Оптических количественная оценка внутриклеточный pH в Drosophila melanogaster Malpighian трубочку эпителия с флуоресцентные генетически закодированный pH индикатор

Клеточного ионного транспорта часто может оцениваться путем мониторинга внутриклеточного рН (рН,_я). Генетически Encoded рН индикаторы (GEpHIs) обеспечивают оптических количественная оценка внутриклеточного рН в клетках нетронутыми. Этот протокол подробности количественная оценка внутриклеточного рН через сотовый ex vivo жить изображений Malpighian трубочки Drosophila melanogaster с pHerry, псевдо ratiometric генетически закодированный рН показатель.

Эпителиальных ионный транспорт имеет жизненно важное значение для системного ионного гомеостаза, а также поддержание основных клеточных электрохимических градиентов. Внутриклеточный pH (pH_я) находится под влиянием многих ионных транспортеров и таким образом мониторинг pH,_я является полезным инструментом для оценки деятельности перевозчика. Современные генетически закодированный рН индикаторы (GEpHIs) обеспечивают оптических количественного определения рН_я нетронутым клеток на клеточном и субклеточном уровне. Этот протокол описывает в реальном времени количественная оценка клеточного рН_я регулирования в Malpighian трубочки (МТС) Drosophila melanogaster через ex vivo жить изображения pHerry, псевдо ratiometric GEpHI с pK хорошо подходит для отслеживания изменения рН в цитозоль. Извлеченный взрослых летать МТС состоят из морфологически и функционально различных разделов одноклеточного слоя эпителия и может служить в качестве доступной и генетически шансов справиться с возникающими модель для исследования эпителиальных транспорта. GEpHIs предлагают ряд преимуществ перед обычными рН чувствительных флуоресцентных красителей и ионоселективные электроды. GEpHIs можно пометить различных клеточных популяций, предоставлены соответствующие промоутер элементы доступны. Эта маркировка особенно полезен в ex vivo, в естественных условияхи на месте препараты, которые по своей сути неоднородных. GEpHIs также количественной рН_i в неповрежденной ткани с течением времени без необходимости повторного окрашивания лечения или ткани экстернализации. Основной недостаток текущей GEpHIs является тенденция агрегирования в цитозольной включений в ответ на повреждение тканей и построить гиперэкспрессия. Эти недостатки, их решения и преимущества GEpHIs продемонстрировал в этом протоколе путем оценки базолатеральной Протон (H⁺) транспорта в функционально различных главных и севрюга клеток извлеченных покупать МТС. Методы и анализ описанных легко адаптируется к широкий выбор препаратов, позвоночных и беспозвоночных, и изысканность Пробирной может масштабироваться от преподавания labs сложные определения ионного потока через конкретные перевозчиков.

Цель настоящего Протокола заключается в описания квантификации внутриклеточный pH (pH_i) с использованием генетически закодированный pH индикатор (GEpHI) и продемонстрировать, как этот метод может использоваться для оценки базолатеральной H⁺ транспорта в модели насекомых (D. melanogaster) почечной структура, Malpighian трубочку (MT). МТС служат выделительной органов плодовой мухи и функционально похожи на млекопитающих нефрон в нескольких ключевых отношениях¹. МТС аранжированы как 2 пары трубочки (передняя и задняя) в грудной клетки и живота летать. Одноклеточных эпителиальных трубка каждого MT состоит из метаболически активные главных клеток с собственный верхушечный (люминал) и базолатеральной (гемоцель) полярности, а также вставными севрюга клетки. Передняя МТС состоят из 3 морфологически, функционально, и развивающих разных сегментов, особенно первоначальных расширены сегмента, переходного этапа и секреторную основной сегмент, который присоединяется к Мочеточник². На клеточном уровне транс эпителиальных ионного транспорта в Люмене осуществляется путем апикальной плазматической мембраны V-АТФазы³ и теплообменник щелочно металл/Ч⁺ , а также базолатеральной Na⁺-K⁺-АТФазы⁴, внутрь выпрямительные K⁺ каналы⁵, Na⁺-Cl⁻/HCO₃⁻ теплообменника (NDAE1)⁶, и⁺⁺Na -K-2 Cl⁻ cotransporter (NKCC; Ncc69)⁷, в то время как клетки Ито посредником Cl^– и водный транспорт в^8,9. Этот сложный, но доступным Физиологическая система обеспечивает отличные возможности для расследования эндогенного Ион транспортных механизмов в сочетании с различных генетических и поведенческих toolsets дрозофилы.

Обоснование для этого протокола был для описания генетически ковкого системы для изучения эпителиальных ионного транспорта с потенциалом для интеграции от ячейки поведение и экспорта средств в другие модели системы. Выражение pHerry¹⁰, GEpHI, производного от сочетание зеленого супер-эклиптики рН чувствительных pHluorin^11,12 (SEpH) и красный рН регистра mCherry¹³, в МТС позволяет количественная оценка транспорта H⁺ отдельные ячейки MT через высокий K⁺/nigericin калибровки технику¹⁴. Как много ионных транспортеров двигаются H⁺ эквивалентов, количественная оценка внутриклеточного рН,_я служит функционального представительства движения ионов через различные транспортеры. Система модель дрозофилы MT также предлагает мощные инструменты для генетических ткани конкретных трансген¹⁵ и РНК интерференции (RNAi)¹⁶ выражение, которое может сочетаться с сотовой изображений и анализы состава органа^{17 , 18 , 19} трубочку функции для создания надежных инструментов с вертикальной интеграции от молекул поведение. Это стоит в отличие от многих других протоколов для оценки эпителиальных биологии, как исторически такие измерения полагались на сложной и сложной микро рассечение, сложные ионоселективные электроды^20,21, и дорогой рН чувствительных красители²² с ограничительной загрузки требования и бедных сотовой специфичность в разнородных тканей. GEpHIs были использованы обширно измерения рН_я в различные типы клеток²³. Ранние работы эксплуатируется присущие рН чувствительность от Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) для мониторинга рН_я культивировали эпителиальные клетки²⁴ , но в последние два десятилетия видели GEpHIs, используемые в нейроны²⁵,²⁶глии, грибов²⁷ , и завод клетки²⁸. Сочетание потенциал для сотовых ориентации генетической конструкции через GAL4/Уан выражение системы¹⁵ и физиологического доступности дрозофилы MT делают это идеальная подготовка для исследования рН_я регулирование и транспорт ионов эпителия.

pH_я регулирования была изучена на протяжении десятилетий и имеет жизненно важное значение для жизни. Подготовка MT предлагает надежную модель учить физиологии рН_я регулирования, но также выполнять сложные расследования рН_i регулирование ex vivo и в естественных условиях. Этот протокол описывает количественная оценка H⁺ движения через мембрану базолатеральной эпителиальных клеток дрозофилы MT с помощью NH₄Cl пульс кислоты Погрузка техники²¹, но как рН показатель является генетически закодированы, эти методы и их теоретические основы могут применяться к любой подготовки поддаются трансгенез и жить изображений.

Все шаги в этом протоколе соответствует руководящим принципам использования животных клиники Майо (Рочестер, MN).

1. летать животноводства

1. Поднять мух и набор пересекает согласно стандартным животноводства²⁹.
   Примечание: Флуоресцентные репортер выражение в системе GAL4/Уан пропорциональна температуре, и таким образом поднимать температуру можно регулировать изменить уровень выражения. В то время как уровни высокой выражения часто приводят к лучшее соотношение сигнал шум это условие связано также с повышенной цитозольной и organellar агрегатов при использовании GFP фьюжн красный флуоресцентный белок (RFP) конструкции, такие как^{, pHerry10 30,31}. Если агрегат является неизбежным, количественная оценка все еще возможно, выполняя точки калибровки в каждом эксперименте и нормализации данных таким образом, чтобы соотношение флуоресценции 1.0 соответствует рН_я 7.0 (см. шаг 7.4 записку по калибровке ниже).
2. Установить кресты гомозиготных capaR-GAL4³² мужчины гомозиготных бла pHerry¹⁰ девственной женщины и гомозиготных c724-GAL4² мужчин и гомозиготных бла pHerry девственница женщин разрешить изображений из рН_я в основные клетки и клетки Ито МТ соответственно. 6 место бас pHerry самок с 3 GAL4 мужчины в свежие флаконов продовольствия и отпуска для сопряжения на 28 ° C.
   Примечание: Личинки должно быть очевидным в течение 4 d и взрослые начинают Эклоз вокруг дней 10.
3. Собирать женского летит по eclosion и отложите в сторону для возраста 10 d 28 ° c.
   Примечание: Сроки проведения экспериментов может корректироваться соответствовать любой ограничительных поведенческих анализов (например Рамзай секрецию пробирного^17,19), которые будут соотноситься для внутриклеточного рН живых изображений. Мужчин мухи могут быть использованы, но трубочки от самки часто более широкую и работоспособную.

2. Подготовка поли L-лизин слайды.

1. Нарисуйте границы 40 x 20 мм с гидрофобным Пап перо вокруг верхней части стандартного 75 x 25 мм слайдов и отложите в сторону для просушки на 15 мин на RT. использования больших coverslips если слайды не совместимы с изображений оптика.
2. Передача 2 мл 0,01% раствор поли-L-лизин (PLL) на каждый слайд и отложите в сторону для 1 h на RT.
3. Удалите избыток PLL с пипеткой. Сохраните решение в конической флаконе 50 мл для использования в будущем. Хранить при 4 ° C.
4. Аспирационная любой оставшийся раствор с вакуумной линией. Запуск линии вакуумной над поверхностью весь слайд для обеспечения того, чтобы решения не на слайдах.
5. Установите слайды сторону для 1 дополнительного h на RT до использования. Храните слайды сухой на RT сроком до 1 месяца в книге стандартного слайда.

3. Подготовка рассекает блюдо и стеклянные стержни

1. Добавьте 0,5 мл эластомер отвердителя в 4,5 мл эластомера в 35 x 10 мм пенополистирола Петри на RT производить глубиной от 5 мм. микс с наконечником, одноразовые пипетки. Разрешить эластомер вылечить O/N на RT.
   Примечание: Эластомер должны быть четкими и без пузырьков. Очистка пузырей может быть облегчено, сохраняя эластомер пластины в вакуумный сосуд для 10-15 мин после заливки.
2. Держите стеклянный стержень диаметром 5 мм между руками и Растопите центр стержня на освещенной горелка Бунзена потянув концы друг от друга. Как стекло расплавов тянуть более быстро производить тонкий (0,1 мм) и конический вал (рис. 1).
   Примечание: Под углом 45 ° на хвостовике часто полезно в обработке трубочки. Это может быть достигнуто путем снижения одной рукой, как хвостовик тянет (см. Рисунок 1).
3. Сломать тонкие вала в середине с тупой стороной из углеродистой стали с одним краем лезвия бритвы. Осмотрите тонкий конец стержня под областью рассечения, чтобы убедиться, что место разлома является чистым.

Рисунок 1: Изготовления стекла стержней для обработки Malpighian трубочки.
A - E. Процесс нагрева и потянув Стеклодрот производить конусность и угол подходит для обработки MTs. стрелки обозначают направление и величина силы должен применяться. Ф. фотография инструмента надлежащим образом сфабрикованные стекла. Шкалы бар = 10 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. Подготовка перфузии системы и решения

Примечание: Перфузии системы отличаются от производителя. Этот протокол основан вокруг самотечных 8-канальный открытый резервуар с регулятором скорость входного потока и вакуум driven отток, но метод монтажа, что МТС как описано здесь могут быть адаптированы для работы с любой системой перфузии.

1. Подготовьте следующие решения:
   1. Аликвота Шнайдер средние (40 мл в конической флакон 50 мл) и хранить при 4 ° C.
   2. Подготовка решений (т.е. насекомое физиологический Phosphate-Buffered (комплексная стратегия миростроительства) и комплексная стратегия миростроительства с NH₄Cl) в РТ при необходимости согласно таблице 1). Теплый решения RT перед использованием на день эксперимента.
      Примечание: стратегии миростроительства и комплексная стратегия миростроительства с 40 мм NH₄Cl может быть подготовлен в больших объемах (1 Л или более) и хранить при 4 ° C.
   3. Подготовка 8 калибровочные растворы в 500 мл томов при pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 и 9.0, как указано в таблице 1 и хранить при 4 ° C. Отрегулируйте пэ-аш каждого решения путем титрования HCl и N-метил D-glucamine (NMDG).
   4. В день экспериментов теплый 5 мл аликвоты калибровки решений RT и добавить фондовых nigericin раствора (20 мм диметилсульфоксида (ДМСО)) производить конечная концентрация 10 мкм.
      Предупреждение: Ручка nigericin с перчатками. Лечить все оборудование, которое приходит в соприкосновение с nigericin как одноразовые. Nigericin остается на стекла и пластика и поставит под угрозу биологические препараты, если оборудование используется повторно.
2. Перфузии системы:
   1. Премьер системы перфузии, заполнив все водоемы с ddH₂O (рис. 2). Открытые каналы один на время, чтобы разрешить все линии проксимальнее регулятор скорость потока для заполнения.
      Примечание: Это может быть необходимо очистить воздух в линиях, открыв тупик канала и с помощью поршень привода потока из водохранилища.
   2. Откройте 2 канала и позволяют ddH₂O для слива. После водохранилища почти пусты, заполните первый водохранилище с комплексной стратегии миростроительства и второй резервуар с NH₄Cl импульсного стратегии миростроительства. Установите скорость потока для максимального с регулятором потока скорость и позволить каждое решение поступать за 1 мин для заполнения дистальной части линии, а затем остановить поток (рис. 2).
   3. Позиция 2 наборов пайки «руки помощи» зажимы на изображения микроскопа. Поместите один зажим на каждой стороне изображений платформы.
   4. Тщательно тепла дистальной 0,5 дюйма кусок капиллярные стеклянные (внутренний диаметр 1,5 мм, наружный диаметр 0.86 мм, длина 100 мм) над помощью горелки Бунзена. Создайте колено 45 °, позволяя дистального конца согнуть под действием силы тяжести и удаление стекла от пламени, как только достигается желаемый угол. Повторите этот процесс с второй кусок капиллярного стекла.
   5. Вставьте стекло гнутое капилляров в поточной линии и линии вакуум связаны отток, соответственно и смонтировать их в «руки помощи» для приведения их в соответствие с изображений Этап микроскопа (рис. 3).

Рисунок 2: Перфузии системы и конфигурации изображений.
Компоненты, необходимые для физиологических оценки MT базолатеральной функции транспорта путем одновременного живут флуоресценции изображений и быстрого решения обмена. Газ линии показано являются необязательными и разрешить расширение экспериментов для оценки переноса HCO₃^– . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Схема потока перфузии аппарата для NH₄Cl импульса экспериментов.
Стрелки показывают пути потока и клапан переключения точек. Решение перемещает от водохранилища образца, самотечный поток и обращается из образца камеры отходов колбы вакуумного всасывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

5. рассечение взрослых дрозофилы передней Malpighian трубочки.

1. Соберите блюдо диссекции и вытащил стеклянной палочкой из раздела 3, PLL-покрытием слайд из раздела 2, клей перфузии ну делителя, вакуумные смазка, 4 x 2» полоса пленки для запайки, 2 пары #5 изысканных щипцами и 40 мл аликвоты ледяной Шнайдер средних и RT стратегии миростроительства.
2. Распространения вакуумные смазка на Уплотнительная лента и нажмите клей перфузии ну делителя на ленту для покрытия нижней смазкой. Слезает клей перфузии ну делителя и поместите его жир сторона вниз поверх слайда с покрытием PLL. Удалите разделитель перфузии ну оставить отдельные образцы скважин, трассируется в гидрофобная смазка.
3. Место 200 мкл RT стратегии миростроительства в смазка окружили хорошо на слайде PLL покрытием и переместить слайд под стереоскоп.
4. Место Бас pHerry/capaR-GAL4 мух в пустой летают флакон и анестезировать их на льду за 10 мин.
   Примечание: Этот метод анестезии, в отличие от CO₂, гарантирует, что мухи не обезвоживая.
5. Налить ледяной Шнайдер среднего в рассечения блюдо и использовать тонкой щипцы для передачи одного наркотизированных женский летать в блюдо под рассечения стереоскоп.
6. Держите лету грудной клетки с набором щипцами и использовать другой нежно сцепление кзади живота. Тяните открытой задней лету, используя пинцет короче, преднамеренное движений. Как только кишку виден, сцепление дистального конца и освободить кишечник и МТС от базовой трахеолы, потянув кишку от тела через повторяющиеся, краткие буксиров.
   Примечание: Передний и задний МТС будет видно где они встречают стыке средняя и кишку через Мочеточник. Первая пара МТС быть свободная воля вероятно быть задней трубочки, как они окружают кишку. Это могут быть проигнорированы (рис. 4A).
7. Щепотка от передней МТС в мочеточник с тонкой щипцами после второй набор МТС бесплатно живота. Это будет отделить переднюю МТС от кишечника и закрыть мочеточника.
8. Подобрать бесплатно передней МТС с вытащил стеклянная палочка, двигая стержня под мочеточника, таким образом, что канальцев попадают в обе стороны. Поднимите МТС прямо из раствора.
9. Поверните стеклянный стержень, что МТС и мочеточник привязаны к нижней части стержня и опустите мочеточника прямо на слайд. Аффикс мочеточника и печатью дистальные концы МТС, нажав мочеточника вниз слайд стекла (рис. 4В). Не манипулировать МТС больше, чем необходимо. МТС следует быть плавающей в решении с мочеточника, привязанные к слайду.
10. Используйте тонкой конец стеклянной палочкой аккуратно подметать каждый трубочку по всей поверхности слайда. Брейс стержень против слайд, чтобы избежать дробления трубочку и сдвиньте стержень над верхней частью трубочку, перемещение дистальной к проксимальной, прикрепить на всю длину каждого трубочку на поверхности слайда PLL-покрытием (рис. 4 c).
11. Место клей делителя перфузии Ну обратно на слайде сформировать небольшую заполненные жидкостью более навесные трубочку.
12. Поместите образец на микроскопа. Поместите приток и отток капилляров на входе и выходе открытие перфузии хорошо, соответственно.
    Примечание: Разделителя также может быть прервана, если желаемого открытым перфузии камеры. В этом случае приток и отток капилляры можно выравнивать на противоположных сторонах изображения хорошо.

6. Проверка изображений протокол и здоровья трубочка

Примечание: Этот протокол выполняется на Перевернутый-поля epifluorescent микроскопом с GFP (SEpH) и наборы фильтров ППП (mCherry) (470/40 Нм возбуждения (ex), 515 нм longpass выбросов (ЭМ), 500 Нм дихроичных и 546/10 Нм ex, 590 нм longpass Эм, 565 Нм дихроичных), 10 X / 0,45 воздушные цели, монохромные камеры для захвата жить изображений и изображений программное обеспечение. Протокол может быть адаптирована для любого вертикально или инвертированный микроскоп с автоматизированной фильтра переключение между GFP и ППП Оптика и изображения приобретения программного обеспечения, хотя раз оптимальной экспозиции, интенсивности света и биннинга параметры будут меняться. В анализ всех интенсивности флуоресценции должны быть проанализированы как интенсивность средняя пиксель в регионе интереса (ROI), после того, как вычитание фона в каждом канале, используя РУА с содержит не флуоресценции, прилегающих к сигналу ROI.

1. Включите Микроскоп, источник света и система электронного фотографирования.
2. Открыть связанный изображений программное обеспечение.
3. Посмотрите через окуляр и вручную настроить фокус до тех пор, пока люмен MT хорошо видна под пропускаемого света.
4. Щелкните вкладку «Приобретение» в программное обеспечение для анализа изображений и в «Биннинга» раскрывающееся меню в разделе «Режим» выберите «2 x 2».
5. Вставьте фильтр нейтральной плотности 5% света путь к сокращению освещения свет и свести к минимуму Фотообесцвечивание.
6. Щелкните GFP (SEpH) канал в меню «Каналы», затем нажмите «Live» соблюдать флуоресцентного сигнала через камеру.
7. Чтобы задать время экспозиции, что яркая значений пикселов в гистограмму интенсивности около 40% от максимального значения ползунок «Время», а затем нажмите кнопку «Стоп», чтобы остановить освещение.
8. Повторите шаги 6.6-6.7 в ППП (mCherry) канал и подтвердить наличие расширенных первоначальных сегмента передней MT и отсутствие цитозольной mCherry агрегаты (индикативный повреждения тканей или гиперэкспрессия) (Рисунок 4 d).
   Примечание: Расширены сегмента должна быть очевидна, как это наиболее проксимального отдела трубочку и диаметр внутренний просвет этого сегмента составляет ~ 20 мкм, больше, чем прилегающие переходного этапа. 2 x 2 пиксела биннинга часто достаточно, но может быть увеличена до дальнейшего сокращения требуемых освещенности. Типичный выдержек, между 150 и 800 ms/канал. Использовать как мало света как можно свести к минимуму Фотообесцвечивание. Сведение к минимуму Фотообесцвечивание имеет жизненно важное значение для использования dual Флюорофор такие показатели, как pHerry как два флуорофоров можно отбеливать самостоятельно, таким образом недействительными любые коэффициент калибровки.
9. Включение промежуток времени визуализации протокола, установив флажок «Ряды».
10. Отрегулируйте «Продолжительность» в раскрывающемся меню в разделе «Ряды» 10 мин и бегунок «Интервал» 0 установить время общего захвата с частотой приобретение максимум изображений. Приобретение всего 0,2 Гц составляет часто достаточно.
11. Проверьте как GFP (SEpH), так и коробки ППП (mCherry) в разделе «Каналы».
12. Откройте линии стратегии миростроительства системы перфузии, активировав соответствующий контроллер и начните изображений протокол, нажав кнопку «Начать эксперимент.» После 1 мин, переключитесь на NH₄Cl пульс решение для 20 s, открыв соответствующий клапан и закрытие линии стратегии миростроительства, затем вернуться к стратегии миростроительства, закрыв NH₄Cl линии и открытие клапана стратегии миростроительства. Разрешить полный протокол изображений для завершения перед остановкой перфузии системы.
    Примечание: Покадровый анализ должен выявить стабильной mCherry и Сеф сигнал, который увеличивает присутствии NH₄Cl, утоляет после вымывания и постепенно восстанавливается.
13. 2-точки калибровки.
    1. Удалите также делителя, пилинг от базовой слайд и перфузии капилляров и зажимы от изображения хорошо.
    2. Применить 200 мкл калибровочных стратегии миростроительства (рН 7,4, 10 мкм nigericin) для изображений с пипеткой 200 мкл. Удаление решения из изображений с пипеткой, а затем заменить другой 200 мкл калибровочных раствора. Повторите этот процесс 4 раза для обеспечения полного решения обмена.
    3. Инкубируйте подготовки в калибровочный раствор за 30 мин до изображений. Повторите изображений протокол, используя те же параметры, которые определены в шагах 6.6-6.11, с изменением только 1 min образа захвата.
       Примечание: Перфузии системы и капилляров не нужны в этот шаг и не должно придаваться изображений хорошо, чтобы не подвергать капилляров в nigericin.
    4. Добавьте 200 мкл калибровочных стратегии миростроительства (рН 9,0, 10 мкм nigericin) изображений с пипеткой 200 мкл. Удаление решения из изображений с пипеткой, а затем заменить другой 200 мкл калибровочных раствора. Повторите этот процесс 4 раза для обеспечения полного решения обмена.
    5. Инкубируйте подготовку во втором решении калибровки за 10 мин до изображений. Повторите изображений протокол как шаг 6.13.3.
    6. Обзор снимок стека в программное обеспечение для анализа изображений для подтверждения, что не пикселов в любом канале насыщения, нажав кнопку «Означает ROI» и хотя прокрутки стека изображений с помощью ползунка «Кадр» наблюдая что значения не сообщили в гистограмму интенсивности достичь максимальное значение обнаружению. Если любые кадры содержат пикселы, которые достигают максимальной интенсивности обнаружению, уменьшите время или освещения интенсивность воздействия и повторите раздел 6.
       Примечание: После того, как установлено, не изменяйте визуализации параметров между экспериментов или калибровки, если точки калибровки, должны использоваться в каждом подготовки (см. шаг 8.3).
14. Анализ стека изображений для печати интенсивности флуоресценции и флуоресценции соотношение (SEpH/mCherry) как функцию от времени.
    1. Нажмите «Означает ROI» и выберите средство произвольной формы. Удерживайте левой кнопкой мыши для трассировки ~ 50 мкм длиной MT. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы закончить рисование ROI, а затем повторить в районе, прилегающем к MT для определения фона ROI (Рисунок 5A).
    2. Нажмите кнопку «Средней интенсивности» под «Измерения». Создайте таблицу значений интенсивности, нажав кнопку «Экспорт > таблицы данных > создать.»
    3. Щелкните значок шестеренка конфигурации и отменить выбор всех параметров, кроме «Время» и «Означает интенсивности». Щелкните правой кнопкой мыши вкладку для недавно созданной таблицы данных, выберите «Сохранить как» и экспортировать данные в виде файла .csv.
       Примечание: Аналогичные измерения может также производиться с использованием свободного программного обеспечения таких как ImageJ.
    4. Откройте таблицу таблицы и импорт данных таблицы путем выбора на вкладке «Данные», следуют «От текста».
    5. Используйте функции в таблице для вычитания Сеф фон интенсивности от интенсивности сигнала СЕФ в каждый момент времени. Повторите этот процесс для сигнала mCherry.
    6. Участок интенсивности каждого канала как функцию от времени, выбрав столбцы, содержащие время и скорректированные по фону интенсивность данных и затем нажмите «Вставить > точечной (графики) > точечные диаграммы с прямыми линиями» (Рисунок 5B).
    7. Используйте функции для вычисления соотношения флуоресценции Сеф/mCherry в каждый момент времени.
    8. Участок флуоресценции отношение как функцию от времени, выбрав столбцы, содержащие время и соотношение данных и затем щелкните «Вставить > точечной (графики) > Точечная с прямыми линиями» (рис. 5 c).

7. Полная калибровка pHerry в Malpighian трубочки Ex Vivo.

1. Вскрыть и смонтировать новый набор передней МТС, как описано в разделе 5.
2. Обмен комплексных стратегий миростроительства для калибровки стратегии миростроительства (рН 7,4, nigericin 10 мкм), как описано в шаге 6.13.2. Инкубируйте 30 мин.
3. Найдите МТС и собирать пары изображений Сеф/mCherry, как описано в шагах 6.1-6.11. Замените другой запас калибровки стратегии миростроительства как описано в шаге 6.13.4, подождите 10 минут и изображение снова решение. Повторите этот процесс до тех пор, пока Сеф/mCherry соотношение было imaged во всех решений. Получать рН 9,0 изображения как образец редк оправится от высоких рН.
4. Участок флуоресценции соотношение СЕФ в mCherry от калибровок в восьми образцов в зависимости от введенных рН,_я как описано в шаге 6.14.9. Fit данные калибровки с кривой Больцмана для получения полного калибровка функции согласно уравнение 1 (рис. 5 d). Если данные противоречивы, участок калибровочные наборы от каждого образца, нормализуются таким образом, чтобы соотношение флуоресценции 1.0 соответствует рН_i 7.0 и повторно анализировать (Рисунок 5E).
   Примечание: Если последний процесс необходимых индивидуальных экспериментов потребуется их собственные внутренние точки калибровки³³ (см. Количественная оценка шаг ниже (8.3)).
5. Уравнение 1
   
   Где R = соотношение Сеф/mCherry и₁,₂, x_oи dx являются кривой установки параметры, представляющие минимальное флуоресценции соотношение, максимум флюоресценции соотношение, pKи ширина функции соответственно. x_o = очевидной pK pHerry, который может варьироваться от 7.1 и 7.4 в зависимости от типа клеток и точной калибровки условий.

8. Количественная оценка базолатеральной кислоты экструзии от Ex Vivo трубочку Malpighian эпителия.

1. Изображение pHerry выражая севрюга клетки и выражая pHerry основных клеток одновременно.
   1. Рассечения передней МТС от мухи Бла pHerry/capaR-GAL4 , как описано в разделе 5, но не передавать МТС от рассечения Шнайдер средних изображения хорошо.
   2. Рассечения передней МТС от мухи Бла pHerry/c724-GAL4 в том же рассечения блюдо, используя процедуру, описанную в разделе 5.
   3. Перевод 2 комплекта МТС на же изображений хорошо, как описано в шагах 5,8-5.11.
      Примечание: Когда радикальные герб МТС вниз слайд, место МТС Бла pHerry/c724-GAL4 и Бла pHerry/capaR-GAL4 трубочки вблизи друг друга, так pHerry выражая главных и севрюга клетки могут быть визуализированы в том же поле ( Рисунок 6A).
2. Примените NH₄Cl prepulse как описано в шаге 6.12.
   Примечание: Если последовательное калибровки (рис. 4B) не может быть достигнута, выполняют точки калибровки, установив рН_i 7.0 в конце каждого эксперимента с калибровки стратегии миростроительства (рН 7,0, 10 мкм nigericin, инкубации 30 мин) после клей перфузии ну делителя и перфузии оборудование были удалены.
3. Калибровки следы от севрюга и главных клеток различных сегментов MT (с помощью абсолютного или нормализованной соотношение в соответствующих случаях) с уравнения 2 и анализа на этапе восстановления после NH₄Cl вывода путем применения с помощью функции экспоненциального распада программное обеспечение для статистического анализа и отмечая распад константа (τ) (Рисунок 6B).
   Уравнение 2
   
   Где R = соотношение Сеф/mCherry и₁,₂, x_oи dx являются кривой установки параметров определяется калибровки на шаге 7.4 (уравнение 1).
   1. Вычислить скорость кислоты экструзии (J_{H +}, см. уравнение 3) в зависимости от рН_я для учета вариаций в отдыхая рН,_я и кислоты, загрузки между подготовкой³⁴. Используйте экспоненциальной функции, полученных на шаге 8.3 для вычисления производной рН_я отношении время в каждом интервале времени.
      Уравнение 3
      
   2. Вычислить объем внутренней буферизации (β_i; Уравнение 4) цитозоль на рН,_я с самого начала каждого интервала в шаге 8.3.1 основанных на предыдущих литературы (см. уравнение 4).
      Примечание: У дрозофилы, наиболее тщательно характеристика β,_я приходит от личинок двигательного нерва терминалы³⁵ , и предполагается, что эти данные можно провести для MT клеток в отсутствие других имеющихся данных.
      Уравнение 4
      
   3. Вычислить произведение β_T (от шага 8.3.2)_и dpH_ятребует (от шага 8.3.1) чтобы определить J_{H +} (уравнение 3).
      Примечание: В номинально бикарбонат свободных решений, таких как тех, которые описаны в настоящем Протоколе, гидрокарбонатно производные буферизации способности (β_b) предполагается ~ 0 мм. Всего, буферизации способности (β_T) представляет собой совокупность β,_я и_βbи таким образом β_{я =} β_T в отсутствие HCO-₃^–-/CO-₂-³⁶.
   4. Участок J_{H +} как функция рН_я в начале каждого интервала времени, как указано в шаге 6.14.9.
   5. Применить экспоненциальный распад функции с частью всех наборов данных, которые перекрываются в рН_я с помощью статистического анализа программного обеспечения. Сравните темпы изменения результирующей функций для сравнения кислотных экструзии ставок между клетками и MT сегментов (рис. 6 c).
      Примечание: Наиболее подходящую функцию для кривой могут не всегда быть единый экспоненциальный. Другие функции может быть заменен, если они улучшить степень согласия.
   6. Рассчитать кислоты потока (см. уравнение 5) в зависимости от рН_я для учета изменения размера ячейки и формы.
      Уравнение 5
      
      Примечание: Размеры ячейки может быть измерены непосредственно в изображениях или аппроксимировать. Основные клетки может быть представлено как половинки полые трубки с габаритами: внутренний диаметр 24 мкм; наружный диаметр 48 мкм; Высота 50 µm. Переходные севрюга клетки переменной но примерно может быть представлено как баллоны с высоты 50 мкм и диаметров 10 мкм. Просмотреть последний пункт Представитель результаты ниже.
   7. Применить экспоненциальный распад функции с частью всех наборов данных, которые перекрываются в рН_я с помощью статистического анализа программного обеспечения. Сравните темпы изменения результирующей функции для сравнения кислотных потоков между клетками и MT сегментов (рис. 6 d).

Здоровые ткани и надлежащей идентификации передней МТС жизненно важное значение для успеха этого протокола. Во время вскрытия следует позаботиться не непосредственно ощупь МТС и только ручка их мочеточника как захвата МТС непосредственно приведет к поломке (Рисунок 4A– B). Когда МТС охватила плашмя на слайд, трубочки должны быть затронуты как можно меньше и избыток движения, избегать, поскольку это нанесет ущерб одной ячейки эпителиального пласта (рис. 4 c). Правильно разобрал передней МТС покажет равномерное распределение красных и зеленых флуоресценции в цитозоле клеток эпителия и морфологически различные трубочку сегментов. Трубочки повреждены неправильного перфузии или неправильным будет отображать агрегации красной флуоресценции с не парные зеленый агрегатов, и ошибочно задняя МТС будет показывать единообразных морфология от проксимального конца слепой к дистальной части мочеточника (рис. 4 d) . 

Правильное функционирование pHerry должна быть подтверждена хотя физиологическая оценка, а также морфология. Наиболее целесообразный метод подтверждения надлежащего рН зондирования является применение NH₄Cl пульс. В этих условиях зеленый Сеф сигнала следует сообщать ожидаемое рН изменения (увеличение pH_я во время импульса как NH₃ проникает в клетку, постепенное снижение во время импульса как NH₄⁺ поступает через K⁺ транспортеры и каналы и быстрое подкисление и постепенное восстановление после NH₄Cl вывода²¹, в то время как красный mCherry сигнал, должны оставаться неизменными ( BРисунок 5A– ). Масштабы изменений в СЕФ сигнал будет меняться с протоколом и ячейки типа, но mCherry сигнал должен быть стабильным во всех случаях. Изменения в mCherry сигнала во время отдельных экспериментов указывают артефакты движения или прогрессивного поколения агрегатов датчик из-за повреждения клеток. Последний будет предотвратить количественное определение pH,_я и следует избегать. После завершения в NH₄Cl пульс важно выполнять 2-точки калибровки (калибровка стратегии миростроительства, рН 7,4 и 9.0, 10 мкм nigericin) для подтверждения отдыха рН_я около 7,4 и убедитесь, что текущие параметры визуализации не приводят к насыщению флуоресценции обнаружения когда флуоресценции развернут на рН 9,0 (рис. 5 c). Если отдыхает рН является значительно ниже, чем 7,4, протокол должен повторяться с здоровым МТС; и если насыщение происходит при рН 9,0, протокол должен повторяться с нижнего света интенсивности или воздействия времени. После того, как определены надлежащие визуализации параметры, они не должны быть изменены между экспериментов или калибровки, если абсолютное флуоресценции коэффициенты должны быть использованы. В то время как псевдо ratiometric характер pHerry может предоставить метод коррекции движения в подверженными движение подготовки или изменения в диаметр ячеек, абсолютное количественного определения рН,_я требует полного систематической корреляции pHerry Сеф / mCherry отношение к рН_я через nigericin/высокая техника K⁺ . Калибровка pHerry в здоровых препараты должны производить последовательное калибровочных кривых с очевидной pK 7.1-7.4 в зависимости от типа и калибровки условий клеток (рис. 5 d). Для подготовки, в котором mCherry агрегата является неизбежным, нормализации соотношения значений таким образом, чтобы соотношение флуоресценции 1.0 соответствует рН,_я 7.0 должна принести аналогичные результаты (Рисунок 5E). Если используются точки калибровки и нормализованных кривых, визуализации параметров могут быть оптимизированы для каждого приготовления. 

Калиброванные рН_я следы могут использоваться для сравнения механизм регулирования рН между типами клеток. Выражение системы GAL4/UAS в дрозофилы может использоваться для выражения pHerry в основные клетки и севрюга клетки передней MT (рис. 6A). pH_я регулирование может оцениваться клетками кислоты Загрузка с NH₄Cl импульсов и количественного определения скорость pH_я восстановления. Это достигается путем установки экспоненциальных функций для этапа восстановления в различных экспериментальных условиях для извлечения константа распада (τ) как клетки с более быстрым измеряем H⁺ будет отображать более быстрое восстановление (и таким образом более низких значений τ). Основываясь на этом анализе, был обнаружен в клетках МТ, как представляется, более надежной кислоты экструзии, чем основные клетки (Рисунок 6B). Этот анализ будет проводить до тех пор, как отдыхая рН_я, степени кислоты загрузки и буферизации способности похожи между экспериментальной группы. Однако когда эти условия не выполнены, это необходимо для учета наблюдения, что внутренней буферизации способности цитозоле (β_i) многих клеток само по себе зависит от рН^35,37,38 и таким образом скорость изменения рН_я на различных рН_i не может быть непосредственно сопоставимы. В таких случаях экспоненциальное кривых соответствуют следующей фазы кислоты экструзии NH₄Cl пульс и ранее определенных оценки внутренней буферной емкости (β_i) может использоваться для построения уровень кислоты экструзии (J_{H +}) как функцию из рН,_я и определить компенсируется стоимость кислоты экструзии (уравнений 3 & 4). После того, как различия в кислоте погрузки и отдыха рН,_я приходилось, очевидно кислоты экструзии переходного этапа в главных клетках превышает севрюга клеток (рис. 6 c). Во время убедительными, этот анализ не адрес, измеренной рН,_я является функцией тома, в то время как кислота экструзии через плазматическую мембрану является функцией площади поверхности мембраны. Разделив J_{H +} , отношение площади поверхности к объем ячейки интерес даст значения родинки кислотных эквивалентах на единицу площади поверхности на единицу времени (уравнение 5), таким образом позволяя коррекции для различий в морфологии и размер ячейки. Примерно две основные клетки составляют окружности MT на переходных этапах, и таким образом отдельные клетки может быть смоделирована как половина трубы (внутренний диаметр 24 мкм; наружный диаметр 48 мкм; высота 50 мкм). Севрюга клетки меньше и имеют тенденцию быть бар образный в переходный сегмент MT². Точное количественное определение площадь поверхности и объем является трудной, но даже консервативные приближения формы переходных севрюга клеток (цилиндр с высоты 50 мкм и 10 мкм в диаметре) указывают на отношение площади поверхности к объем по крайней мере 2 x, что основных клеток. Принимая это во внимание показывает, что кислоты поток севрюга клеток является значительно ниже, чем в переходных главных клеток и фактически подходы, первоначальных сегмента главных клеток (рис. 6 d).

Рисунок 4: Рассечение взрослых дрозофилы передней Malpighian трубочки.
А. схематическое представление передней MT удаления с 2 пары тонкой щипцами в среде охлажденные Шнайдер. «A. трубочка» = передний MT. «P. трубочка» = задняя MT. B. Процесс извлечения и монтажа извлеченные МТС с помощью тонкого стекла стержней. C. процесс присоединения на всю длину извлечено МТС слайд для изображений и физиологического оценки. Д. Представитель widefield образы Сеф (470/510 нм ex / ЭМ) и mCherry (556/630 Нм ex / ЭМ) Комплектующие Уан pHerry обусловлен capaR-GAL4 с изображением здорового передней передний МТС, МТС повреждены в результате недостаточной перфузии, и ошибочно задняя МТС. Обратите внимание, что здоровый передней МТС отображать ясно расширены слепой первоначальных сегмента, суженные переходный сегмент с относительно увеличения выражением бла pHerry при capaR-GAL4, и дистальной Главная сегмент. Повреждены МТС дисплей заметно агрегатов mCherry люминесценции с без соответствующего Сеф флуоресценции. Задняя МТС являются одинаковыми в диаметре с не морфологически разных сегментов. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Проверка и калибровка pHerry в Malpighian трубочки.
A. Представитель widefield образы Сеф (470/510 нм ex / ЭМ) и mCherry (556/630 Нм ex / ЭМ) компоненты из бас pHerry обусловлен capaR-GAL4 с изображением здорового передней МТС «ROI» знаки сигнал области интереса. «БГ» знаки фона региона интерес, который был впоследствии вычитается из сигнала ROI в том же канале. Шкалы бар = 50 µm. B. Изменения относительной флуоресценции в СЕФ и mCherry сигналов pHerry в ответ на 20 s 40 мм NH₄Cl пульс. Обратите внимание, что mCherry сигнала стабильна, а сигнал Сеф отображает характерное увеличение во время импульса (свидетельствует о защелачивание, т.е. увеличение рН,_я) и резкое снижение после вымывания (ориентировочный подкисления, т.е. Снижение pH,_я). C. флуоресценции соотношение pHerry (SEpH/mCherry) исходя из данных B с дополнительных данных после 30 минут инкубации в стратегии миростроительства калибровки (10 мкм nigericin, 130 мм K⁺, рН 7,4 и 9.0). D. Калибровочная кривая построены от абсолютной pHerry коэффициент (SEpH / mCherry), в зависимости от введенного рН,_я во время экспозиции для калибровки стратегии миростроительства, буферизуются в один из восьми значений рН. Серые круги являются отдельные значения формы 8 препаратов. Черные квадраты и бары являются среднее болезни. кривая подходит Больцмана. Е. же данных как D нормированный таким что флуоресценции соотношение при pH 7,0-1.0. Кривая изменения сигмоид кривой (см. шаг 7.4, уравнение 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: Количественная оценка кислотных экструзии в трубочку Malpighian эпителия.
А. Widefield изображение Сеф флуоресцирования (от pHerry) в главных клетках передней MT (слева, руководствуясь capaR-GAL4 водитель) и севрюга клетки передней MT (справа, под c724-GAL4). Обратите внимание, что клетки Ито бар образный в сегменте первоначального, переменная в сегменте переходных, отображение различных сотовых прогнозы в основной сегмент. Шкалы бар = 100 µm. B. Калибровка рН_я изменения в ответ на 20 s 40 мм NH₄Cl импульса в регионах, представляющих интерес, обозначаемая в (основные клетки переходного этапа, главных клеток первоначального этапа и севрюга клетки переходного этапа). Пунктирные кривые обозначения единый экспоненциального подходит применяется к этапу восстановления кислоты после NH₄Cl вывода, от которого наследуются значения константы (τ) заявил распада. C. уровень кислоты экструзии (J_{H +}) нанесены как функция рН_i производного от экспоненты вписывается в б. Смотрите Шаг 8.3.1 расчета J_{H +} (уравнение 3). Пунктирные кривые являются экспоненциального ЦФ применяется для каждого участка данных в пределах области перекрывающихся рН_я обозначается серое окно. Д. кислоты поток заговор как функция рН_i производного от экспоненты вписывается в B и уравнение 5. Пунктирные кривые являются экспоненциального ЦФ применяется для каждого участка данных в пределах области перекрывающихся рН_я обозначается серое окно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: Экспериментальный полет решения.
Комплексная стратегия миростроительства решения готовятся при комнатной температуре и рН устанавливается путем титрования HCl и NaOH. Калибровочный раствор титруют с HCl и NMDG. Буфер калибровочный раствор разнообразен по желаемой рН [2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислота (MES) для рН = 4.0-6.0; 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES) для рН = 6,5-7,5; N-[трис (гидроксиметил) метил] -3-aminopropanesulfonic кислоты (краны) для рН = 8.0-9.0]. Все значения в мм, за исключением pH (unitless) и осмотического давления (ммоль/кг). Фондовый nigericin в ДМСО добавляется калибровочные растворы до конечной концентрации 10 мкм непосредственно перед использованием.

Таблица 2: Список опубликованных GEpHIs цитозолевая
Возбуждения Максима, выбросов Максима и очевидной pK значения являются приблизительными и могут меняться в зависимости от выражения системы, тепловизионная техника и метод калибровки. FLIM = флуоресценции жизни изображений микроскопии. NIR = возле ИК.

Успех количественного определения рН,_я в МТС дрозофилы полностью зависит от здоровья извлеченные МТС и качество монтажа и вскрытие (Рисунок – C). Таким образом тщательной обработке ткани как описано абсолютно необходимо. Слайды, свежезаваренным покрытием в PLL существенно помощи MT монтажа, поскольку они имеют тенденцию быть намного больше клея чем слайды которые ранее подвергались решения. Тщательного монтажа будет также способствовать идентификации отдельных сегментов MT (Рисунок D). Здоровые МТС облегчения калибровки pHerry и функциональной оценки путем уменьшения агрегации mCherry и приносит гораздо более последовательным количественная оценка кислотных экструзии, соответственно. В некоторых случаях избегая mCherry агрегации невозможна, так как экспериментальных условий по своей природе могут повредить MT эпителия или производить значительные гиперэкспрессия флуоресцентные репортер. В этих случаях псевдо ratiometric калибровки нормированный что флуоресценции коэффициент 1.0 соответствует рН_я 7.0, и точка калибровки будет количественной оценки (Рисунок E). Следует позаботиться при выполнении калибровок точки чтобы избежать постоянных элементов систем визуализации и перфузии для nigericin как ionophore будет придерживаться стекла и пластика. Калибровка даже псевдо ratiometric не возможно для обстоятельств, в которых экспериментальный манипуляции вызывает повреждения клеток во время эксперимента, т.е. этот ущерб приведет к прогрессивной явное увеличение mCherry флуоресцирования на протяжении всего эксперимента. В этих случаях позже Сеф флуоресценции сигнал может быть использован с нормализованной калибровочной кривой и точки калибровки, с той оговоркой, что изображения больше не будет правильно движение артефакты и смены фокуса.

GEpHIs имеют некоторые общие ограничения по сравнению с количественного определения рН,_я с флуоресцентными красителями. Краситель удержания может использоваться как показатель мембраны целостности и клетки здравоохранения³⁹, но не эквивалент пробирного доступен для GEpHIs использования. Таким образом подготовка здравоохранения должны контролироваться через независимые средства если повреждения клеток, по прогнозам, смешаем результаты. GEpHIs потенциально позволяют изображений от минимально нарушается в vivo препаратов, но ткани целостности неизбежно ограничивает экспериментальных манипуляций и можно сделать точки калибровки невозможно. Еще один конкретные ограничения, присущие с использованием pHerry и других показателей рН цитозольной двойной Флюорофор (например, ClopHensor⁴⁰) вытекает из двух флуорофоров тенденцию изменять их флуоресценции независимо от друг друга и pH_я . Артефакты агрегации ППП являются наиболее значительным проявлением этого ограничения, однако количественная оценка также может быть скомпрометирована Фотообесцвечивание одного или обоих флуорофоров. Таким образом, визуализации протоколы много корректироваться, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание, который может привести к долгое время экспозиции и цены приобретения < 0,2 Гц. Лонг экспозиции раз удастся представить быстрый рН,_я сдвиги. Сеф флуоресценции показывает линейной корреляции для рН,_я от рН 6,8-7,8 в наиболее приготовлениях, но точность таких измерений зависит от точности метода K⁺ nigericin/высокая. Nigericin действует как час K⁺⁺ ionophore и правильной калибровки основывается на equilibrating внеклеточные [K⁺] с внутриклеточной [K⁺]. Не доступны или легко доступной для всех экспериментальных систем оценки внутриклеточных [K⁺]. Точность количественной оценки рН_я только будет настолько надежным, насколько оценки внутриклеточных [K⁺], хотя темпы относительного изменения рН,_я будет согласовываться. Учитывая это ограничение и обратное логарифмическое отношения рН,_я внутриклеточных [H⁺], это всегда предпочтительнее данные отчета как темпы изменения рН,_я, ставка кислоты экструзии (J_{H +}, Рисунок 6 c), или кислоты поток (рис. 6 d) вместо абсолютного изменения рН,_я. Анализ данных как кислоты поток имеет добавленное преимущество корректировки на различия в поверхности являются объем соотношение между типами клеток.

Несколько предостережений необходимо высоко при интерпретации данных от взрослых летать MT подготовка указанных в настоящем Протоколе. Морфологическое различие первоначальный, переходный, и основных сегментов, вероятно, упрощение истинной разнообразия функциональных и генетические доменов присутствует в МТС². Кроме того в то время как этот протокол предназначен для обнаружения функции базолатеральной перевозчиков и кислота вполне возможно, что апикальной транспорта могут оказывать влияние рН_i измерения также. Герметизация мочеточников когда монтаж МТС (шаг 5.9) гарантирует, что решение обмен прежде всего возникает на поверхности базолатеральной но пункт клеточного и апикального движение ионов по-прежнему могут влиять рН_i как базолатеральной транспорта в конечном итоге изменяет цитоплазматическая сторона люмен/цитозольной градиентов ионов. Абсолютного разделения апикальной базолатеральной функция может быть достигнуто путем независимо perfusing Люминал и поверхностей базолатеральной MT, но такие методы существенно более технически сложных как они требуют микропипеткой катетеризации⁴¹ .

GEpHIs настоящее время много преимуществ над традиционными методами измерения рН,_я, и эти сильные стороны усиливается при сочетании с генетической пластичность и низкой стоимости подготовки дрозофилы MT. Количественное определение pH,_я исторически полагалась на Краски люминесцентные, флуоресцентные (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)²² или сложных электрофизиологических оценки через ионоселективные электроды^{20 ,21}. Как pHerry генетически закодирована, он может выражаться в конкретных клеточных популяций конкретных промоутеров (как показано здесь, в основные клетки и клетки Ито МТ, рис. 6) и подходят для использования в любой ткани при условии трансгенез, Трансфекция, или инфекции, вирусные опосредованной. Красители ограничены стоимости отдельных препаратов и протоколов потенциально сложные приложения, которые передают не специфичность клетки в разнородных тканей. Ионоселективные электроды требуют специализированного оборудования для изготовления и измерения, в то время как pHerry требует только widefield epifluorescent микроскопии с обычными GFP и ППП фильтрации наборов. Использование красителей и электроды требуют физической, а также оптический доступ к ткани интерес, в то время как GEpHIs может контролироваться в свеже извлеченные тканях и течение времени в естественных условиях. Возможность для живых изображений в нетронутыми препаратов представляет особый интерес при оценке клеточной физиологии регулирования pH_я как ни одна другая технология позволяет количественного определения рН_я присутствии эндогенного буферизации механизмы.

Дрозофилы подготовки взрослых MT представляет много привлекательных возможностей для тех, кто заинтересован в клеточных рН регулирования и ионного транспорта. Дрозофилы животноводства является недорогим и инструменты, такие как генетически закодированный биосенсор конструкции и интерференции выражение вставляет легко доступны из целого ряда акций центров (Блумингтон дрозофилы фондового центра в университете Индианы; Вене дрозофилы исследовательский центр). Дрозофилы МТС, состоят из одного слоя поляризованные эпителиальных клеток, что делает их идеальными для расследования транспорт ионов transepithelial. Базолатеральной транспорта может быть легко assayed (как показано здесь) но полной оценки апикальной и движение ионов базолатеральной возможна с микропипеткой катетеризации⁴¹. Кроме того, функции органа assays такие как Рамзай секрецию пробирного¹⁷ и просветный оксалата кальция осаждений¹⁸ хорошо изученных и разрешить корреляцию эпителиальных клеточной физиологии к моделям секреции жидкости и Почечнокаменная болезнь, соответственно. Хотя эти функции предоставляют возможности для надежного анализа, лоу кост и широкая доступность epifluorescent микроскопии делает дрозофилы MT модель идеально подходит для демонстрации сотовой и целом орган физиологии в учебных лабораториях.

Освоение этих методов позволяет количественного определения рН_я регулирования базолатеральной H⁺ потока в взрослых дрозофилы МТС, доступной еще надежную модель transepithelial ионный транспорт. Использование GEpHIs таких, как pHerry может быть легко адаптирована для оценки_i регулирование рН в других типах беспозвоночных клеток, культивируемых клеток млекопитающих и в естественных условиях препаратов. Разработка нового GEpHIs будет следовать, что генетически закодированный кальция показателей, скорее всего, с новым поколениям охватывающих видимого спектра и адресации текущего ограничения, такие как агрегирование артефакты^{30,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49}. GEpHIs уже широко использовались доклад митохондриальной матрица рН^50,51, и внутриклеточных ориентации стратегии существуют для локализации биодатчики эндоплазматического ретикулума⁵², ядро ⁵³,^4312,в синаптических пузырьков и цитоплазматических⁵⁴ и внешние поверхности клеточной плазматической мембраны⁵⁵ (см. таблицу 2 список опубликованных реагентов). Как такие инструменты становятся доступны они позволят вертикальная интеграция с другими аспектами клеточной физиологии, как Ca^{2 +} обработка и внутриклеточная сигнализация и весь орган функции регулирования субклеточном рН в различных позвоночных животных и беспозвоночных препаратов.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Эта работа была поддержана низ DK092408 и DK100227 для производителя Айр был поддержан T32-DK007013. Авторы хотели бы поблагодарить д-р Джулиан а.т. Доу за CapaR-GAL4 и c724-GAL4 дрозофила запасов. Мы также благодарим Джейкоб Андерсон для помощи в поддержании экспериментальный полет кресты.