蛍光遺伝子にコードされた pH インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 pH

細胞のイオン輸送は細胞内 pH モニタリングによってしばしば評価される(pH_私)。遺伝子 Encoded pH 指示薬(GEpHIs)は、そのまま細胞内 pH の光学的定量化を提供します。このプロトコルは細胞前のヴィヴォライブ イメージング pHerry とキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の細胞内 pH の定量化の詳細については、擬似レシオ メトリック遺伝子にエンコードされた pH インジケーター。

上皮膜イオン輸送は本質的な細胞の電気化学勾配の維持と同様、全身のイオンの恒常性に不可欠です。多くのイオン輸送体 (pH_私) 細胞内 pH の影響を受けて、トランスポーター活性を評価するための便利なツールは、このように pH は_私を監視します。モダンな遺伝子にエンコードされた pH-指標 (GEpHIs) は細胞および細胞内の規模で pH_私そのままなセルの光学的定量化を提供します。このプロトコルは細胞 pH_私の規制のキイロショウジョウバエのマルピギー氏管 (MTs) で前のヴィヴォライブ イメージングによる pHerry、pK_{で擬似レシオ メトリック GEpHI リアルタイム定量化をについて説明します、}細胞質の pH 変化を追跡に適しています。抽出された大人のフライ MTs は単一細胞層上皮の形態学的、機能的に独立したセクションで構成され、上皮の輸送の調査のためのアクセス可能で、遺伝的に扱いやすいモデルとして利用できます。GEpHIs は、従来の pH に敏感な蛍光染料とイオン選択性電極上のいくつかの利点を提供しています。GEpHIs 適切な促進者の要素が使用異なる細胞集団にラベルを付けることができます。この方、前のヴィヴォ体内、および本質的に不均一であるその場で準備に便利です。GEpHIs もそのままティッシュで繰り返される色素の治療や組織の外部化を必要とせず時間をかけて pH_iの定量化を許可します。現在の GEpHIs の主な欠点は、組織の損傷の応答のゾル性細胞質包有物の集約し、過剰発現を構築する傾向です。抽出されたフライ MTs の機能的に異なるプリンシパルと星状細胞に基底プロトン (H⁺) 輸送の評価を通じて、この議定書では、これらの欠点、彼らのソリューション、および GEpHIs の固有の利点を示した。技術と説明する分析が容易に適応できる幅広い脊椎動物と無脊椎動物の準備と特定のトランスポーターを介してイオン流束の複雑な測定の演習を教えるからアッセイの洗練されたことができます。

このプロトコルの目的は、遺伝子にコードされた pH インジケーター (GEpHI) を用いた細胞内 pH (pH_i) の定量化と基底モデル昆虫 (+ H⁺輸送を評価するためのこのメソッドの使用方法を示すキイロショウジョウバエ) 腎構造のマルピギー氏管 (MT)。MTs は、ショウジョウバエの排泄器官として、いくつかのキーの点¹に哺乳類のネフロンに機能的に似ています。MTs は、胸郭、ハエの腹部の (前部と後部) の尿細管の 2 組として配置されます。各 MT の単一細胞上皮管が根尖を明確なの代謝活性の主細胞から成る (内腔) 介在の星状細胞と同様、基底 (hemocoel) 極性と。発達個別のセグメント、特に初期拡張尿管²に結合分泌の主要なセグメント、経過セグメントは、セグメントおよび形態学的、機能的には、3 前方 MTs が構成されます。携帯電話のスケールで内腔の上皮細胞のイオン輸送、頂端膜 V-atpase³アルカリ金属/H⁺交換と基底 Na⁺K⁺で実現-atp アーゼの⁴、チャンネル⁵、Na⁺は、内向き整流性 K⁺ -Cl⁻/HCO₃⁻交換 (NDAE1)⁶、および Na⁺K⁺を駆動-2 Cl⁻共輸送 (NKCC;Ncc69)⁷、星状細胞仲介 Cl^- 、水輸送^8,9。この複雑なアクセス可能な生理学的システムは、ショウジョウバエの遺伝学的および行動の多様なツールセットと組み合わせた場合の内因性イオン伝導機構の調査のための優秀な機会を提供します。

このプロトコルのための理論的根拠は動作し、他のモデルのシステム ツールのエクスポートの統合セルからの潜在性の上皮膜イオン輸送を研究するため遺伝子組み換え可鍛性システムを記述します。PHerry¹⁰の式、グリーンの pH に敏感な超黄道 pHluorin^11,12 (セフ) と赤の pH に依存しない mCherry¹³MTs での融合から派生した GEpHI を許可の H⁺輸送の定量化高 K⁺/nigericin 校正テクニック¹⁴を介して単一の mt 野細胞。多くのイオン輸送体は、H⁺同等を移動、細胞内 pH は_私の定量化はさまざまなトランスポーターを介してイオン移動の関数表現として機能します。ショウジョウバエMT モデル システムはまた組織特異遺伝子¹⁵と細胞イメージング全体オルガン試金¹⁷と組み合わせて使用することができますが、RNA 干渉 (RNAi)¹⁶式の強力な遺伝的ツールを提供しています^,18,分子から行動への垂直統合の堅牢なツールセットを作成する尿細管機能の¹⁹ 。これは対照的に他の多くのプロトコルに歴史的にそのような測定が複雑に依存している、上皮の生物学の評価とマイクロ郭清、洗練されたイオン選択性電極^20,21, を大変なの略します。高価な pH 感受性色素を²²制限荷重要件と異種組織の細胞特異性悪い。GEpHIs は、広く pH_私携帯型²³の様々 な測定に使用されています。初期の作品は固有 pH 感受性の緑色蛍光タンパク質 (GFP) pH_私培養上皮細胞²⁴を監視するを悪用されるが、過去 20 年を見た使用ニューロンで²⁵、グリア²⁶、菌類^{27 GEpHIs}、植物細胞²⁸。GAL4/UA 式システム¹⁵とショウジョウバエMT の生理ユーザー補助の遺伝的構造の細胞ターゲットの可能性の組み合わせはこの pH_{の調査のための理想的な準備をする私}規制と上皮膜イオン輸送。

pH_私規制は何十年も研究されている、生活に不可欠です。MT の準備では、pH_私の調節の生理学を教えるが、また実行する堅牢なモデル洗練された pH_i規制前のヴィヴォとin vivoの調査を提供しています。このプロトコルはショウジョウバエNH₄Cl パルス酸法²¹の読み込みを使用して MT の上皮細胞の基底膜で H⁺運動の定量化をについて説明しますが、pH 指示薬としては遺伝子エンコードすると、任意の影響を受けやすい遺伝子導入とライブ イメージングの準備にこれらのメソッドとその理論的枠組みを適用できます。

このプロトコルのすべてのステップはメイヨー クリニック (ロチェスター、ミネソタ) の動物の使用に関するガイドラインを遵守します。

1. 飼育をフライします。

1. 昇給が飛んできて、標準飼育²⁹によると交差するセット。
   注: GAL4/UAS システムによって蛍光レポーター式は温度に比例して、発現レベルを変更するため飼育温度を調整できます。この状態は、pHerry^{10などコンストラクトの赤色けい光たんぱく質 (RFP) 融合する GFP を使用も増加のゾル性細胞質と核の集計に関連付けられても高発現レベルは、しばしばより良い信号対雑音比につながる 30,31}。実行することによって定量化はまだ可能な集約を避けられない場合 pH_私7.0 に対応する蛍光比 1.0 のような各実験と正規化データの校正をポイント (ステップ 7.4 を参照してください以下のキャリブレーションに関する注意)。
2. ホモUA pHerry¹⁰処女女性とホモc724 GAL4ホモ画像を許可するUA pHerry処女女性²男性ホモcapaR GAL4³²男性の交差に設定します。pH_私主細胞と、MT の星状細胞のそれぞれ。食品の 28 ° C でチームメイトに残す新鮮なバイアルに 3 GAL4 男性と UA pHerry 女性 6 名を配置します。
   注: 幼虫は 4 d 以内に明らかにする必要があります、10 日目の周り eclose を大人が始まります。
3. 羽化時にメスの成虫を収集し、脇に 28 ° C で 10 d の時代へ
   注: 実験のタイミングは、生きている細胞内の pH イメージングに関連付けられる (ラムゼイ分泌の試金^17,19) などの任意の制限行動アッセイに対応する調整することができます。男性のハエを使用できますが、女性から尿細管より大きくより強力です。

2. ポリ L リジン スライドの準備。

1. 標準 75 × 25 mm スライドの上のまわりの疎水性 PAP ペンで 40 × 20 mm の境界線を描画して、乾燥した使用大きい coverslips で 15 分スライドはイメージング光学系と互換性がない場合におきます。
2. 各スライドに 0.01% ポリ L リジン (PLL) の原液 2 mL を転送し、室温 1 時間脇
3. ピペットと過剰な PLL を削除します。将来使用するため 50 mL コニカル バイアルでソリューションを保存します。4 ° C でのストア
4. 真空ラインに残った溶液を吸引します。スライドにソリューションが残っていないことを確認するスライド全体の表面に真空ラインを実行します。
5. 使用する前に RT でさらに 1 時間のためにスライドを設定します。標準スライド本で 1 ヶ月常温乾燥のスライドを保存します。

3. 解剖皿とガラス棒の準備

1. エラストマー、奥行きの 5 mm ミックス使い捨てピペット チップとを生成する RT でシャーレ 35 x 10 mm ポリスチレンで基本の 4.5 mL にエラストマー硬化剤 0.5 mL を追加します。O/N 室温を治すためにエラストマーを許可します。
   注: エラストマーは、はっきりと泡の無料する必要があります。バブルの清算はこと注入後 10-15 分のための真空瓶にエラストマー板を保つことによって促進されます。
2. 手の間 5 mm 径のガラス棒を押しながら離れての両端を引っ張りながら点灯ブンゼン バーナーでロッドの中心を溶かします。ガラスと溶ける引いてすぐに薄い (0.1 mm) とテーパー シャフト (図 1) を生産します。
   注: シャンクに 45 ° の角度の尿細管の処理に便利です。これはシャンクを引く (図 1を参照)、1 つの手を下げることによって達成することができます。
3. 炭素鋼片刃かみそりの刃の鈍側と真ん中に薄いシャフトを破る。休憩がきれいなことを確認に切り裂くスコープ下ロッドの薄い端を検査します。

図 1: キイロショウジョウバエマルピギー管を処理するためガラス棒を製造します。
A ~ E。冷暖房山地矢印を処理に適したテーパーを生産し、角度にガラス棒を引いてのプロセスは適用される力の方向と大きさを示します。F. 適切に加工ガラス ツールの写真。スケール バー = 10 mmこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

4. ソリューションおよび灌流システムの準備

注: 灌流システムは、メーカーによって異なります。このプロトコルは、入力フロー率調整器と真空駆動の流出がここで説明されているように MTs を任意の灌流システムで動作するように合わせることができる取付方法重力供給 8 チャンネル オープン タンクに基づいています。

1. 以下のソリューションを準備します。
   1. 因数のシュナイダーの媒体 (50 mL コニカル バイアルに 40 mL) と 4 ° C でストア
   2. ソリューションを準備 (すなわち昆虫 Phosphate-Buffered 生理食塩水 (iPBS) および NH₄Cl iPBS) 常温、表 1に基づいて、必要に応じて)。実験の日に使用する前に RT に暖かいソリューション。
      注: iPBS と iPBS 40 mM NH₄Cl を大量 (1 L 以上) の準備、4 ° C で保存
   3. PH で 500 mL の容積 8 の校正ソリューションを準備表 1と 4 ° C でストアに示されているように、5.0、6.0、6.5、7.0、7.3、7.6、8.0 および 9.0 を =N-メチル-D-glucamine (NMDG) と塩酸を滴定法による各溶液の pH を調整します。
   4. 実験の日、RT に校正ソリューションの 5 mL 因数を暖かく、10 μ M の最終濃度を生成するストック nigericin ソリューション (ジメチルスルホキシド (DMSO) 20 mM) を追加します。
      注意: は、手袋で nigericin を処理します。使い捨てとして nigericin と接触するすべての機器を扱います。Nigericin は、機器が再利用される場合、生物学的製剤を妥協は、ガラスとプラスチックに残ります。
2. 灌流システム:
   1. プライム ddH₂O すべて貯水池 (図 2) を記入することによって灌流システム。フロー速度レギュレータを埋めるために近位のすべての行を許可する時に 1 つのチャネルを開きます。
      注: 場合によっては、失速のチャネルを開き、貯水池からドライブ流れにプランジャーを使用してライン内の空気をオフにする必要があります。
   2. 2 チャンネルを開き、ddH₂O を排出するを許可します。貯水池は空に近いが、リザーバー、最初 iPBS と NH₄Cl パルス iPBS 2 番目の貯水池。最大流量レート制御と流量を設定し、遠行を 1 分間流する各ソリューションを許可する (図 2) の流れを停止します。
   3. イメージング顕微鏡ステージに「救いの手」クランプをはんだ付けの 2 番目の位置を設定します。イメージング プラットフォームの各側に 1 つのクランプを配置します。
   4. 慎重に熱毛細管ガラスの部分の遠位 0.5 インチ (内径 1.5 mm、外径 0.86 mm、長さ 100 mm) ブンゼン バーナーの上。45 ° ベンドを作成するには、重力によって曲げに遠位端ができ、目的の角度が達成されれば、炎からガラスを削除します。毛細管ガラスの 2 番目の部分と、このプロセスを繰り返します。
   5. それぞれの流れと真空接続流出線曲がったガラス管を挿入し、「救いの手」でそれらをマウント (図 3) 顕微鏡のイメージングの段階でそれらを整列します。

図 2: 灌流システムと構成をイメージングします。
同時を介して MT 基底トランスポート機能の生理学的評価のために必要なコンポーネントは、蛍光イメージングかつ迅速なソリューションの交換を住んでいます。示されているガス行は省略可能で、HCO₃^-輸送の評価実験の拡張を許可します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: NH₄Cl パルス灌流装置のフロー図の実験します。
矢印には、フロー パス、バルブ切り替えポイントが描かれています。ソリューションは、貯水池から標本に重力流による移動し、真空吸引による廃棄物のフラスコに試料室から描画します。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

5. 大人のショウジョウバエ前方のマルピギー氏管の解剖。

1. 解剖皿を収集セクション 3 からガラス棒、セクション 2 から PLL コート スライド、接着剤の灌流も分配器、真空グリース、フィルム シールの 4 x 2"ストリップを引っ張って、#5 の 2 ペア微細鉗子と冷たいシュナイダーの中の RT iPBS 40 mL 因数と。
2. シーリング テープの真空グリースを普及し、油でコートの下にテープに接着剤灌流もディバイダーを押します。接着剤の灌流もディバイダーをはがし、グリース側ダウン PLL コート スライド上に配置。個々 の標本井戸疎水性グリースのトレースを残して血流よく仕切りを削除します。
3. 場所 200 μ L グリース包囲で RT iPBS の PLL コート スライドと株分け業の下でスライドを移動します。
4. 空飛ぶ場所UA pHerry/capaR GAL4ハエはバイアルし、10 分間氷の上それらの麻酔。
   メモ: この CO₂とは異なり、麻酔の方法は、ハエはステータス退避を行いませんことを確認します。
5. 解離性の皿に冷たいシュナイダーの媒体を注ぎし、解離万国実体写真下皿に 1 つの麻酔をかけられた女性フライを転送する微細鉗子を使用します。
6. 鉗子のセットを持つ胸部で、フライを保持し、他を使用してやさしく腹部の後部をグリップします。要するに、鉗子を使用してフライ、意図的な運動の後方に引いて開きます。腸が目に見えると、遠位端をつかんで、基になる tracheoles から離れてを繰り返し、簡単なタグボートの体腸を引いて腸と MTs を無料.
   注: 前部と後部の MTs 表示されます中腸と後腸、尿管を通してのジャンクションを満たす彼ら。彼らは腸を取り囲むように後方の細管をする自由意志の可能性が高いに MTs の最初のペア。これらをすることができます (図 4 a) を無視します。
7. MTs の 2 番目のセットが腹部の無料微細鉗子で尿管の前方の MTs をオフにピンチします。これは腸から前方の MTs を分離し、尿管を閉じます。
8. 細管はどちら側に落ちるように尿管の下でロッドをスライドで引っ張られたガラス棒で無料前方 MTs を拾います。ソリューションからまっすぐに MTs を持ち上げます。
9. MTs および尿管ロッドの裏側に付着した、まっすぐスライドに尿管を下げるようにガラス棒をオンにします。尿管を貼付し、(図 4 b) スライド ガラスに尿管を押し込んで、MTs の遠位端をシールします。必要以上の MTs を操作できません。MTs は、スライドに固定する尿管とソリューションで浮上する必要があります。
10. 軽くスライド表面で各々 の細管を掃引するのにガラス棒の良い終わりを使用します。管を粉砕避けるために、尿細管は、近位、PLL コート スライド (図 4) の表面に各管の全長をアタッチするに遠位に移動の上にロッドをスライド スライドに対してロッドを引き締めます。
11. スライド マウントされている尿細管にも液体で満たされた小を形成するために接着剤の灌流も分配器を配置します。
12. 顕微鏡ステージ上の試料を配置します。流入を置き、それぞれ入口と出口開口も、血流の毛細血管を流出します。
    注: オープン灌流チャンバーが必要な場合も仕切りが左できます。この場合も画像処理の反対側に管の流入、流出を配置できます。

6. イメージング プロトコルと尿細管健康の検証

メモ: このプロトコルは GFP (セフ) と RFP (mCherry) フィルター セット逆広視野 epifluorescent 顕微鏡で実行されます (470/40 nm 励起 (ex)、515 nm longpass 放出 (em)、ex、500 nm の二色性と 546/10 nm、590 nm longpass em、565 nm 二色性)、10 X/0.45 空気目的、ライブ イメージ キャプチャ、およびイメージ投射ソフトウェア単色カメラ。プロトコルは任意の直立に適応することができますか、または倒立顕微鏡を GFP と RFP 光学系と画像集録ソフトウェア、切り替える自動フィルターで最適な露出時間、光の強さとビニング パラメーター異なります。すべての分析、蛍光強度は、後の投資収益率を使用して各チャネルの背景差分が含まれていない蛍光信号の投資収益率に隣接する利益率 (ROI) の地域の平均のピクセルの輝度を分析して必要があります。

1. 顕微鏡、光源とイメージング システムを入れます。
2. 開くには、イメージング ソフトウェアが関連付けられています。
3. 接眼レンズに目を通すし、MT のルーメンが透過光の下で明確に表示されるまで、手動でフォーカスを調整します。
4. 画像解析ソフトで取得する」タブをクリックし、「アクイジション ・ モード」セクションで「ビン」プルダウン ・ メニューで「2 x 2」を選択します。
5. 照明光を減らすし、退色を最小限に抑えるために光路に 5% 中性密度フィルターを挿入します。
6. 「チャンネル」メニューで GFP (セフ) チャンネルのカメラを介して蛍光信号を観察する「ライブ」をクリックします。
7. 輝度ヒストグラムの最も明るいピクセル値が最大値の約 40% をされるよう、露光時間を設定する「時間」スライダーを調整し照明を停止するには、"停止"をクリックしますします。
8. RFP (mCherry) の手順 6.6 6.7 チャネルし、前歯の MT の拡張の最初のセグメントの存在を確認し、ゾル性細胞質 mCherry の不在を集計 (組織の損傷や過剰発現を示すもの) を繰り返します (図 4)。
   注: 拡張セグメントは、尿細管の最も近位のセグメントは、このセグメントの内部ルーメンの直径は 〜 20 μ m 以上隣接する遷移セグメントの明らかでなければなりません。2 x 2 ピクセルビニング通常で十分ですが、必要な照度をさらに減らすために増やすことができます。典型的な露光時間は 150 & 800 ms/チャンネルの間です。退色を最小限に抑えるため可能な限り小さな光として使用します。退色を最小限に抑えることは、2 つの同時ことができます漂白しない独立して、したがって任意の比校正を無効としてデュアル fluorophore 指標 pHerry などの使用に不可欠です。
9. 「時系列」チェック ボックスをクリックしてタイムラプス イメージング プロトコル有効にします。
10. 期間を調整」「10 分に、"間隔"スライダー"時系列"セクションのプルダウン メニューで 0 に最大画像集録レートと全体的なキャプチャ時間を設定します。0.2 Hz の合計レート通常十分です。
11. GFP (セフ) と「チャンネル」セクションに RFP (mCherry)] の両方をチェックしてください。
12. 適切なバルブ コント ローラーをアクティブにして灌流システムの iPBS 行を開き、「実験を開始」をクリックして画像プロトコルを開始1 分後、NH₄20 Cl パルス ソリューションに切り替える適切なバルブを開閉、iPBS ラインの s によって NH₄Cl ラインを終了および再開 iPBS バルブ iPBS に戻る。灌流システムを停止する前に完了する完全なイメージング プロトコルを許可します。
    注: 時系列解析、安定した mCherry と NH₄Cl の存在下で増加、ウォッシュに消光し徐々 に回復セフ信号が表示されます。
13. 2 点校正を実行します。
    1. 基になるスライドから剥離しても分配器、よくイメージングから灌流毛細血管とクランプを取り外します。
    2. 200 μ L ピペットとイメージングに 200 μ L 校正 iPBS (pH 7.4 では、10 μ M nigericin) を適用します。ピペット、イメージングからソリューションを削除し、校正溶液 200 μ L 別に置き換えます。完全なソリューションの交換のため 4 回この手順を繰り返します。
    3. イメージングの前に 30 分の校正ソリューションの準備を孵化させなさい。6.6 6.11 の手順で同じパラメーターを使用してイメージング プロトコルを繰り返し、イメージのわずか 1 分の変更をキャプチャします。
       注: 灌流システムと毛細血管はこの手順で不要し、イメージングに接続されていない必要があります nigericin に毛細血管をさらすことを避けるためにも。
    4. 200 μ L ピペットとイメージングに 200 μ L 校正 iPBS (pH 9.0、10 μ M nigericin) を追加します。ピペット、イメージングからソリューションを削除し、校正溶液 200 μ L 別に置き換えます。完全なソリューションの交換のため 4 回この手順を繰り返します。
    5. イメージングの前に 10 分第 2 校正ソリューションの準備を孵化させなさい。6.13.3 のステップのように撮像プロトコルを繰り返します。
    6. 「投資収益率を意味する」をクリックしてスクロールが輝度のヒストグラムの値は報告されませんを観察しながら「フレーム」スライダーで画像のスタックによっていずれかチャンネル ピクセルが飽和してないいることを確認する画像解析ソフトウェアでキャプチャした画像スタックを確認最大検出値に達する。すべてのフレームは、最大検出可能な強度に達するピクセルを含む場合、露出時間や照射強度と繰り返しセクション 6 を減らします。
       注:ポイント校正が各準備で使用される、実験や校正間撮像パラメーターを変更しないことを確立される (手順 8.3 を参照してください)。
14. 蛍光強度や蛍光比 (セフ/mCherry) を時間の関数としてプロットする画像のスタックを分析します。
    1. 「投資収益率を意味する」をクリックし、パス変形ツールを選択します。山の ~ 50 μ m 長さをトレースする左クリックを押したままROI の描画を完了するを右クリックし、投資収益率 (図 5 a) 背景を定義する MT に隣接地に繰り返します。
    2. 「測定」の下で「平均強度」をクリックします。クリックして強度の値の表を作成「エクスポート > データ テーブル > 作成します。」
    3. 構成の歯車アイコンをクリックし、「時間」と「強度を意味します」を除くすべてのパラメーターの選択を解除新しく作成したデータ テーブルのタブを右クリックし、「名前を付けて保存」を選択、データを .csv ファイルとしてエクスポートします。
       注: 同様の測定が可能 ImageJ などの無料のソフトウェアを使用しています。
    4. スプレッドシートのテーブルを開き、"From Text"に続いて「データ」タブを選択してデータ テーブルをインポートします。
    5. スプレッドシートの機能を使用して、各時点でセフ信号強度からセフ バック グラウンド強度を減算します。MCherry 信号にこのプロセスを繰り返します。
    6. 時間とバック グラウンド補正強度データと、クリックを含む列を選択することによって時間の関数として各チャネルの強度をプロット「挿入 > 散布図 (グラフ) > 直線付き散布図」(図 5 b)。
    7. 各時点でセフ/mCherry 蛍光比を計算するのにスプレッドシート関数を使用します。
    8. 時間と比のデータと、クリックを含む列を選択することによって時間の関数としてプロット蛍光比「挿入 > 散布図 (グラフ) > 直線付き散布図」(図 5).

7. キイロショウジョウバエマルピギー管Ex Vivoで pHerry の校正。

1. 解剖、セクション 5 で説明されているように前方の MTs の新鮮なセットをマウントします。
2. 6.13.2 の手順で説明するように校正 iPBS (pH 7.4 では、10 μ M nigericin) の iPBS を交換します。30 分間インキュベートします。
3. MTs を見つける手順 6.1 6.11 でセフ/mCherry 画像のペアを収集しています。校正 iPBS 6.13.4 の手順で説明するよう 10 分を待ってから、もう一度画像の別の在庫とソリューションを交換してください。セフ/mCherry 比は、すべてのソリューションでイメージされているまで、このプロセスを繰り返します。PH 9.0 イメージを取得する最後の標本はほとんど高い pH から回復するようです。
4. セフの蛍光比 mCherry に 8 標本の校正から関数としてプロット課された pH は_私の 6.14.9 のステップで説明したよう。ボルツマン曲線方程式 1 (図 5) によると完全なキャリブレーション関数を取得するとキャリブレーション データに合います。データの整合性がない場合 pH_i 7.0 に対応する蛍光比 1.0 のような正規化検体からキャリブレーション セットをプロットし、(図 5 e) を再分析します。
   注意: 後者のプロセスが必要な場合個々 の実験必要があります独自の内部ポイント校正³³ (定量化手順 (手順 8.3) を参照してください)。
5. 式 1
   
   R = セフ/mCherry 比と₁、₂ x_o、およびdx継ぎ手パラメーター最小蛍光比、最大蛍光比、pKと幅を表す関数の曲線は、それぞれ。x_o = 見かけ上 pK_、 pHerry、7.1 と 7.4 細胞型と正確な校正条件に応じて変えることができるのです。

8. Ex Vivoマルピギー氏管上皮から基底酸押出の定量化。

1. 同時に細胞画像 pHerry を表現する星状細胞と pHerry を表現するプリンシパル。
   1. 、5 章で説明したようにUA pHerry/capaR GAL4飛ぶから前方の MTs を解剖がよくイメージングへ解離シュナイダーの中から MTs は転送しないでください。
   2. セクション 5 に記載されている手順を使用して同じ解剖皿のUA pHerry/c724 GAL4飛ぶから前方の MTs を分析します。
   3. 5.8 5.11 の手順の説明に従っても同じ画像に MTs の 2 セットを転送します。
      注: スライドまで MTs の腕の中を掃くとき配置UAS pHerry/c724 GAL4と互いに近くUA pHerry/capaR GAL4細管の MTs pHerry 発現のプリンシパルと星状細胞は同じフィールド (視覚化できますので図 6A)。
2. NH₄Cl プレパルス 6.12 の手順で説明されているように適用します。
   注: 一貫性のあるキャリブレーション (図 4 b) を達成できなかった、接着後校正 iPBS (pH 7.0, 10 μ M nigericin 30 分インキュベーション) の各実験の終わりに 7.0 に pH_iに設定点校正を実行します。灌流もディバイダーおよび灌流装置が削除されました。
3. 方程式 2 (必要に応じて絶対または標準化された比率を使用して) さまざまな MT の星状とプリンシパルのセルからのトレースを調整し、指数関数的減衰機能を使用を適用して NH₄Cl 撤退後回復フェーズの分析統計解析ソフトウェアと減衰定数 (τ) (図 6 b) に注意します。
   方程式 2
   
   R = セフ/mCherry 比と₁、₂ x_o、およびdx校正手順 7.4 (式 1) によって決定された継ぎ手パラメーター曲線は。
   1. PH_私私の pH と酸製剤³⁴間の読み込みを安静時のバリエーションの関数として酸押出率 (_{H +}J は、方程式 3を参照) を計算します。PH_私時間に関して各時間間隔での微分を計算するのに手順 8.3 で派生した指数関数を使用します。
      式 3
      
   2. (Β_i; 組み込みバッファー容量を計算します。式 4)細胞質の pH の 8.3.1 の手順で各間隔の開始から_私は以前文献に基づいて (方程式 4参照)。
      注:ショウジョウバエβ は_私の最も完全な特性から来る幼虫モーター神経ターミナル³⁵と mt 野細胞がない場合は他の利用可能なデータを保持するためにこれらのデータが想定される場合します。
      方程式 4
      
   3. J_{H +} (式 3) を決定する β (ステップ 8.3.2) から_{T と} dpH_私/dt (ステップ 8.3.1) からの積を計算します。
      メモ: このプロトコルで説明したよう、名目上炭酸無料ソリューションで炭酸由来の緩衝能力 (β_b) は仮定する 〜 0 mM。_私β と_βb、およびこうして β の合計ですバッファキャパシティ (β_T)_{私 =} HCO₃^-/CO₂³⁶の不在で β_T 。
   4. 6.14.9 のステップで説明したように各時間間隔の初めに pH は_私の関数として J_{H +}をプロットします。
   5. 指数関数的減衰関数を pH_私統計解析ソフトウェアを使用して重複するすべてのデータセットの部分に適用されます。セルと MT セグメント (図 6) の間の酸押出率を比較する結果の機能の変更の率を比較します。
      注意: カーブ フィットに使用する最も適切な関数可能性がありますいない常に単一指数。彼らはフィット感の良さを向上させるなら、他の機能を置き換えることができます。
   6. 酸を計算 (式 5参照) をフラックス pH_私セル サイズと形状の変化を考慮しての機能として。
      式 5
      
      注: セルの大きさが画像で直接測定したり近似。主細胞は次の次元を持つ中空管の半分として表現できる: 内径 24 μ m;外径 48 μ m;高さ 50 μ m 移行星状細胞は変数が、約 50 μ m の高さと 10 μ m の直径の円筒で表すことができます。以下の代表の結果の最後の段落を参照してください。
   7. 指数関数的減衰関数を pH_私統計解析ソフトウェアを使用して重複するすべてのデータセットの部分に適用されます。細胞と MT セグメント (図 6) と酸系フラックスを比較する結果の機能の変更の率を比較します。

健康な組織や前方の MTs を適切に識別、このプロトコルの成功に不可欠です。解剖時に注意が必要なく、直接タッチする MTs とだけハンドルに直接 MTs をグリップとして尿管によってそれらは (図 4 a- B) の破損に 。MTs はスライドにフラットを掃引、細管を可能な限り少し触れられなければならないし、これを回避余分な動きは単一細胞上皮層 (図 4) に損傷を与えます。正常解剖前方 MTs も上皮細胞と形態的に異なる尿細管セグメントの細胞質を赤と緑の蛍光分布が表示されます。不適切な血流によって尿細管損傷またはミスなしの対緑の集計と赤い蛍光性の集計が表示され、誤認後部 MTs が表示されます (図 4) 遠位尿管近位の盲目の端から制服の形態. 

PHerry の適切な機能を確認する必要がありますしかし生理学的評価として形態。適切な pH センサーを確認する最も適切な方法は、NH₄Cl パルスを適用することです。これらの条件で、緑のセフ信号が予想される pH の変化を報告しなければならない (pH_私NH₃としてパルス中の上昇が NH₄⁺ K⁺トランスポーターを通って入り、セル、パルスの間に漸進的な低下に入るとチャネル、および急激な酸性化および NH₄Cl 撤退²¹、赤 mCherry の信号は一定にしながら時に徐々 に回復 (図 5 a- B)。セフ信号の変化の大きさと細胞型、プロトコルと異なります、mCherry 信号はすべてのケースで安定したはずです。個々 の実験の間に mCherry 信号の変化を示す運動成果物またはセンサー集合体細胞の損傷のための進歩的な世代。後者は pH は_私の定量化を防止、回避する必要があります。NH₄Cl パルスの完了時に、2 点校正を行うことが重要だ (校正 iPBS、pH 7.4 と 9.0、10 μ M nigericin)、安静時 pH_私7.4 付近を確認し、現在の撮像パラメーターがの彩度をもたらさないことを確認するには蛍光蛍光 pH 9.0 (図 5) で最大化するとします。健康的な MTs; とプロトコルを繰り返す必要があります休憩 pH が 7.4 よりかなり低いの場合低い光強度または露光時間と飽和 pH 9.0 の場合は、プロトコルを繰り返す必要があります。十分な撮像パラメーターが決まったら、それら変更しないでください実験や校正の間絶対蛍光比を使用する場合。PH は_私の絶対定量に pHerry セフの完全体系的な関連付けが必要です pHerry の擬似レシオ メトリック自然セル径の変更などで準備運動しやすい動き補正の方法を提供できますが、/pH に_私nigericin/高 K⁺テクニックを通して mCherry の比率。健康な準備で pHerry の校正は、明白な pK_、携帯型・適合条件 (図 5) によって 7.1 7.4 と一貫した検量線になるはずです。準備が mCherry の集計は避け、比率値の正規化蛍光比 1.0 の pH に対応するような同様の結果 (図 5E) を得られる_私7.0 です。かどうか点校正と正規化曲線が使用されます、各準備のため撮像パラメーターを最適化できます。 

細胞のタイプ間の pH 調節機構を比較する校正 pH_私トレースを使用できます。ショウジョウバエの GAL4/UA 式システムは、前方の MT (図 6 a) 星状細胞とプリンシパルの pHerry を表現する使用できます。pH_私規制は、NH₄Cl パルスと pH_私回復率を定量化酸負荷セルによって評価できます。これは、異なる実験条件でより迅速な回復 (と τ のための低値) より迅速な H⁺流出とセルに表示されます、崩壊定数 (τ) を抽出する復旧フェーズに指数関数をフィッティングによって実現できます。この分析に基づき、MT の星状細胞は主細胞 (図 6 b) よりもより強力な酸押し出しが表示されます。この分析は、安静時の pH は_私、酸負荷と緩衝能の程度は実験グループ間で類似限り保持されます。ただし、これらの条件が満たされない場合は、アカウントの多くの細胞の細胞質 (β_i) の組み込みの緩衝能力は観察のため pH 依存性^35,37,38する必要はこのように pH_私変更異なる pH_iでのレートが直接比較できない場合があります。この場合において、指数曲線に合わせて酸押出速度 (J_{H +}) をプロットする関数としての使用をすることができます NH₄Cl パルスと以前に決定された組み込みバッファキャパシティ (β_i) 酸押出相次pH は_私の酸の押し出し (方程式 3 & 4) の補償率を判定するとします。酸の読み込みと pH は_私を休憩の違いが原因のそれは明らか一度経過セグメントの主細胞で酸の押出を上回る星状細胞 (図 6) のこと。ながら、説得力のある、この分析は扱いません測定 pH は_私はボリュームの機能膜を越えて酸押出は膜面積の関数。J_{H +}興味のセルの容積比表面積によって分割セルの大きさと形態の違いを補正できるように単位時間 (式 5)、単位表面積あたりの酸同等のモグラの値になります。約 2 つのプリンシパルのセルは経過のセグメントでの MT のまわりを構成する、従って単一セルは、管 (内径 24 μ m; 外径 48 μ m 高さ 50 μ m) の半分としてモデル化することができます。星状細胞はより小さく、バー状の MT²の経過のセグメントにする傾向があります。表面積および体積の正確な定量化は困難ですが、星状上皮の形状 (円柱高さ 50 μ m と 10 μ m の直径) の保守的な近似を示す表面積体積比の少なくとも 2 に主細胞の x。これを考慮して星状細胞酸系フラックスは大幅に移行の主細胞の下と最初のセグメント主細胞 (図 6) に実際に近づくことを明らかにします。

図 4: 大人のショウジョウバエ前方のマルピギー氏管の解剖。
A. 冷蔵シュナイダー中微細鉗子の 2 ペアと前方の MT 除去の模式図。「A. 細管」前方山」P. 細管」を = = 後部山B。取得し、細いガラス棒を使用して抽出した MTs をマウントするプロセス。C. プロセスの完全な長さを付着のイメージングおよび生理学的評価のためのスライドに MTs を抽出しました。D、セフの代表広視野画像 (470/510 nm ex/em) と mCherry (556/630 nm ex/em) UA pHerry駆動capaR GAL4を描いたによって健康な前方のコンポーネントが MTs、前方 MTs 損傷不十分な血流と。誤認後方山地注明確な拡張ブラインド初期セグメント、 UA pHerry capaR GAL4, と遠位メインによって駆動されるときの式が比較的増加収縮経過セグメントを健康な前方 MTs に表示セグメント。対応するセフ蛍光 mCherry 蛍光の MTs 表示顕著な集合体を破損していません。後部の MTs がない形態的に異なるセグメントの直径に統一されています。スケールバー = 50 μ m. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 検証とマルピギー氏管の pHerry の校正。
A。、セフの代表広視野画像 (470/510 nm ex/em) と mCherry (556/630 nm ex/em) コンポーネントUA pHerry capaR GAL4健康な前方山地"投資収益率"を描いたによって駆動のマーク信号関心領域。"BG"同じチャネルの信号の投資収益率を求めた後の関心の背景領域をマーク。スケールバー = 50 μ m. B.20 s 40 mM NH₄Cl パルス応答で pHerry のセフと mCherry の信号の相対的な蛍光の変化。セフ信号パルスの間に特徴的な増加が表示されます、mCherry 信号が安定しているに注意してください (アルカリを示すもの、すなわち増加 pH は_私)、[ウォッシュ アウト] (すなわち酸性を示す時に急激な減少低下した pH は_私)。C. pHerry (セフ/mCherry) の蛍光比は校正 iPBS (10 μ M nigericin、130 ミリメートル K⁺、pH 7.4 と 9.0) で 30 分インキュベート後 B の追加データ データから計算します。D. 絶対 pHerry 比から検量線 (セフ/mCherry) の機能は、校正 iPBS 8 の pH 値の 1 つにバッファーへの露出の間に pH は_私を課される。灰色の円は、個々 の値のフォーム 8 準備です。黒の正方形、バーが平均 ±SD。 曲線はボルツマン フィット。E. D と同じデータ正規化など pH 7.0 で蛍光比は 1.0。曲線は s 字型カーブ フィット (ステップ 7.4、方程式 1を参照) を変更します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6: 定量化のマルピギー氏管の上皮における酸性押出。
A. 前方の MT の主細胞 (pHerry) からセフ蛍光の広視野画像 (左、 capaR GAL4ドライバーによって駆動される) 動かされ、前方の山の星状細胞 (右、 c724 GAL4)。星状細胞はバー状の最初のセグメントは、経過のセグメント内の変数には、主なセグメントに異なる細胞突起を表示に注意してください。スケールバー = 100 μ m. B.PH_私変更 20 s 40 mM NH₄Cl (経過セグメント、最初のセグメントの主細胞および経過のセグメントの星状細胞のプリンシパルのセル) 内に示された関心領域のパルス応答を校正します。破線の曲線は、単一指数フィットは記載の減衰定数 (τ) 値の派生元となる Cl 撤退次の NH₄酸回収フェーズに適用を示します。C. 酸押出速度 (J_{H +}) プロットに由来する指数関数 pH_i収まる B に見られるよう手順 8.3.1 J_{H +}計算 (式 3) を参照してください。破線の曲線は、指数フィット pH_私グレーのボックスで示される重複の領域内の各データ プロットに適用です。D. 酸系フラックス プロットとして、指数から派生した機能 pH_i収まる B や方程式 5に見られる。破線の曲線は、指数フィット pH_私グレーのボックスで示される重複の領域内の各データ プロットに適用です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: 実験的フライ ソリューション。
iPBS ソリューションを用意しています部屋の温度と pH は、塩酸と水酸化ナトリウムの滴定によって設定されます。塩酸と NMDG で校正溶液を滴定します。校正ソリューションのバッファーが望ましい pH に基づいて変化させる [2-(N morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES)、pH 4.0 6.0; = 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、pH = 6.5-7.5。N-[トリス (ヒドロキシメチル) メチル]-3-aminopropanesulfonic 酸 (タップ)、pH = 8.0 9.0]。MM (単位なし) pH および浸透圧 (モル/kg) 以外のすべての値。DMSO のストックの nigericin は、使用の直前に 10 μ M の最終的な集中に校正ソリューションに追加されます。

表 2: 公開されているゾル性細胞質 GEpHIs のリスト
励起マキシマ、発光極大および明白な pKの値はおおよそ、式システム、イメージング、および校正方法によって異なります。FLIM 蛍光寿命イメージングを =。NIR 近赤外 =。

ショウジョウバエMTs で pH は_私の定量化の成功は健康抽出された MTs と取り付けと郭清 (図 A - C) の質によってまったく異なります。したがって、組織としての慎重な取り扱いは説明が不可欠です。新鮮な PLL でコーティング スライド大幅にソリューションにさらされて以前のスライド援助 MT マウントよりもはるかに多くの接着剤をする傾向にあります。注意取り付けは MT の明瞭な区分 (図 D) の識別にも役立ちます。健康的な MTs mCherry 集計を削減し、それぞれ酸押出のより一貫した多くの定量化を降伏によって pHerry と機能的アセスメントの校正を容易にします。いくつかのケースで mCherry 集計を避けることは不可能です、実験条件が本質的に MT 上皮を損傷したり、蛍光レポーターの重要な過剰発現を生成これらのケースで擬似レシオ メトリック校正正規化蛍光比 1.0 pH_私7.0 に対応、ポイント校正の定量化 (図 E) を許可するように。ガラスとプラスチックに固執する、イオノフォアとして nigericin にイメージングと灌流システムの永続的な要素の公開を避けるために点校正時に注意が必要があります。実験操作が、実験中に細胞損傷を引き起こすような状況でも擬似レシオ メトリック校正はできませんすなわちこの損傷は進歩的な見かけになります mCherry 蛍光性の増加その結果。これらの後の場合、セフ蛍光信号は正規化された検量線で使用することができ、イメージング、運動成果物の焦点シフト修正もはや警告の校正をポイントします。

GEpHIs では、pH は_私の定量化に蛍光染料と比較していくつかの一般的な制限を運ぶ。膜の整合性とセル健康³⁹、指標として色素保持を使用できますが、GEpHIs 用と同等の試金はありません。など、結果を混同する細胞の損傷が予想される場合、独立の手段を通じて準備健康を監視する必要があります。GEpHIs は潜在的生体内で妨げた最小限の準備から画像を許可が組織の整合性は本質的に実験的操作を制限し不可能な校正のポイントを作ることができます。PHerry と他のゾル性細胞質の二重蛍光 pH 指示薬 (ClopHensor⁴⁰) などを使用して固有の別の特定の制限が派生とは関係なく互いと pH_{の蛍光を変更する 2 つの同時の傾向から}.RFP 集計アイテムはこの制限の最も重要な症状ですが、数量は 1 つまたは両方の蛍光物質の変質によっても侵害できます。したがって、イメージ投射プロトコル退色は、長い露出時間と獲得率につながることができますを最小限に抑えるために調整する < 0.2 hz 長い露光時間は急激な pH は_私をレポートするのに失敗がシフトします。セフ蛍光は pH 6.8 7.8 ほとんど準備から pH は_私に線形相関を示していますが、そのような測定の精度は nigericin/高 K⁺法の精度に依存します。Nigericin は、K⁺/H⁺イオノフォアとして機能し、, 細胞外 [K⁺] 細胞内 [K⁺] に依存して適切な校正。細胞内 [K⁺] の見積もりは利用できるまたはすべての実験装置の容易に入手ではありません。PH_私定量の精度になります細胞内 [K⁺] の見積もりとして、信頼性の高いが、相対変化率の pH は_私は一貫性のあるになります。細胞内 [H⁺] にこの制限と pH は_私の逆対数の関係を考えると、それは、常にデータを報告することが望ましい pH_私変化率の酸押出率 J_{H +}(図 6)、または酸系フラックス (図 6) ではなく、pH は_私の絶対的な変化。データの分析酸系フラックスの表面の違いを補正する付加的な利点があり、細胞のタイプ間の容積の比率には。

大人から通訳データ飛ぶ MT 準備このプロトコルで記述されているとき、いくつか注意事項を高く評価する必要があります。初期、経過と主なセグメントの形態の区別が MTs²に機能および遺伝的ドメインの本当の多様性の簡素化。さらに、このプロトコルは基底酸トランスポーターの機能を検出するように設計されて頂輸送の影響を与える pH_i測定も可能です。主にそのソリューション exchange により、MTs (ステップ 5.9) をマウントするときに尿管をシール基底面に発生しますが、イオンのパラの細胞および根尖部の動きが基底トランスポートを変更する最終的に pH_iに影響まだ、ルーメン/ゾル性細胞質のイオン勾配の細胞質側は。根尖部の絶対分離基底関数は独立して灌腔ないによって実現でき、MT がこのようなメソッドの基底面大幅にもっと技術的に要求、ピペット穿刺^{41 を必要としています。}.

GEpHIs は_、 pH を測定する従来の方法に比べて多くの利点を示し、遺伝的可塑性と組み合わせるとショウジョウバエMT 準備の低コスト、これらの強みが増幅されます。PH は_私の定量化は歴史的に蛍光染料 (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)²²またはイオン選択性電極^{20 を介して複雑な電気生理学的評価などに頼っています。 ,21}。PHerry は、エンコード遺伝子それ (紹介主細胞と MT、図 6の星状細胞) と、特定のプロモーターによって特定の細胞集団に表現できます、遺伝子導入、対象となるすべての組織は、影響を受けやすいです。トランスフェクション、またはウイルスによる感染症。染料は、個々 の準備とない異種組織の細胞特異性を伝える可能性があります複雑なアプリケーション プロトコルのコストによって制限されます。イオン選択性電極の作製と測定専用機器が必要、GFP と RFP がセットをフィルター pHerry 従来の唯一の広視野 epifluorescent 顕微鏡が必要ですが。染料および電極の使用中挽きたて抽出された組織で、体内時間を GEpHIs することもできます興味のティッシュに光アクセスだけでなく、物理的な必要があります。PH_私内因性バッファリングの存在下での定量化が可能 pH_私規制ない他の技術としての細胞生理学を評価するとき、そのまま準備のライブ イメージングのための機会、特に関心のメカニズム。

ショウジョウバエアダルト MT 準備細胞 pH 調節とイオン輸送に興味がある人の多くの魅力的な機能を示します。ショウジョウバエ飼育は高価と遺伝子にコードされたバイオ センサー構造と RNAi 式挿入などのツールが用意されて様々 なストック センター (インディアナ大学ブルーミントンショウジョウバエストック センターからウィーンショウジョウバエ研究センター)。ショウジョウバエMTs は、上皮のイオン輸送の研究に最適な偏光の上皮細胞の単一の層で構成されます。基底輸送することができます簡単に試金する (ここに示す)、頂の完全な評価が、基底イオン移動はマイクロ ピペット穿刺⁴¹で可能です。さらに、臓器機能アッセイ ラムゼイ分泌の試金¹⁷ , シュウ酸カルシウム沈着¹⁸よ特徴付けられたし、流動分泌のモデルに上皮細胞生理学の相関関係を許可するよう、腎結石、それぞれ。これらの機能は、堅牢な解析のための機会を提供する、epifluorescent 顕微鏡の低コストと全体の可用性は、ショウジョウバエMT モデル細胞および全体器官生理学のデモンストレーションに最適な教育研究所です。

これらのメソッドの習得は、基底上皮イオンの堅牢なモデルを輸送、まだ H⁺フラックス、アクセス可能な大人のショウジョウバエMTs によって pH_私規制の定量化を許可します。GEpHIs の pHerry は他の無脊椎動物の細胞型の pH_i規則を評価するために簡単に合わせることができるよう培養動物細胞および生体内で準備。新しい GEpHIs の開発は新しい世代可視スペクトルにまたがると集計アイテム^30,42,などの現在の制限に対処する遺伝子にコードされたカルシウムの続く可能性が高い^{43,44,45,46,47,48,49}GEpHIs は、ミトコンドリアのマトリックス pH^50,51、を報告する広く使用されているすでに、細胞内ターゲティング戦略が小胞体に⁵²、核^{バイオ センサーをローカライズする存在。53}、シナプス小胞^12,43, と細胞質^{54 55}細胞膜の外面 (パブリッシュされた試薬の一覧については表 2を参照)。ようツールが利用可能になる彼らが許可の Ca^{2 +}ハンドリングなど細胞内シグナル伝達、細胞生理学、および全体の器官機能の他の面と細胞内 pH の調節の垂直統合様々 な脊椎動物の間で無脊椎動物の準備。

著者が明らかに何もありません。

MFR. AJR を DK100227 は、T32 DK007013 によって支えられ、この仕事は、NIH の DK092408 によって支えられました。著者は、CapaR GAL4 と c724 GAL4 博士ジュリアン A.T. ダウを感謝したいショウジョウバエ株。我々 はまた実験飛ぶ十字架を維持支援のためヤコブ B のアンダーソン氏を感謝します。