组织特异转基因¹⁵和 rna 干涉 (干扰)¹⁶表达式, 可以结合细胞成像和全身检测^17,18,19的小管函数创建一个具有从分子到行为的垂直集成的健壮工具集。这与许多其他用于评估上皮生物学的协议相对照, 因为历史上这种测量依赖于复杂而艰巨的微解剖, 尖端的离子选择性电极^20,21,和昂贵的 pH 敏感染料²² , 具有限制性的负载要求和不均匀组织中的细胞特异性差。GEpHIs 已被用来广泛测量 pH_i在各种细胞类型²³。早期工作利用绿色荧光蛋白 (GFP) 的固有 ph 敏感度来监测培养的上皮细胞中的 ph 值_i ²⁴但过去20年中, 在神经元中使用过 GEpHIs²⁵、胶质²⁶、真菌²⁷和植物细胞²⁸。通过 GAL4/UAS 表达系统¹⁵和果蝇MT 的生理可访问性, 将基因构造的细胞靶向性结合起来, 使之成为研究 pH 值的理想准备.调节和上皮离子转运。

pH 值_i规则已进行了几十年的研究, 对生命至关重要。MT 制剂提供了一个健壮的模型来教授生理学的 ph 值_i调节, 但也执行复杂的研究 ph 值_i调节ex 体内和体内。本协议描述了使用 NH₄Cl 脉冲酸加载技术²¹, 在果蝇MT 的上皮细胞的侧膜上进行 H⁺运动的量化, 但由于 pH 值是基因编码, 这些方法和他们的理论框架可以适用于任何准备转基因和活成像。

本协议中的所有步骤均符合梅奥诊所 (罗切斯特, 锰) 动物使用指南。

1. 畜牧业

1. 饲养苍蝇和设置十字架根据标准畜牧业²⁹。
   注: 荧光报告器的 GAL4/UAS 系统的表达与温度成正比, 从而可以调节培养温度以改变表达水平。虽然高表达式水平往往会导致更好的信噪比这一条件也与增加胞浆和 organellar 聚合当使用 GFP 的红色荧光蛋白 (RFP) 融合结构, 如 pHerry^{10, 30,31}。如果聚集是不可避免的, 通过在每个实验中进行点校准来量化仍然是可能的, 并使数据正常化, 即荧光比为1.0 对应于 pH 值_i 7.0 (请参见下面的步骤7.4 说明)。
2. 将纯合的capaR-GAL4³²雄性到合合的无 pHerry¹⁰处女母和合合c724-GAL4²雄性到合合的无人的 pHerry处女雌性允许成像pH 值_i在主细胞和星状细胞的 MT, 分别。安置6个无人使用的 pHerry 女性与 3 GAL4 男性入新鲜的小瓶食物和事假交配在28° c。
   注意: 幼虫应该是明显的在 4 d 和成人将开始 eclose 在天10附近。
3. 收集雌性苍蝇后, 羽化和预留年龄为 10 d 在28° c。
   注意: 实验的时间可以调整, 以符合任何限制性行为分析 (如拉姆齐分泌化验^17,19), 这将是相关的细胞内活 pH 成像。雄性苍蝇可以使用, 但女性的小管通常更大, 更健壮。

2. 多聚 l-赖氨酸切片的制备。

1. 绘制一个 40 x 20 毫米的边界与疏水性 PAP 笔周围的标准 75 x 25 毫米幻灯片的顶部, 并预留给干燥15分钟的 RT. 如果幻灯片与成像光学不兼容, 请使用大型片。
2. 将2毫升0.01% 多聚 l-赖氨酸 (PLL) 溶液转移到每张幻灯片上, 并在 RT 上预留1小时。
3. 用吸管去除多余的 PLL。将解决方案保存在50毫升的圆锥小瓶中以备将来使用。贮存在4° c。
4. 用真空线抽吸任何剩余的溶液。在整个滑动面上运行真空线, 以确保幻灯片上没有解决方案。
5. 在 RT 使用前, 将幻灯片设置为1额外的 h。在标准幻灯片中, 将幻灯片的干燥时间存储在 RT 中长达1月。

3. 解剖盘和玻璃棒的制备

1. 添加0.5 毫升的弹性体固化剂, 以4.5 毫升的弹性体基地在 35 x 10 毫米聚苯乙烯培养皿在 RT, 以产生深度5毫米. 与一次性吸管尖端混合。允许弹性体在 RT 处治疗。
   注: 弹性体应清晰, 无气泡。在浇注后的 10-15 分钟内, 将弹性体板保持在真空罐中可以促进气泡的清除。
2. 握住5毫米直径的玻璃棒之间的手和融化的中心, 在一个点燃本生燃烧器, 而拉两端分开。当玻璃熔体拉得更快, 产生一个薄 (0.1 mm) 和锥形轴 (图 1)。
   注:45 °角在小腿经常是有用的在处理小管。这可以通过降低一只手, 因为小腿被拉扯 (参见图 1)。
3. 打破在中间的薄轴与钝方的单碳钢刀片。检查杆的细端在解剖范围, 以确保断裂是干净的。

图 1: 制作用于处理氏小管的玻璃棒。
A-E。加热和拉动玻璃棒的过程, 以产生一个适合于处理 MTs 的锥度和角度. 箭头表示要应用的力的方向和大小。F. 适当制作的玻璃工具的照片。缩放条 = 10 mm请单击此处查看此图的较大版本.

4. 溶液和灌注系统的制备

注: 灌注系统因制造商而异。该协议的基础是一个重力馈8通道开放水库的输入流量调节器和真空驱动流出, 但在这里所描述的安装 MTs 的方法可以适应任何灌注系统的工作。

1. 准备以下解决方案:
   1. 分施耐德的培养基 (40 毫升到50毫升圆锥小瓶) 和存储在4° c。
   2. 根据表 1的需要, 在 RT 上准备解决方案 (即昆虫磷酸盐缓冲盐水 (战略) 和战略与 NH₄Cl)。在实验当天使用的温热溶液。
      注: 战略和战略与 40 mM NH₄Cl 可以在大容量 (1 升以上) 和存储在4° c。
   3. 在表 6.5和7.0 ° c 的存储中, 在 500 mL 容量中准备8校准解决方案, 其 pH 值为5.0、6.0、7.3、7.6、8.0、9.0、1和4。用 n-甲基-d-葡 (NMDG) 和 HCl 滴定法对每个溶液的 pH 值进行调整。
   4. 在实验当天, 暖5毫升等分的校准解决方案, 以 RT 和添加股票尼日利亚解决方案 (20 毫米的二甲基亚砜), 以产生最终浓度10µM。
      注意: 用手套处理尼日利亚。将与尼日利亚接触的所有设备视为一次性使用。尼日利亚仍然在玻璃和塑料, 将损害生物制剂, 如果设备被重用。
2. 灌注系统:
   1. 用 ddH₂O (图 2) 填充所有储水池, 使灌注系统成为质数。一次打开一个通道, 使所有的线路接近流量调节器填补。
      注: 可能需要通过打开停滞的通道和使用柱塞从储层中驱动流来清除管线中的空气。
   2. 打开2通道, 允许 ddH₂O 将其耗尽。一旦水库几乎是空的, 填装第一个水库与战略和第二个水库与 NH₄Cl 脉冲战略。使用流量调节器将流量设置到最大值, 并允许每个解决方案流1分钟以填充远端线路, 然后停止流 (图 2)。
   3. 位置2套焊接 "帮助手" 钳在成像显微镜阶段。在成像平台的每一侧放置一个钳夹。
   4. 仔细加热一条毛细管玻璃的远端0.5 英寸 (内径1.5 毫米, 外径0.86 毫米, 长度100毫米) 在本生燃烧器。创造一个45°弯曲, 允许远端弯曲重力和从火焰中删除玻璃, 一旦达到预期的角度。重复这个过程与第二片毛细管玻璃。
   5. 将弯曲的玻璃毛细管插入内流线和真空连接的流出线, 并将其安装在 "帮助手" 上, 使它们与显微镜的成像阶段 (图 3) 对齐。

图 2: 灌注系统和成像配置。
通过实时荧光成像和快速溶液交换对 MT 侧运输功能进行生理评估所必需的组件。显示的气体线是可选的, 允许将实验扩展到小贩₃^-传输的评估中。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: NH₄Cl 脉冲实验灌注装置的流动示意图。
箭头描述流路和阀门开关点。溶液通过重力流从储层向试样移动, 并由真空吸力从试样室提取到废烧瓶中。 请单击此处查看此图的较大版本.

5. 成人果蝇前氏小管解剖。

1. 收集解剖盘和拉玻璃棒从3节, 一个锁相环涂层幻灯片从2节, 胶粘剂灌注-井分压器, 真空油脂, 4 x 2 "带密封膜, 2 对 #5 细钳, 和40毫升等分 ice-cold 施耐德的培养基和 RT 战略。
2. 将真空油脂涂在密封胶带上, 然后将粘胶灌封器压在胶带上, 用油脂把底部涂上。剥离胶粘剂灌注-井分压器, 并将其油脂-颠倒在一个 PLL 涂层幻灯片顶部。除去灌注井分压器, 使单个试样井在疏水油脂中追踪。
3. 将200µL 的 RT 战略放在锁相环上的油脂包围井上, 并在立体下移动幻灯片。
4. 将UAS-pHerry/capaR-GAL4放在一个空的飞瓶中, 在冰上麻醉10分钟。
   注: 这种麻醉方法与 CO₂不同, 可确保苍蝇不会脱水。
5. 将 ice-cold 施耐德的培养基倒入解剖盘中, 用细钳将一只被麻醉的雌性苍蝇移入盘下解剖立体。
6. 用一组镊子抓住胸部的苍蝇, 用其他的钳子轻轻握住腹部的后部。用钳子在短的、深思熟虑的动作中拉开后部的苍蝇。一旦后是可见的, 抓住远端和自由的肠道和 MTs 的基础 tracheoles 通过拉后远离身体通过重复, 简短的拖船。
   注意: 前、后 MTs 在遇到中肠和后的交界处时可见。第一对自由的 MTs 可能是后管, 因为它们包围了后。可以忽略这些 (图 4A)。
7. 在第二套 mts 无腹的情况下, 用细钳夹住输尿管前 mts。这将分离的前 MTs 从肠道和关闭输尿管。
8. 通过在输尿管下滑动杆, 使小管落到两侧, 从而将游离的前 MTs 与被拉的玻璃棒一起拿起。从解决方案中直接提起 MTs。
9. 转动玻璃棒, 使 MTs 和输尿管粘附在杆的下侧, 并将输尿管向下直向下放到幻灯片上。通过将输尿管向下压到玻璃滑块 (图 4B) 上, 在输尿管上贴上并封住 MTs 的远端。不要对 MTs 进行任何必要的操作。该 MTs 应漂浮在解决方案与输尿管锚定的幻灯片。
10. 使用玻璃棒的细端, 轻轻扫过滑动表面的每个小管。支撑杆对幻灯片, 以避免破碎的小管和滑动的杆上方的小管, 移动远端到近端, 以连接的全长每个小管到表面的 PLL 涂层的幻灯片 (图 4C)。
11. 将粘着的灌流器放回幻灯片上, 形成一个小的液体充填井。
12. 把标本放在显微镜台上。分别将流入和流出的毛细管放在灌注井入口和出口口的开口处。
    注: 如果需要开式灌注室, 则可将井分压器关闭。在这种情况入和流出的毛细血管可以与成像井的相对两侧对齐。

6. 成像协议和小管健康的验证

注意: 本协议是在一个倒置的广域 epifluorescent 显微镜上执行的, 带有 GFP (SEpH) 和 RFP (mCherry) 过滤器集 (470/40 nm 励磁 (ex), 515 nm longpass 发射 (em), 500 nm 分色和 546/10 nm 前, 590 nm longpass em, 565 nm 分色), 10 x/0.45 空气目标, 一个单色相机的实时图像捕获, 和成像软件。该协议可适用于任何直立或倒置显微镜与自动过滤开关之间的 GFP 和 RFP 光学和图像采集软件, 虽然最佳曝光时间, 光强度和分参数将有所不同。在所有的分析中, 荧光强度应该被分析为平均像素强度在感兴趣的区域 (roi), 在背景减法在每个渠道使用的 roi 与不包含荧光附近的信号 roi。

1. 打开显微镜、光源和成像系统。
2. 打开相关的成像软件。
3. 通过目镜, 手动调整焦距, 直到 MT 的流明在透射光下清晰可见。
4. 单击图像分析软件中的 "获取" 选项卡, 然后在 "获取模式" 部分的 "分" 下拉菜单中选择 "2x2"。
5. 将5% 中性密度的过滤器插入光路, 减少光照, 减少漂白。
6. 单击 "通道" 菜单中的 GFP (SEpH) 通道, 然后单击 "实时" 以通过照相机观察荧光信号。
7. 调整 "时间" 滑块设置曝光时间, 使亮度直方图中最亮的像素值大约是最大值的 40%, 然后单击 "停止" 以停止光照。
8. 在 RFP (mCherry) 通道中重复步骤 6.6-6.7, 并确认前 MT 的扩张初始段的存在以及胞浆 mCherry 聚合体的缺失 (指示组织损伤或过度表达) (图 4D)。
   注: 扩张段应清晰可见, 因为它是小管的最接近段, 而这个段内腔的直径是 ~ 20 µm 大于相邻的过渡段。2 x 2 像素分通常是足够的, 但可以增加, 以进一步减少所需的照明强度。典型曝光时间介于 150 & 800 ms/通道之间。尽量少用光来最小化漂白。最小化漂白对使用双荧光指示器 (如 pHerry) 至关重要, 因为两个荧光可以独立漂白, 从而使任何比率校准无效。
9. 通过单击 "时间序列" 复选框启用延时成像协议。
10. 将 "时间序列" 部分的下拉菜单中的 "持续时间" 调整为10分钟, 将 "间隔" 滑块设置为 0, 以最大的图像采集速率来设定总捕获时间。总收购率为0.2 赫兹, 往往是足够的。
11. 检查 "通道" 部分中的 GFP (SEpH) 和 RFP (mCherry) 框。
12. 通过激活适当的阀门控制器并通过单击 "启动实验" 启动成像协议, 打开灌注系统的战略线。1分钟后, 切换到 nh₄cl 脉冲解决方案二十年代通过打开适当的阀门和关闭战略线, 然后返回到战略通过关闭 nh₄cl 线和重新打开战略阀门。在停止灌注系统之前, 允许完整的成像协议完成。
    注: 时间失效分析应显示稳定的 mCherry 信号和 SEpH 信号, 在 NH₄Cl 的存在中增加, 解渴在冲洗后逐渐恢复。
13. 执行2点校准。
    1. 将井分压片从底层的滑动中剥离出来, 从成像井中取出灌注毛细管和夹钳。
    2. 应用200µL 校准战略 (pH 7.4, 10 µM 尼日利亚) 到成像井与200µL 吸管。用吸管将解决方案从成像井中取出, 然后用另200µL 的校准溶液代替。重复此过程4次, 以确保完成解决方案交换。
    3. 在成像前30分钟孵育校准溶液中的制剂。使用在步骤 6.6-6.11 中确定的相同参数重复成像协议, 只需修改1分钟的图像捕获。
       注 : 灌注系统和毛细血管不需要在这一步 , 不应附加到成像井 , 以避免暴细血管尼日利亚。
    4. 添加200µL 校准战略 (pH 9.0, 10 µM 尼日利亚) 到成像井与200µL 吸管。用吸管将解决方案从成像井中取出, 然后用另200µL 的校准溶液代替。重复此过程4次, 以确保完成解决方案交换。
    5. 在成像前10分钟, 在第二个校准溶液中孵育制备。在步骤6.13.3 中重复图像处理协议。
    6. 在图像分析软件中查看捕获的图像堆栈, 以确认在任一通道中没有像素通过单击 "平均 ROI" 并通过 "帧" 滑块来滚动图像堆栈, 同时观察亮度直方图中没有报告任何值达到最大检测值。如果任何帧包含达到最大可探测强度的像素, 则减少曝光时间或光照强度, 并重复6节。
       注意:一旦建立不改变成像参数之间的实验或校准, 除非点校准将在每个准备使用 (见步骤 8.3)。
14. 分析图像叠加以绘制荧光强度和荧光比 (SEpH/mCherry) 作为时间函数。
    1. 单击 "平均 ROI" 并选择 "任意多边形" 工具。按住 left-click 以跟踪50µm 长度的 MT。右键单击以完成绘制 roi, 然后在与 MT 相邻的区域中重复以定义背景 roi (图 5A)。
    2. 单击 "测量" 下的 "平均强度"。通过单击 "导出 > 数据表 > 创建" 来创建强度值表。
    3. 单击配置齿轮图标, 取消除 "时间" 和 "平均强度" 之外的所有参数。右键单击新创建的数据表的选项卡, 选择 "另存为", 并将数据导出为. csv 文件。
       注: 类似的测量也可以使用自由软件, 如 ImageJ。
    4. 打开一个电子表格表, 然后通过选择 "数据" 选项卡后面的 "从文本" 导入数据表。
    5. 使用电子表格中的函数, 从每个时间点的 SEpH 信号强度中减去 SEpH 的背景强度。对 mCherry 信号重复此过程。
    6. 通过选择包含时间和背景纠正强度数据的列, 然后单击 "插入 > 散点 (图表) > 用直线散布" (图 5B), 将每个通道强度绘制为时间函数。
    7. 使用电子表格函数计算每个时间点的 SEpH/mCherry 荧光比。
    8. 通过选择包含时间和比率数据的列, 然后单击 "插入 > 散点 (图表) > 用直线散射" (图 5C), 绘制荧光比作为时间函数。

7. 氏管中 pHerry 的完全校准Ex 体内。

1. 解剖和安装一组新的前 MTs, 如5节所述。
2. 交换战略用于校准战略 (pH 值 7.4, 10 µM 尼日利亚), 如步骤6.13.2 中所述。孵育30分钟。
3. 找到 MTs 并收集 SEpH/mCherry 图像的对, 如步骤 6.1-6.11 所述。将解决方案替换为另一库存校准战略, 如步骤6.13.4 中所述, 请等待10分钟, 再重新映像。重复此过程, 直到 SEpH/mCherry 比率在所有解决方案中都被映像。获取 ph 值9.0 的图像, 因为样本很少从高 ph 值中恢复。
4. 在八样品中, SEpH 与 mCherry 的图象荧光比值, 作为在步骤6.14.9 中所描述的 pH 值_i的函数。根据公式 1 (图 5D), 将校准数据与玻尔兹曼曲线配合使用以获得完整的校准功能。如果数据不一致, 则从每个标本的绘制校准集, 使荧光比率为1.0 对应于 pH 值_i 7.0 和分析 (图 5E)。
   注意: 如果后一个过程是必要的, 个别实验将需要他们自己的内部点校验³³ (请参见下面的量化过程 (步骤 8.3))。
5. 方程式1
   
   其中 R = SEpH/mCherry 比率和₁、₂、 x_o和dx都是表示最小荧光比率、最大荧光比率、pK_A和函数宽度的曲线拟合参数分别.x_o = 表观 pKpHerry, 根据单元格类型和精确的校准条件, 该可以变化在7.1 和7.4 之间.

8. 从前体氏小管上皮侧酸的定量化。

1. 图像 pHerry 表达的星状细胞和 pHerry 表达的主细胞同时。
   1. 如5节所述, 从UAS-pHerry/capaR-GAL4飞行中解剖前 mts, 但不将 mts 从剖析施耐德的介质转移到成像井。
   2. 使用5节中概述的程序在同一解剖盘中从UAS-pHerry/c724-GAL4中剥离前 MTs。
   3. 将2套 MTs 转换成相同的成像井, 如步骤 5.8-5.11 所述。
      注意: 当将 mts 的武器扫到幻灯片上时, 将UAS-pHerry/c724-GAL4和UAS-pHerry/capaR-GAL4小管的 mts 放在彼此附近, 以便在同一字段中可视化 pHerry 表达的主体和星状细胞 (图 6A)。
2. 如步骤6.12 所述, 应用 NH₄Cl 脉冲。
   注意: 如果一致校准 (图 4B) 无法实现, 则在每个实验结束时, 通过校准战略 (ph 7.0、10µM 尼日利亚、30 min 潜伏期), 在粘合剂后进行点校准, 将 ph 值_i设置为7.0。灌注井分流器和灌注设备已被拆除。
3. 用公式2校准不同 MT 段的星状和主单元的跟踪 (使用绝对或正常化比率), 并通过应用指数衰减函数分析 NH₄Cl 退出后的恢复阶段统计分析软件并注意衰变常数 (τ) (图 6B)。
   方程式2
   
   其中 R = SEpH/mCherry 比率和₁、₂、 x_o和dx是由步骤 7.4 (公式 1) 中的校准确定的曲线拟合参数。
   1. 计算酸挤压速率 (J_{H +}, 请参阅公式 3) 作为 ph 值_i的函数, 用于解释休眠 ph 值_i和准备工作之间的酸负荷³⁴之间的变化。使用在步骤8.3 中导出的指数函数计算在每个时间间隔内对时间的 pH 值_i的导数。
      方程式3
      
   2. 计算内部缓冲容量 (β_i;公式 4)胞在 pH 值_i中, 从步骤8.3.1 的每个间隔开始, 基于以前的文献 (请参见公式 4)。
      注: 在果蝇中, 最彻底的β_i的特性来自于幼虫运动神经终端³⁵ , 这些数据可以假设在没有其他可用数据的情况下保留 MT 细胞。
      方程式4
      
   3. 计算β_T (从步骤 8.3.2)_和 dpH_i/dt (从步骤 8.3.1) 到确定 J_{H +} (公式 3) 的乘积。
      注: 在名义上不含碳酸盐的溶液中, 如本协议所述, 碳酸氢盐的缓冲容量 (β_b) 被假定为 ~ 0 毫米。总缓冲容量 (β_T) 是β_i和_βb的总和, 因而β_{i =} β_T在缺乏小贩₃^-/CO₂³⁶。
   4. 将 J_H绘制为在步骤6.14.9 中概述的每个时间间隔开始时 pH 值_i的函数。
   5. 使用统计分析软件在 pH 值_i中重叠的所有数据集的部分应用指数衰减函数。比较结果函数的变化率, 以比较单元格和 MT 段之间的酸挤压速率 (图 6C)。
      注意: 用于曲线拟合的最合适的函数不一定是单个指数。其他的功能可以被取代, 如果他们改善了适合的善良。
   6. 计算酸通量 (请参见公式 5) 作为 pH 值_i的函数来解释单元格大小和形状的变化。
      方程式5
      
      注意: 细胞尺寸可以直接在图像中测量或近似。主要细胞可以代表作为一个空心管的一半与以下维度: 内径24µm;外径48µm;高度50µm. 过渡星状细胞是可变的, 但可以大致代表的圆筒与高度50µm 和直径10µm。请参见下面的代表性结果的最后一段。
   7. 使用统计分析软件在 pH 值_i中重叠的所有数据集的部分应用指数衰减函数。比较结果函数的变化率, 以比较单元格和 MT 段之间的酸通量 (图 6D)。

健康的组织和正确的识别前 MTs 是至关重要的成功的协议。在解剖过程中, 应注意不要直接接触 mts, 而只能由输尿管来处理, 因为握住 mts 直接会导致破损 (图 4A- B)。当 MTs 被平扫到滑梯上时, 小管必须尽可能少地接触, 避免多余的运动, 因为这会损害单细胞上皮层 (图 4C)。正确解剖前 MTs, 通过胞上皮细胞和形态上不同的小管段, 显示出红色和绿色荧光的均匀分布。不适当灌注或处理不当的小管会显示红色荧光的聚集, 没有配对的绿色聚集体, 错误后 MTs 将显示从近端盲端到远端输尿管的统一形态学 (图 4D). 

pHerry 的正常功能必须通过生理评估和形态学来确定。确定合适的 pH 值的最便捷的方法是应用 NH₄Cl 脉冲。在这些情况下绿色 SEpH 信号应该报告预期的 ph 值变动 (a 上升 ph 值_i在脉冲期间当 nh₃进入细胞时, 在脉冲期间逐渐下降的 nh₄⁺进入通过 K⁺运输和通道, 并在 NH₄Cl 退出²¹时的快速酸化和渐进恢复, 而红色 mCherry 信号应保持不变 (图 5A- B)。SEpH 信号的变化幅度随协议和细胞类型的不同而变化, 但 mCherry 信号在所有情况下都应该是稳定的。在单个实验中, mCherry 信号的变化表明, 由于细胞损伤, 运动工件或传感器聚合体的逐步生成。后者将阻止对 pH 值_i的量化, 必须避免。在完成 NH₄Cl 脉冲时, 重要的是执行2点校准 (校准战略、ph 7.4 和9.0、10µM 尼日利亚) 以确认休眠 pH 值_i接近7.4 并确保当前的成像参数不会导致饱和荧光检测时, 荧光是最大的 pH 值 9.0 (图 5C)。如果休眠 pH 值明显低于 7.4, 则应使用健康的 MTs 来重复该协议;如果饱和度发生在 pH 值 9.0, 则应以较低的光照强度或曝光时间重复该协议。一旦确定了充分的成像参数, 就不应在实验或校准之间改变绝对荧光比值。虽然 pHerry 的 pseudo-ratiometric 性质可以提供一种运动矫正的方法, 在准备容易运动或细胞直径的变化, pH 值_i的绝对量化要求的 pHerry SEpH 的全面系统的相关性通过尼日利亚/高 K⁺技术, mCherry 与 pH 值_i的比值。健康制剂中 pHerry 的校准应根据细胞类型和校准条件 (图 5D), 生成具有明显 pK_a的一致的校准曲线 (7.1-7.4)。对于 mCherry 聚集是不可避免的准备, 比例值的正常化, 使荧光比为1.0 对应于 pH_i 7.0 应产生类似的结果 (图 5E)。如果使用点校验和正常化曲线, 则可以为每个准备工作优化成像参数。 

校准的 ph 值_i跟踪可用于比较单元格类型之间的 ph 调节机制。在果蝇中的 GAL4/UAS 表达系统可以用来表达 pHerry 的主细胞和星状细胞的前 MT (图 6A)。ph 值_i调节可通过具有 NH₄Cl 脉冲的酸载电池进行评估, 并可量化 ph 值_i恢复的速率。这可以通过拟合指数函数, 以恢复阶段在不同的实验条件, 以提取衰变常数 (τ) 的细胞与更快速的 H⁺外排会显示更快速的恢复 (从而降低值τ)。基于这种分析, MT 的星状细胞似乎比主细胞具有更强的酸性挤压 (图 6B)。这一分析将举行, 只要休息 pH 值_i, 酸负荷的程度, 和缓冲能力是类似的实验组之间。但是, 当这些条件不满足时, 有必要考虑到许多单元格的胞 (β_i) 的内在缓冲能力本身是 pH 值的^35、37、38因此 ph 值_i在不同 ph 值_i处的变化速率可能不直接可比。在这种情况下, 指数曲线适合于在 NH₄Cl 脉冲之后的酸性挤出阶段, 并且以前确定的内部缓冲容量估计 (β_i) 可用于绘制酸挤压速率 (J_{H +}) 作为函数pH 值_i并确定酸挤压的补偿速率 (等式 3 & 4)。一旦在酸负荷和休息 pH 值的差异_i的解释, 它是明显的酸性挤出在主细胞的过渡段超过了星状细胞 (图 6C)。虽然引人注目, 这一分析并没有解决, 测量 pH 值_i是一个体积函数, 而在等离子膜上的酸挤压是膜表面积的功能。将 J_H除以曲面面积与感兴趣的单元格的体积比, 将在单位时间 (公式 5) 的单位表面积内生成酸当量的摩尔值, 从而允许对单元格大小和形态学的差异进行校正。在过渡段中, 大约两个主要的细胞组成了 MT 的周长, 因此单细胞可以被塑造成管子的一半 (内径24µm; 外径48µm; 高50µm)。星状细胞较小, 在 MT²的过渡段中往往是条形状的。准确定量的表面积和体积是困难的, 但甚至保守的近似的过渡星状细胞形状 (圆筒的高度50µm 和直径10µm) 表明一个表面积的体积比至少2x 的主细胞。考虑到这一点, 就会发现星状细胞的酸通量明显低于过渡主细胞, 实际上接近于初始段主细胞 (图 6D)。

图 4: 成人果蝇前氏管解剖。
A. 用2对精钳在施耐德的介质中进行前 MT 切除的示意图。"a. 小管" = 前 mt "p. 小管" = 后山. B。利用薄玻璃棒回收和安装萃取 MTs 的过程。C. 将所提取的 MTs 的全长粘附到幻灯片上进行成像和生理评估的过程。D. 具有代表性的 widefield 图像的 SEpH (470/510 nm 前/em) 和 mCherry (556/630 nm 前/em) 组件的无人驾驶 pHerry驱动的capaR-GAL4描绘健康前 mts, 前 mts 受损的灌注不足,错误后山. 注意, 健康的前 mts 显示一个清晰的扩张盲段, 一个收缩的过渡段, 在由capaR-GAL4驱动的情况下,无人 pHerry的表达相对增加, 而远端主段.损坏的 MTs 显示 mCherry 荧光的明显聚合体, 没有相应的 SEpH 荧光。后 MTs 直径均匀, 无形态分明的段。缩放栏 = 50 µm. 请单击此处查看此图的较大版本.

图 5: 氏小管 pHerry 的验证和校准。
A. 代表 widefield 图像的 SEpH (470/510 nm 前/em) 和 mCherry (556/630 nm 前/em) 组件的无人驾驶 pHerry驱动的capaR-GAL4描绘健康前 MTs. "ROI" 标记感兴趣的区域。"BG" 标记的背景区域的兴趣, 随后减去从信号 ROI 在同一渠道。缩放条 = 50 µm. B。在二十年代 40 mM NH₄Cl 脉冲的响应中, pHerry 的 SEpH 和 mCherry 信号的相对荧光变化。请注意, mCherry 信号是稳定的, 而 SEpH 信号显示一个特征增加在脉冲 (指示碱化,即增加 pH 值_i) 和急剧减少后冲洗 (指示酸化,即降低 pH 值_i)。C. pHerry (SEpH/mCherry) 的荧光比从 B 中的数据计算出, 在校准战略 (10 µM 尼日利亚, 130 毫米 K⁺, pH 7.4 和 9.0) 后的30分钟孵化的额外数据。D. 从绝对 pHerry 比 (SEpH/mCherry) 中构建的校准曲线, 作为强制 ph 值_i的函数, 在接触校准战略时, 将其缓冲为八的酸碱度之一。灰色圈子是各自的价值形式8准备。黑色方块和条形均为±SD. 曲线为玻尔兹曼拟合。E. 相同的数据, 如在 D 正常化, 荧光比在 pH 值7.0 是1.0。曲线被修改 sigmoidal 曲线拟合 (请参见步骤 7.4,公式 1)。请单击此处查看此图的较大版本.

图 6: 氏小管上皮中酸性挤压的定量。
A. Widefield 图像的 SEpH 荧光 (从 pHerry) 在前 mt 的主细胞 (左, 由capaR-GAL4驱动程序) 和星状细胞的前 mt (右, 由c724-GAL4驱动)。注意, 星状细胞在初始段是条形状的, 在过渡段中是可变的, 在主段显示不同的细胞投射。缩放条 = 100 µm. B。校准 pH 值_i对二十年代 40 mM NH₄Cl 脉冲的响应在感兴趣的区域中表示为 a (过渡段的主单元格、初始段的主单元格和过渡段的星状细胞)。虚线曲线表示单指数拟合, 适用于在 NH₄Cl 退出后的酸回收阶段, 并从中推导出衰变常数 (τ) 值。C. 酸性挤出率 (J_{H +}) 绘制为函数 pH 值_i从 B 中看到的指数拟合。有关 J_H计算 (公式 3), 请参见步骤8.3.1。虚线曲线是指数拟合应用于每个数据地块内的重叠 pH 值_i表示的灰色框。D. 在 B 和等式 5中所看到的指数拟合中, 以函数 pH 值_i派生的酸性焊剂。虚线曲线是指数拟合应用于每个数据地块内的重叠 pH 值_i表示的灰色框。请单击此处查看此图的较大版本.

表 1: 实验飞行解决方案。
战略溶液在室温下制备, pH 值由盐酸和氢氧化钠滴定确定。校准解决方案是滴定与 HCl 和 NMDG。校准溶液的缓冲根据所需 ph 值 [2-(n-吗) 磺酸 (MES) 而变化, ph 值 = 4.0-6.0; 4-(2-羟基乙基)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) 为 ph 值 = 6.5-7.5;n-[三 (羟甲基) 甲基]-3-aminopropanesulfonic 酸 (丝锥), pH 值 = 8.0-9.0]。所有的价值在 mM, 除了 pH 值 (单位) 和渗透 (摩尔/千克)。在使用前, 在10µM 的最终浓度的校准溶液中加入了亚砜尼日利亚的库存。

表 2: 已发表的胞浆 GEpHIs
激发极大值、最大发射量和表观 pK_a数值是近似的, 并且可以根据表达式系统、成像技术和校准方法的不同而有所不同。电影 = 荧光寿命成像显微镜。近红外线。

在果蝇mts 中, pH 值_i的量化成功与否完全取决于提取的 mts 的运行状况以及安装和剥离的质量 (图 A - C)。因此, 仔细处理组织的描述是势在必行的。新涂在 PLL 上的幻灯片实质上有助于 MT 的安装, 因为它们比以前暴露在溶液中的幻灯片更容易粘合。小心安装也有助于识别不同的 MT 段 (图 D)。健康 MTs 分别通过减少 mCherry 聚合和产生更一致的酸性挤出定量来促进 pHerry 的校准和功能评估。在某些情况下, 避免 mCherry 聚集是不可能的, 因为实验条件可能天生损害 MT 上皮细胞或产生显着的表达的荧光记者。在这些情况下, pseudo-ratiometric 校准正常化, 使荧光比1.0 对应于 pH 值_i 7.0, 点校准将允许量化 (图 E)。在进行点校准时, 应注意避免将成像和灌注系统的永久元件暴露给尼日利亚, 因为载体将粘附在玻璃和塑料上。即使 pseudo-ratiometric 校准是不可能的情况下, 实验操作诱导细胞损伤在实验中,即这种损害将导致逐步明显增加的 mCherry 荧光整个实验。在这些后来的情况下, SEpH 荧光信号可以使用正常化校准曲线和点校准, 警告说, 成像将不再正确的运动文物和焦点转移。

与荧光染料对 pH 值_i的量化相比, GEpHIs 具有几个普遍的局限性。染料的保留可以作为一个指标的膜完整性和细胞健康³⁹, 但没有等效的化验可用于 GEpHIs 使用。因此, 如果预测细胞损伤会导致结果混淆, 则必须通过独立的方法来监测制剂的健康状况。GEpHIs 可能允许成像从微扰的在体内的准备, 但组织完整性固有的限制实验操作, 并可以使点校准不可能。使用 pHerry 和其他胞浆双荧光 ph 指标 (如 ClopHensor⁴⁰) 的另一个固有限制是, 两个荧光的趋势是独立地改变它们的荧光, 而 ph 值是_i.RFP 聚合工件是这一限制的最重要的表现形式, 但量化也可能被一个或两个荧光的漂白所破坏。因此, 成像协议的调整, 以尽量减少漂白, 这可能导致长期曝光时间和获取率 < 0.2 赫兹. 长时间曝光将无法报告快速 pH 值_i班次。SEpH 荧光显示线性相关 ph 值_i从 ph 值 6.8-7.8 在大多数准备, 但这些测量的准确性取决于尼日利亚/高 K⁺技术的准确性。尼日利亚作为一个 k⁺/小时⁺载体和适当的校准依赖于均衡胞外 [k⁺] 与细胞内 [k⁺]。对所有实验系统而言, 对胞内 [K⁺] 的估计不可用或容易获得。ph 值_i的准确度只会与细胞内 [K⁺] 的估计一样可靠, 尽管 ph 值的相对变化率_i将是一致的。鉴于此限制和 ph 值_i与胞内 [H⁺] 的倒数对数关系, 最好在 ph 值_i、酸性挤出速率 (J_{H +}、图 6C) 中报告数据的变化率酸通量 (图 6D), 而不是 pH 值在_i中的绝对变化。数据的分析作为酸通量有修正的增加的好处在表面的区别是到容量比率在细胞类型之间。

在解释本协议中描述的成人飞 MT 准备数据时, 必须注意一些警告。初始、过渡和主段的形态学区分很可能简化了 MTs²中存在的函数和遗传域的真正多样性。此外, 虽然该协议的目的是检测侧酸转运体的功能, 它是可能的顶端运输可以影响 pH 值_i的测量以及。在安装 MTs 时密封输尿管 (步骤 5.9) 确保解决方案交换主要发生在侧表面, 但离子的准细胞和顶端移动可能仍然影响 pH 值_i , 因为侧传输最终会改变流明/胞浆离子梯度的细胞质侧。绝对分离的顶端和侧功能可以通过独立灌注的腔和侧表面的 MT, 但这种方法是实质上更严格的技术要求, 因为他们需要微插管⁴¹.

GEpHIs 目前的许多优势比传统的方法测量 pH 值_i,和这些优势被放大时结合的遗传可塑性和低成本的果蝇MT 制备。pH 值_i在历史上依赖荧光染料, 如 (2 ', 7 '-双 (2-乙)-5-(和-6)-羧基 (BCECF)²²或复杂的电生理评估通过离子选择电极^{20 ,21}。由于 pHerry 是基因编码的, 它可以用特定的促进剂在特定的细胞群中表达 (如在 MT 的主要细胞和星状细胞中所示),图 6), 并适于在任何受转基因的组织中使用,转染或病毒介导的感染。染料是有限的个别准备和潜在的复杂的应用协议, 不传达细胞特异性的异构组织。离子选择电极需要专门的设备制造和测量, 而 pHerry 只需要 widefield epifluorescent 显微镜与传统的 GFP 和 RFP 过滤器集。染料和电极的使用需要物理和光学接触的利益组织, 而 GEpHIs 可以监测新鲜提取的组织和随着时间的推移在体内。在评估 ph 值_i调节的细胞生理学时, 在完整的准备工作中进行活体成像的机会尤其值得关注, 因为没有其他技术允许在内源缓冲的情况下量化 ph 值_i机制.

果蝇成虫 MT 的制备为那些对细胞 pH 调节和离子传输感兴趣的人提供了许多诱人的特性。果蝇畜牧业是廉价的, 而诸如基因编码生物传感器结构和 rna 干扰表达插入等工具可以从各种股票中心 (印第安纳大学的布卢明顿果蝇股票中心) 随时获得;维也纳果蝇研究中心)。果蝇MTs 是由一层极化上皮细胞组成, 使之成为研究 transepithelial 离子转运的理想方法。侧运输可以很容易地检测 (如此处所示), 但对顶端和侧离子运动的全面评估可能与微插管⁴¹。此外, 器官功能检测, 如拉姆齐分泌物化验¹⁷和腔钙草酸盐沉积¹⁸是良好和允许相关的上皮细胞生理学模型的流体分泌和肾结石, 分别。虽然这些功能为强健的分析提供了机会, 但低成本和广泛的 epifluorescent 显微镜使果蝇MT 模型成为教学实验室中细胞和全身生理学示范的理想选择。

掌握这些方法允许量化的 pH_i调节由侧 H⁺通量在成人果蝇MTs, 一个可访问的, 但稳健的模型 transepithelial 离子运输。使用 GEpHIs, 如 pHerry 可以很容易地适应评估 pH_i调节其他无脊椎动物细胞类型, 培养哺乳动物细胞, 和体内的准备。新的 GEpHIs 的发展可能会遵循基因编码的钙指标, 新的世代跨越可见光谱和解决当前的限制, 如聚合工件^{30,42,43,44,45,46,47,48,49}. GEpHIs 已被广泛应用于报告线粒体基质 pH 值^50、51和亚细胞靶向策略存在, 将生物传感器本地化为内质网⁵², 核⁵³, 突触囊泡^12,43, 胞浆⁵⁴和细胞等离子膜的外部表面⁵⁵ (见表 2为已发布试剂的列表)。随着这些工具的提供, 他们将允许细胞 pH 调节与细胞生理学的其他方面的垂直整合, 如 Ca^{2 +}处理和细胞内信号, 和整个器官功能横跨各种脊椎动物和无脊椎动物的准备。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了 NIH DK092408 和 DK100227 对生产商的支持. AJR 得到了 T32-DK007013 的支持。作者希望感谢 Dr. 科尔尼 CapaR-GAL4 和 c724-GAL4 的果蝇股票。我们还感谢雅各布 b. 安德森协助维持实验飞行十字架。