الرقم الهيدروجيني "الكمي داخل الخلايا" الضوئية في Epithelia نبيب Malpighian melanogaster المورفولوجية مع الرقم الهيدروجيني "الفلورسنت وراثيا" ترميز مؤشر

يمكن تقييم النقل أيون الخلوية غالباً عن طريق مراقبة درجة الحموضة داخل الخلايا (الأس الهيدروجيني_أنا). وراثيا مرمز الأس الهيدروجيني-المؤشرات (جيفيس) توفر الكمي البصري لدرجة الحموضة داخل الخلايا في الخلايا سليمة. تفاصيل هذا البروتوكول التحديد الكمي لدرجة الحموضة داخل الخلايا عن طريق الخلوي السابقين فيفو العيش-التصوير للأنابيب مالباييان من melanogaster المورفولوجية مع فري، زائفة-راتيوميتريك وراثيا ترميز مؤشر الرقم الهيدروجيني.

النقل أيون الظهارية أمر حيوي للتوازن أيون النظامية، فضلا عن الحفاظ على التدرجات الكهروكيميائية الخلوية الأساسية. PH داخل الخلايا (درجة الحموضة_أنا) يتأثر بالعديد من أيون الناقلين وهكذا رصد درجة الحموضة_أنا أداة مفيدة لتقييم نشاط الناقل. الحديثة "وراثيا ترميز" الأس الهيدروجيني-(جيفيس) توفر المؤشرات الضوئية الكمي لدرجة الحموضة_وأنا في خلايا سليمة في نطاق الخلايا وسوبسيلولار. يصف هذا البروتوكول الكمي في الوقت الحقيقي للأس الهيدروجيني الخلوية_أنا تنظيم في الأنابيب Malpighian (MTs) من melanogaster المورفولوجية عن طريق السابقين فيفو العيش-تصوير فري، جيفي زائفة-راتيوميتريك مع فك مناسبة جداً لتعقب التغييرات الأس الهيدروجيني في سيتوسول. يطير الكبار المستخرجة MTs تتألف من فروع متميزة وظيفيا وشكليا من طبقة وحيدة الخلية ابيثيليا، ويمكن أن تكون بمثابة نموذجا موجوداً وتتبعها وراثيا للتحقيق في النقل الظهارية. جيفيس تقدم العديد من المزايا التقليدية الأصباغ الفلورية حساسة لدرجة الحموضة واقطاب الأيوني الانتقائي. يمكن تسمية جيفيس السكان خلية متميزة شريطة توافر عناصر المروج المناسبة. هذه العلامات مفيدة بشكل خاص في السابقين فيفو، في فيفو، و في الموقع الاستعدادات، التي أصلاً غير متجانسة. كما تسمح جيفيس الكمي pH_i في أنسجة سليمة مع مرور الزمن دون الحاجة لتخريج المعاملة أو الأنسجة صبغ المتكررة. العيب الرئيسي من جيفيس الحالي هو الميل إلى تجميع في تضمينات سيتوسوليك استجابة لتلف الأنسجة وبناء التعبير المفرط. وأظهرت أوجه القصور هذه، وحلولها، ومزايا جيفيس المتأصلة في هذا البروتوكول من خلال تقييم للنقل بروتون (H⁺) باسولاتيرال في الخلايا الرئيسية وتلعبه متميزة وظيفيا ذبابة المستخرجة النظام التجاري المتعدد الأطراف. التقنيات وتحليل ووصف القابلة للتكييف وفقا لمجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية الفقاريات واللافقاريات، ويمكن تحجيمها تطور المقايسة من تدريس مختبرات لتحديد معقدة لايون الجريان عبر الناقلين محددة.

والهدف من هذا البروتوكول هو وصف التقدير الكمي لدرجة الحموضة داخل الخلايا (pH_i) باستخدام ترميز وراثيا الأس الهيدروجيني-مؤشر (جيفي) وتبين كيف يمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم باسولاتيرال ح⁺ النقل في نموذج حشرة (د ميلانوجاستير) هيكل الكلوي، أنبوب مالباييان (طن متري). النظام التجاري المتعدد الأطراف بمثابة أجهزة مطرح ذبابة الفاكهة وتتشابه وظيفيا كليون الثدييات في عدة نواح رئيسية¹. يتم ترتيب النظام التجاري المتعدد الأطراف كأزواج 2 من الأنابيب (الأمامي والخلفي) في الصدر والبطن من الطاير. يتألف أنبوب الظهارية خلية واحدة لكل طن متري النشط أيضي الخلايا الرئيسية مع متميزة قمي (لومينال) والأقطاب باسولاتيرال (هيموكول)، فضلا عن الخلايا النجمية المقحم. النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية تتكون من 3 شكلياً، ووظيفيا، وشرائح متميزة تنمويا، لا سيما الأولى المتوسعة الجزء والجزء الانتقالي الافرازية الجزء الرئيسي، الذي ينضم إلى الحالب². على المستوى الخلوي ويتم إنجاز النقل أيون عبر الظهارية في التجويف غشاء البلازما قمي الخامس-ATPase³ ومبادل قلوي-معادن/ح⁺ ، فضلا عن باسولاتيرال نا⁺-ك⁺-أتباسي⁴، القنوات إلى الداخل-مقوم ك^{+ 5}غ⁺-مدفوعة Cl⁻/HCO⁻ ₃مبادل (NDAE1)⁶، و Na⁺-ك⁺-2 Cl⁻ كوترانسبورتير (نككك؛ Ncc69)⁷، بينما الخلايا النجمية التوسط Cl^– ، ونقل المياه^8،9. ويوفر هذا النظام الفسيولوجية المعقدة لكن موجوداً فرصاً ممتازة لتحقيق آليات النقل أيون الذاتية عندما يقترن toolsets الجينية والسلوكية المتنوعة من المورفولوجية.

وكان الأساس المنطقي لهذا البروتوكول لوصف نظام طيع وراثيا لدراسة النقل أيون الظهارية مع إمكانات التكامل من الخلية إلى السلوك وتصدير أدوات لنظم نموذجية أخرى. التعبير عن فري¹⁰، جيفي المستمدة من مزيج من الأخضر حساسة لدرجة الحموضة دائرة البروج فائقة فلورين^11،12 (SEpH) ومشري غير متحسسة للأس الهيدروجيني الأحمر¹³، في النظام التجاري المتعدد الأطراف يسمح التحديد الكمي للنقل ح⁺ في الخلايا طن متري واحد من خلال ارتفاع ك⁺/nigericin المعايرة تقنية¹⁴. كما نقل العديد من الناقلين أيون مكافئات ح⁺ ، التحديد الكمي لدرجة الحموضة داخل الخلايا_وأنا بمثابة تمثيل وظيفية لحركة أيون عبر مجموعة متنوعة من الناقلين. كما يوفر النظام النموذجي المورفولوجية طن متري أدوات الوراثية قوية في التحوير الأنسجة على حدة¹⁵ والجيش الملكي النيبالي التدخل ([رني])¹⁶ التعبير، التي يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع التصوير بالهاتف الخلوي وفحوصات الجهاز الجامع^{17 , 18 , 19} وظيفة أنبوب لإنشاء مجموعة أدوات قوية مع التكامل الرأسي من الجزيئات للسلوك. وهذا يقف في المقابل للعديد من البروتوكولات الأخرى لتقييم البيولوجيا الظهارية، كما اعتمدت تاريخيا هذه القياسات على معقدة وشاقة والتشريح الدقيقة والمتطورة من أقطاب الأيوني الانتقائي^20،21، والأصباغ غالية حساسة لدرجة الحموضة²² مع متطلبات تحميل التقييدية والفقيرة خصوصية الهاتف الخلوي في الأنسجة غير متجانسة. وقد استخدمت جيفيس لقياس درجة الحموضة_وأنا في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا²³على نطاق واسع. العمل في وقت مبكر في استغلال الملازمة للأس الهيدروجيني-الحساسية من الأخضر الفلورسنت البروتين (التجارة والنقل) لرصد درجة الحموضة_أنا في الخلايا الظهارية مثقف²⁴ ولكن خلال العقدين الماضيين شهدت جيفيس المستخدمة في الخلايا العصبية²⁵،²⁶من إطلاق، الفطريات²⁷ ، والخلايا النباتية²⁸. مزيج احتمال استهداف الخلوية الوراثية بنيات من خلال نظام التعبير GAL4/UAS¹⁵ وإمكانية الوصول إلى الفسيولوجية المورفولوجية طن متري جعل هذا إعداد مثالية للتحقيقات للأس الهيدروجيني_أنا التنظيم والنقل أيون الظهارية.

تنظيم درجة الحموضة_أنا درست على مدى عقود وأمر حيوي للحياة. ويوفر إعداد طن متري متطورة نموذج قوي تدريس علم وظائف الأعضاء تنظيم الأس الهيدروجيني_أنا ولكن أيضا إجراء التحقيقات pH_i التنظيم السابقين فيفو و في فيفو. هذا البروتوكول يصف التحديد الكمي لحركة ح⁺ عبر الغشاء باسولاتيرال للخلايا الظهارية من المورفولوجية استخدام NH₄حمض نبض Cl تحميل تقنية²¹مليون طن، ولكن كمؤشر الرقم الهيدروجيني-وراثيا ترميز، هذه الأساليب وإطارها النظري يمكن تطبيقها على أي إعداد قابلة ترانسجينيسيس وتصوير العيش.

كافة الخطوات في هذا البروتوكول الامتثال للمبادئ التوجيهية استخدام الحيوان "كلينيك" (روتشستر، مينيسوتا).

1-يطير تربية

1. رفع الذباب وتقاطع مجموعة وفقا لمعيار تربية²⁹.
   ملاحظة: التعبير مراسل الفلورسنت بنظام GAL4/UAS متناسبة مع درجة الحرارة وهكذا تربية درجة الحرارة يمكن تعديلها لتغيير مستوى التعبير. بينما مستويات عالية من التعبير غالباً ما تؤدي إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء أفضل هذا الشرط يرتبط أيضا بزيادة المجاميع سيتوسوليك وأورجانيلار عند استخدام التجارة والنقل للانصهار الأحمر نيون البروتين (RFP) يبني مثل فري^{10، 30،31}. إذا كان التجميع أمر لا مفر منه، التقدير الكمي لا يزال من الممكن عن طريق إجراء نقطة التحديدات في كل تجربة وتطبيع البيانات أن يقابل نسبة الأسفار من 1.0 إلى درجة الحموضة_أنا 7.0 (راجع الخطوة 7، 4 مذكرة بشأن معايرة أدناه).
2. تقاطع مجموعة من الذكور³² متماثل كبار GAL4متماثل الإناث العذراء¹⁰ UAS-فريو متماثل c724-GAL4² الذكور إلى الإناث العذراء UAS-فري متماثل السماح بتصوير لدرجة الحموضة_وأنا في الخلايا الرئيسية والخلايا النجمية للنقل المتعدد الوسائط، على التوالي. 6 مكان UAS-فري الإناث مع الذكور GAL4 3 في قارورة جديدة من الأغذية والإجازات رفيقه في 28 درجة مئوية.
   ملاحظة: ينبغي أن يكون يرقات واضحا داخل د 4 والكبار ستبدأ اكلس حول يوم 10.
3. جمع الذباب الإناث عند اكلوسيون وتوضع جانبا لسن د 10 في 28 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن ضبط توقيت التجريب لتتوافق مع أي فحوصات السلوكية التقييدية (مثل رامزي إفراز الإنزيم^،من¹⁷¹⁹) التي سوف ترتبط بتصوير pH داخل الخلايا الحية. يمكن استخدام الذباب الذكور ولكن غالباً ما تكون الأنابيب من الإناث أكبر حجماً وأكثر قوة.

2-إعداد الشرائح بولي-L-يسين.

1. رسم حدود 40 × 20 ملم مع قلم PAP مسعور حول الجزء العلوي من الشرائح القياسية 75 × 25 مم وتوضع جانبا لتجف لمدة 15 دقيقة في استخدام الرايت كوفيرسليبس كبيرة إذا كانت الشرائح غير متوافقة مع التصوير البصريات.
2. نقل 2 مل محلول بولي-L-يسين (PLL) 0.01 ٪ الأسهم على كل شريحة وتوضع جانبا ح 1 في الرايت
3. إزالة PLL الزائدة مع ماصة. حفظ الحل في قنينة 50 مل مخروطية لاستخدامها في المستقبل. مخزن في 4 درجات مئوية.
4. نضح أي حل المتبقية مع خط فراغ. قم بتشغيل سطر فراغ على سطح الشريحة بأكملها لضمان أن أي حل لا يزال على الشرائح.
5. تعيين الشرائح جانبا ح إضافية 1 RT قبل الاستخدام. تخزين الشرائح الجافة في RT لتصل إلى شهر واحد في كتاب شرائح قياسية.

3-إعداد تشريح طبق وقضبان الزجاج

1. إضافة 0.5 مل عامل علاج الاستومر إلى 4.5 مل الاستومر قاعدة في البوليسترين 35 × 10 مم طبق بيتري في RT لإنتاج بعمق من 5 مم-ميكس مع تلميح ماصة المتاح. السماح الاستومر لعلاج O/N في الرايت
   ملاحظة: يجب أن يكون الاستومر واضحة وخالية من الفقاعات. قد يتيسر إزالة الفقاعات بإبقاء لوحات الاستومر في جرة فراغ لمدة 10-15 دقيقة بعد سكب.
2. يعقد قضيب زجاج قطرها 5 ملم بين يديه وتذوب وسط القضيب فوق موقد بنسن مضاءة حين سحب الغايات عن بعضها البعض. كالزجاج يذوب سحب أكثر بسرعة لإنتاج رقيقة (0.1 مم) ورمح مدبب (الشكل 1).
   ملاحظة: بزاوية 45 درجة في شأنك غالباً مفيدة في التعامل مع الأنابيب. يمكن تحقيق هذا عن طريق خفض يدا واحدة كما يتم سحبها شأنك (انظر الشكل 1).
3. كسر رمح رقيقة في الوسط مع الجانب كليلة شفرة الحلاقة المصنوعة من الصلب الكربوني واحد ذو حدين. فحص نهاية القضيب تحت نطاق تشريح للتأكد من الكسر نظيفة رقيقة.

الشكل 1: اختﻻق قضبان الزجاج للتعامل مع الأنابيب مالباييان.
أ-ه. عملية التسخين وسحب قضيب زجاج لإنتاج تفتق وزاوية مناسبة للتعامل مع "الأسهم mts." تدل على اتجاه وحجم القوة التي يمكن تطبيقها. و-صورة فوتوغرافية لأداة الزجاج ملفقة على نحو ملائم. شريط مقياس = 10 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

4-إعداد نظام التروية والحلول

ملاحظة: أنظمة نضح تختلف حسب الشركة المصنعة. ويستند هذا البروتوكول حول الجاذبية 8-قناة مفتوحة خزان مع منظم معدل تدفق إدخال وتدفقا يحركها من فراغ، ولكن طريقة تركيب النظام التجاري المتعدد الأطراف كما هو موضح هنا يمكن تكييفها للعمل مع أي نظام التروية.

1. إعداد الحلول التالية:
   1. الكوة شنايدر المتوسطة (مل 40 إلى 50 مل قارورة مخروطية الشكل) ومخزن في 4 درجات مئوية.
   2. إعداد الحلول (أي الحشرات "فوسفاتيبوفيريد المالحة" (المتكاملة) ومتكاملة مع NH₄Cl) في الرايت حسب الحاجة ووفقا الجدول 1). حلول الحارة ل RT قبل استخدامها في يوم تجربة.
      ملاحظة: المتكاملة ومتكاملة مع 40 مم NH₄Cl يمكن إعدادها بكميات كبيرة (1 لتر أو أكثر) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   3. إعداد حلول المعايرة 8 في حجم 500 مل على درجة الحموضة = 5.0 و 6.0، 6.5، 7.0، 7.3، 7.6، 8.0 و 9.0 كما هو مبين في الجدول 1 ومخزن في 4 درجات مئوية. ضبط الأس الهيدروجيني لكل حل بالمعايرة مع N-الميثيل-د-جلوكاميني (نمدج) و HCl.
   4. اليوم من تجارب، الحارة مختبرين 5 مل من حلول المعايرة على RT وإضافة حل نيجيريسين الأسهم (20 ملم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) لإنتاج بتركيز نهائي 10 ميكرون.
      تنبيه: تعامل مع نيجيريسين مع القفازات. التعامل مع جميع المعدات التي تأتي على اتصال نيجيريسين حسب المتاح. نيجيريسين ما زال على الزجاج والبلاستيك وسيتم حل وسط الاستعدادات البيولوجية إذا تم إعادة استخدام المعدات.
2. نظام التروية:
   1. رئيس الوزراء نظام التروية بتعبئة جميع خزانات مع ddH₂س (الشكل 2). فتح قنوات واحد في وقت واحد للسماح لكافة بنود الدانية إلى منظم معدل التدفق لملء.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري لمسح جوي في الخطوط بفتح القناة المتوقفة واستخدام المكبس لتدفق محرك الأقراص من الخزان.
   2. 2 القنوات المفتوحة وتسمح ddH₂س لاستنزاف. بمجرد الخزانات الفارغة تقريبا، ملء الخزان الأولى مع متكاملة والخزان الثاني مع NH₄ستوجز نابض Cl. تعيين معدل التدفق إلى الحد الأقصى مع الجهة المنظمة لمعدل التدفق والسماح لكل حل بالتدفق لمدة 1 دقيقة لملء الخطوط البعيدة، ثم وقف التدفق (الشكل 2).
   3. موقف 2 مجموعات لحام المشابك "يد العون" في مرحلة مجهر التصوير. وضع المشبك واحدة على كل جانب من منصة التصوير.
   4. الحرارة بدقة 0.5 بوصة القاصي قطعة من الزجاج الشعرية (القطر الداخلي 1.5 ملم، القطر الخارجي 0.86 ملم، طول 100 مم) فوق موقد بنسن. إنشاء منحنى 45 ° بالسماح للنهاية البعيدة لينحني بالجاذبية وإزالة الزجاج من اللهب حالما يتحقق الزاوية المطلوبة. كرر هذه العملية مع قطعة زجاج الشعرية ثانية.
   5. إدراج الزجاج عازمة الشعيرات الدموية في سطر في تدفق وتدفق متصل بفراغ الخط، على التوالي، وجبل لهم في "يد العون" لمواءمتها مع مرحلة التصوير المجهر (الشكل 3).

الشكل 2: نظام التروية والتصوير التكوين.
العناصر اللازمة لتقييم وظيفة النقل باسولاتيرال طن متري من خلال متزامنة الفسيولوجية يعيش fluorescence التصوير وسرعة تبادل الحلول. خطوط الغاز أظهرت اختيارية، ويسمح بالتوسع في تجارب لتقييم النقل HCO₃^– . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: تجارب التخطيطي تدفق جهاز نضح ل NH₄Cl النبض.
سهام تصور مسار التدفق وصمام تحويل النقاط. الحل ينتقل من الخزان إلى العينة بتدفق الجاذبية ومستمد من قاعة العينة إلى قارورة النفايات بشفط فراغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

5-تشريح للأنابيب مالباييان الأمامي الكبار المورفولوجية .

1. جمع الصحن التشريح وسحب الشحوم فراغ، المفرق جيدا نضح لاصقة، قطاع 4 × 2 "لختم الفيلم، قضيب الزجاج من الباب 3، شريحة المغلفة PLL من الباب 2، 2 زوجاً من #5 غرامة الملقط، ومختبرين 40 مل المتوسطة وستوجز RT المثلج شنايدر.
2. انتشار الشحوم فراغ في الشريط الختم واضغط الفاصل جيدا نضح لاصقة على الشريط الأسفل مع الشحوم معطف. تقشر مقسم جيدا نضح لاصقة ووضعه الشحوم الجانب-لأسفل على أعلى شريحة مغلفة PLL. إزالة الفاصل نضح جيدا إلى ترك العينة الفردية الآبار التي تتبع في الشحوم مسعور.
3. مكان 200 ميليلتر من ستوجز RT في الشحوم-طوق جيدا على الشريحة المغلفة PLL وتحريك الشريحة تحت ستيريوسكوبي.
4. فيال الذباب UAS-فري/كبار-GAL4 مكان في يطير فارغة وتخدير لهم على الجليد لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: هذه الطريقة من التخدير، على عكس CO₂، يضمن أن الذباب لا يذوي.
5. صب المتوسطة المثلج شنايدر في طبق تشريح واستخدام الملقط غرامة لنقل ذبابة أنثى واحدة أنيسثيتيزيد في الطبق تحت ستيريوسكوبي تشريح.
6. عقد الطاير بالصدر مع مجموعة من الملقط واستخدام أخرى بلطف قبضة الخلفي البطن. سحب فتح مؤخرة ذبابة باستخدام الملقط وباختصار، التماسات متعمدة. بمجرد المعي الخلفي مرئياً، قبضة نهاية القاصي ومجانا على القناة الهضمية والنظام التجاري المتعدد الأطراف من tracheoles الكامنة عن طريق سحب المعي الخلفي خارج الجسم عن طريق القاطرات قصيرة ومتكررة.
   ملاحظة: النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية والخلفية ستكون مرئية حيث يلتقي تقاطع الأمامي والمعي الخلفي من خلال الحالب. أول زوج من النظام التجاري المتعدد الأطراف تكون الإرادة الحرة يحتمل أن تكون الأنابيب الخلفي كما أنها محاصرة المعي الخلفي. يمكن أن تكون هذه تجاهل (الشكل 4 أ).
7. قرصه خارج النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية في الحالب مع غرامة الملقط بعد المجموعة الثانية من النظام التجاري المتعدد الأطراف خال من البطن. وهذا فصل النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامي من القناة الهضمية وإغلاق الحالب.
8. التقاط النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية مجاناً مع قضيب الزجاج سحبت من انزلاق القضيب تحت الحالب أن الأنابيب تقع على جانبي. رفع النظام التجاري المتعدد الأطراف مباشرة من الحل.
9. دورة قضيب الزجاج أن النظام التجاري المتعدد الأطراف والحالب التقيد بالجانب السفلي القضيب، وانخفاض الحالب إلى أسفل داخل الشريحة. إلصاق الحالب وختم الغايات البعيدة للنظام التجاري المتعدد الأطراف عن طريق الضغط على الحالب إلى أسفل على شريحة الزجاج (الشكل 4 باء). عدم التلاعب بالنظام التجاري المتعدد الأطراف أكثر من اللازم. النظام التجاري المتعدد الأطراف ينبغي العائمة حتى في الحل مع الحالب ترتكز إلى الشريحة.
10. استخدام نهاية قضيب الزجاج غرامة لاكتساح كل أنبوب بلطف عبر سطح الشريحة. يستعدوا للقضيب ضد الشريحة لتجنب سحق أنبوب والشريحة القضيب فوق الجزء العلوي من أنبوب، تتحرك القاصي إلى الدانية، تعلق كامل طول كل أنبوب على سطح الشريحة المغلفة PLL (الشكل 4).
11. ضع الفاصل جيدا نضح لاصقة مرة أخرى على الشريحة بتشكيل صغيرة مملوءة بسائل أكثر من أنبوب المحملة.
12. وضع العينة على مرحلة المجهر. ضع التدفق وتدفق الشعيرات الدموية على مدخل ومخرج افتتاح نضح جيدا، على التوالي.
    ملاحظة: يمكن أن تترك مقسم جيدا إذا كان هو المطلوب دائرة مفتوحة التروية. في هذه الحالة يمكن أن تكون محاذاة الشعيرات الدموية تدفق وتدفق على طرفي نقيض التصوير جيدا.

6-التحقق من صحة التصوير البروتوكول والصحة

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا البروتوكول المعني مجهر مقلوب واسع المجال ابيفلوريسسينت بالتجارة والنقل (SEpH)، وطلب تقديم العروض (متشيري) عامل تصفية مجموعات (470/40 نانومتر الإثارة (السابقين)، 500 نانومتر نانومتر مزدوج اللون و 546/10 ت 590 nm الفلترات م، 565، 515 نانومتر الفلترات الانبعاثات (م) نانومتر مزدوج اللون)، 10 X/ 0.45 الهواء الهدف، كاميرا أحادية اللون لالتقاط الصور ويعيش، وبرامج التصوير. يمكن تكييفها تستقيم أي البروتوكول أو مقلوب مجهر مع عامل التصفية التلقائية التبديل بين التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض البصرية والصورة اقتناء البرمجيات، على الرغم من أن تختلف أوقات التعرض الأمثل وشدة الضوء والمعلمات binning. في تحليل كافة، يجب أن يتم تحليل شدة الأسفار ككثافة بكسل يعني في منطقة الفائدة (العائد على الاستثمار)، بعد الطرح الخلفية في كل قناة باستخدام دوروا مع يحتوي على لا الأسفار المتاخمة للإشارة العائد على الاستثمار.

1. قم بتشغيل المجهر، ومصدر الضوء، ونظام التصوير.
2. فتح برامج التصوير المرتبطة بها.
3. ننظر من خلال العدسة وضبط التركيز يدوياً حتى يصبح التجويف MT مرئية بوضوح تحت الضوء المنقولة.
4. انقر فوق علامة التبويب "حيازة" في صورة تحليل البرامج وحدد "2 × 2" في القائمة المنسدلة "Binning" في المقطع "الحصول على الوضع".
5. إدراج مرشح كثافة محايدة 5% في مسار الضوء تقليل إضاءة الضوء والتقليل من فوتوبليتشينج.
6. انقر فوق قناة التجارة والنقل (SEpH) في قائمة "القنوات"، ثم انقر فوق "حية" لمراقبة الإشارات الفلورسنت عبر الكاميرا.
7. ضبط مربع التمرير "الوقت" لتعيين وقت التعرض أن قيم بكسل ألمع في الرسم البياني شدتها حوالي 40 في المائة من الحد الأقصى للقيمة، ثم انقر فوق "إيقاف" لإيقاف الإضاءة.
8. كرر الخطوات 6.6-6.7 في طلب تقديم العروض (مشري) القناة وتأكيد وجود الجزء الأول متسعة من MT الأمامي وغياب مشري سيتوسوليك مجاميع (يدل على تلف الأنسجة أو overexpression) (الشكل 4).
   ملاحظة: يجب أن يكون الجزء المتوسعة الواضح كما هو الجزء الأكثر الدانية من أنبوب وقطر التجويف الداخلي لهذا الجزء هو ميكرومتر ~ 20 أكبر من الجزء الانتقالية المتاخمة. 2 × 2 binning بكسل كافية في كثير من الأحيان ولكن يمكن زيادة لزيادة خفض شدة الإضاءة المطلوبة. هناك أوقات التعرض نموذجية بين 150 و 800 مللي/القناة. استخدم كالقليل من الضوء قدر الإمكان للتقليل من فوتوبليتشينج. التقليل من فوتوبليتشينج أمر حيوي لاستخدام مؤشرات fluorophore المزدوج مثل فري كما يمكن التبييض fluorophores اثنين بشكل مستقل، وبالتالي إبطال أي معايرة نسبة.
9. تمكين بروتوكول الوقت الفاصل بين تصوير بواسطة النقر فوق خانة الاختيار "السلاسل الزمنية".
10. ضبط "المدة" في القائمة المنسدلة في المقطع "السلاسل الزمنية" إلى 10 دقيقة والمنزلق "الفاصل الزمني" إلى 0 لتعيين وقت الالتقاط الإجمالي بمعدل اقتناء صورة كحد أقصى. غالباً ما يكفي الحصول على مجموع معدل 0.2 هرتز.
11. تحقق من كل من التجارة والنقل (SEpH) وخانات طلب تقديم العروض (مشري) في المقطع "القنوات".
12. فتح خط ستوجز نظام التروية بتفعيل وحدة تحكم صمام المناسبة وبدء تشغيل البروتوكول التصوير بواسطة النقر فوق "ابدأ التجربة." بعد 1 دقيقة، قم بالتبديل إلى NH₄Cl نبض الحل ل 20 s بفتح صمام المناسبة وإغلاق خط متكاملة، ثم العودة إلى متكاملة عن طريق إغلاق NH₄خط Cl وإعادة فتح صمام متكاملة. يسمح بروتوكول تصوير كامل لإكمال قبل إيقاف نظام التروية.
    ملاحظة: ينبغي أن تكشف عن تحليل الوقت الفاصل بين إشارة متشيري مستقرة وإشارة SEpH الذي يزيد من حضور NH₄Cl، ويروي عند تبييض ويتعافى تدريجيا.
13. القيام بمعايرة 2-نقطة.
    1. إزالة الفاصل جيدا إلى جانب تقشير أنه بعيداً عن الشريحة الأساسية وإزالة الشعيرات الدموية نضح والمشابك من التصوير جيدا.
    2. تطبيق 200 ميليلتر المعايرة المتكاملة (درجة الحموضة 7.4، 10 ميكرون نيجيريسين) للتصوير جيدا مع ماصة 200 ميليلتر. إزالة الحل من التصوير جيدا مع الماصة، ثم استبدل ميليلتر 200 آخر حل المعايرة. كرر هذه العملية 4 مرات لضمان تبادل الحل الكامل.
    3. احتضان الإعداد في حل المعايرة لمدة 30 دقيقة قبل التصوير. كرر البروتوكول التصوير باستخدام معلمات نفس العزم في خطوات 6.6 6.11، مع تعديل فقط 1 دقيقة للصورة التقاط.
       ملاحظة: نظام التروية والشعيرات الدموية غير مطلوبة في هذه الخطوة، وينبغي أن يكون غير متصل بالتصوير جيدا لتجنب تعريض الشعيرات الدموية إلى نيجيريسين.
    4. إضافة 200 ميليلتر المعايرة المتكاملة (pH 9.0، 10 ميكرون نيجيريسين) للتصوير جيدا مع ماصة 200 ميليلتر. إزالة الحل من التصوير جيدا مع الماصة، ثم استبدل ميليلتر 200 آخر حل المعايرة. كرر هذه العملية 4 مرات لضمان تبادل الحل الكامل.
    5. احتضان الإعداد في الحل المعايرة الثانية لمدة 10 دقائق قبل التصوير. تكرار التصوير البروتوكول كما هو الحال في الخطوة 6.13.3.
    6. استعراض المكدس الصورة التي تم التقاطها في صورة تحليل البرامج للتأكد من أن لا بكسل في قناة أما المشبعة بالنقر فوق "يعني العائد على الاستثمار" والتمرير على الرغم من المكدس الصورة مع المنزلق "الإطار" مع ملاحظة أن الإبلاغ عن أية قيم في الرسم البياني كثافة الوصول إلى الحد الأقصى لقيمة قابلة للاكتشاف. إذا كان أي إطارات تحتوي على وحدات بكسل التي تصل إلى أقصى شدتها يمكن كشفها، الحد من شدة التعرض الوقت أو الإضاءة وتكرار القسم 6.
       ملاحظة: وبمجرد إنشاء لا تقم بتغيير معلمات التصوير بين تجارب أو المعايرة إذا لم تكن نقطة معايرات لاستخدامها في إعداد كل (راجع الخطوة 8.3).
14. تحليل المكدس صورة الرسم في شدة الفلورسنت ونسبة الأسفار (SEpH/مشري) كدالة للزمن.
    1. انقر فوق "" يعني "عائد الاستثمار" وحدد الأداة شكل حر. اضغط الأيسر لتتبع طول ~ 50 ميكرون من mt. الحق انقر لإنهاء رسم العائد على الاستثمار، ثم كرر في منطقة مجاورة للنقل المتعدد الوسائط لتحديد خلفية عائد الاستثمار (الشكل 5A).
    2. انقر فوق "متوسط كثافة" تحت "القياسات." إنشاء جدول لقيم الكثافة بواسطة النقر فوق "تصدير > جدول البيانات > إنشاء."
    3. انقر على رمز الترس التكوين وإلغاء تحديد كافة المعلمات فيما عدا "تايم" و "تعني كثافة". زر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب لجدول البيانات الذي تم إنشاؤه حديثا وحدد "حفظ باسم"، وتصدير البيانات كملف.csv.
       ملاحظة: قياسات مماثلة يمكن أيضا أن استخدام البرمجيات الحرة مثل إيماجيج.
    4. افتح جدول جدول بيانات واستيراد جدول البيانات عن طريق تحديد علامة التبويب "البيانات"، تليها "من النص".
    5. استخدام الدالات في جدول البيانات للطرح كثافة الخلفية SEpH من "كثافة SEpH إشارة" عند كل نقطة في الوقت. كرر هذه العملية للإشارة مشري.
    6. ارسم كل كثافة قناة كدالة للزمن بتحديد الأعمدة التي تحتوي على الوقت وكثافة الخلفية لتصحيح البيانات وثم النقر فوق "إدراج > مبعثر (المخططات) > مبعثر بخطوط مستقيمة" (الشكل 5 (ب)).
    7. استخدام دالات جدول البيانات لحساب نسبة SEpH/مشري fluorescence في كل نقطة من الزمن.
    8. نسبة الأسفار الأرض كدالة للزمن بتحديد الأعمدة التي تحتوي على بيانات الوقت ونسبة وثم النقر فوق "إدراج > مبعثر (المخططات) > مبعثر بخطوط مستقيمة" (الشكل 5).

7-كامل معايرة فري في الأنابيب Malpighian فيفو السابقين.

1. تشريح وتركيب مجموعة جديدة من النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية كما هو موضح في القسم 5.
2. تبادل المتكاملة للمعايرة المتكاملة (درجة الحموضة 7.4، نيجيريسين 10 ميكرون) كما هو موضح في الخطوة 6.13.2. احتضان لمدة 30 دقيقة.
3. تحديد موقع النظام التجاري المتعدد الأطراف وجمع أزواج من الصور SEpH/مشري كما هو موضح في الخطوات 6، 1-6، 11. استبدال الحل مع أسهم أخرى للمعايرة المتكاملة كما هو موضح في الخطوة 6.13.4، انتظر 10 دقائق، والصورة مرة أخرى. كرر هذه العملية حتى نسبة SEpH/مشري قد تم تصويرها في جميع الحلول. الحصول على درجة الحموضة الصور 9.0 آخر كما العينة نادراً ما يسترد من درجة الحموضة العالية.
4. مؤامرة fluorescence نسبة SEpH إلى مشري من التحديدات في ثماني عينات آخر كدالة للأس الهيدروجيني المفروض_أنا كما هو موضح في الخطوة 6.14.9. احتواء البيانات المعايرة مع منحنى بولتزمان للحصول على وظيفة كاملة المعايرة وفقا للمعادلة 1 (الشكل 5). إذا كانت البيانات غير متناسقة، ارسم معايرة مجموعات من كل عينة تطبيع أن يقابل نسبة الأسفار من 1.0 للأس الهيدروجيني_i 7.0 وإعادة تحليل (الشكل 5E).
   ملاحظة: إذا كانت العملية الأخيرة ضروري سوف تحتاج التجارب الفردية الخاصة بهم معايرات نقطة الداخلية³³ (انظر الكمي الإجراء التالي (الخطوة 8.3)).
5. معادلة 1
   
   حيث R = نسبة SEpH/مشري و₁،₂، س_سو dx المنحنى المناسب معلمات يمثلون نسبة الأسفار الحد الأدنى ونسبة الحد الأقصى الأسفار، فك، وعرض وظيفة على التوالي. x_س = الظاهر فك من فري، التي يمكن أن تختلف بين 7.1 و 7.4 تبعاً لنوع الخلية وشروط المعايرة الدقيقة.

8-التحديد الكمي لقذف حمض Basolateral من السابقين فيفو أنبوب Malpighian ابيثيليا.

1. معربا عن فري الرئيسي للصورة فري-الإعراب عن الخلايا النجمية والخلايا في وقت واحد.
   1. تشريح MTs الأمامي من ذبابة UAS-فري/كبار-GAL4 كما هو موضح في القسم 5، ولكن لا يتم نقل النظام التجاري المتعدد الأطراف من المتوسطة لشنايدر تشريح لتصوير جيدا.
   2. تشريح MTs الأمامي من ذبابة UAS-فري/c724-GAL4 في طبق تشريح نفسه باستخدام الإجراء المبين في القسم 5.
   3. نقل مجموعات 2 من النظام التجاري المتعدد الأطراف في نفس التصوير جيدا كما هو موضح في الخطوات 5.8-5.11.
      ملاحظة: عندما تجتاح بالأسلحة للنظام التجاري المتعدد الأطراف وصولاً إلى الشريحة، وضع النظام التجاري المتعدد الأطراف UAS-فيري/c724-GAL4 والأنابيب UAS-فيري/كابار-GAL4 القرب من بعضها البعض حتى يمكن تصور الخلايا الرئيسية وتلعبه معربا عن فيري في (الحقل نفسه الشكل 6A).
2. تطبيق NH₄Cl بريبولسي كما هو موضح في الخطوة 6.12.
   ملاحظة: إذا كان لا يمكن معايرة متسقة (الشكل 4 باء)، إجراء معايرة نقطة بتعيين pH_i إلى 7.0 في نهاية كل تجربة المعايرة المتكاملة (pH 7.0، 10 ميكرون نيجيريسين، حضانة 30 دقيقة) بعد لاصقة تم إزالة مقسم نضح-جيدا والمعدات التروية.
3. معايرة آثار من الخلايا النجمية والرئيسية لمختلف قطاعات النقل المتعدد الوسائط (باستخدام نسبة مطلقة أو تم تسويتها حسب الاقتضاء) مع 2 المعادلة وتحليل مرحلة الانتعاش بعد انسحاب Cl NH₄عن طريق تطبيق الدالات تحلل أسي باستخدام برامج التحليل الإحصائي، وإذ تلاحظ ثابت الانحلال (τ) (الشكل 6B).
   المعادلة 2
   
   حيث R = نسبة SEpH/مشري و₁،₂، س_سو dx منحنى معلمات المناسب يحدده المعايرة في الخطوة 7، 4 (المعادلة 1).
   1. حساب معدل البثق حمض (J_{H +}، راجع المعادلة 3) كدالة لدرجة الحموضة_أنا لمراعاة الاختلافات في استراحة الأس الهيدروجيني_أنا وحمض تحميل بين الأعمال التحضيرية³⁴. استخدام الدوال الأسية المستمدة في خطوة 8.3 لحساب المشتقة من درجة الحموضة_أنا فيما يتعلق بالوقت في الفترة الزمنية لكل.
      المعادلة 3
      
   2. حساب سعة التخزين المؤقت المضمنة (β_i؛ المعادلة 4) من سيتوسول في درجة الحموضة_أنا من بداية كل فاصل زمني في خطوة 8.3.1 استناداً إلى المؤلفات السابقة (انظر 4 المعادلة).
      ملاحظة: في المورفولوجية، توصيف أدق β_أنا يأتي من المحطات الطرفية الأعصاب الحركية اليرقات³⁵ ويمكن افتراض هذه البيانات لخلايا طن متري في غياب البيانات الأخرى المتاحة.
      المعادلة 4
      
   3. حساب ناتج β_T (من الخطوة 8.3.2)_{و أنا}dpH/dt (من الخطوة 8.3.1) لتحديد J_{H +} (3 المعادلة).
      ملاحظة: في حلول خالية من بيكربونات اسمياً مثل تلك المبينة في هذا البروتوكول، المستمدة من بيكربونات التخزين المؤقت قدرة (β_ب) يفترض أن تكون ~ 0 ملم. مجموع التخزين المؤقت قدرة (β_T) هو مجموع β_{أنا βب}، وهكذا β_{أنا =} β_T في غياب HCO₃^–/CO₂³⁶.
   4. ارسم ي_{ح +} كدالة درجة الحموضة_وأنا في بداية كل الفاصل الزمني كما هو موضح في الخطوة 6.14.9.
   5. تطبيق مهام تحلل أسي على الجزء من جميع مجموعات البيانات التي تتداخل في الأس الهيدروجيني_وأنا باستخدام برامج التحليل الإحصائي. مقارنة معدلات تغير الوظائف الناتجة عن ذلك لمقارنة معدلات البثق حمض بين الخلايا وقطاعات النقل المتعدد الوسائط (الشكل 6).
      ملاحظة: أنسب الدالة المستخدمة لتركيب المنحنى قد لا دائماً تكون واحد أسي. وظائف أخرى يمكن أن تكون بديلاً إذا أنها تحسن الخير صالح.
   6. حساب حمض الجريان (انظر المعادلة 5) كدالة لدرجة الحموضة_أنا لمراعاة الاختلافات في حجم الخلية والشكل.
      المعادلة 5
      
      ملاحظة: أبعاد الخلية يمكن أما قياس مباشرة في الصور أو الاقتراب منها. ويمكن تمثيل الخلايا الرئيسية نصفين أنبوب مجوف مع الأبعاد التالية: القطر الداخلي 24 ميكرومتر؛ القطر الخارجي 48 ميكرومتر؛ ارتفاع 50 ميكرومتر. الانتقالية النجمية الخلايا المتغيرة ولكن يمكن أن تمثل تقريبا كالأسطوانات مع ارتفاعات من 50 ميكرومتر وأقطار من 10 ميكرون. انظر الفقرة الأخيرة من الممثل النتائج أدناه.
   7. تطبيق مهام تحلل أسي على الجزء من جميع مجموعات البيانات التي تتداخل في الأس الهيدروجيني_وأنا باستخدام برامج التحليل الإحصائي. مقارنة معدلات تغير الوظائف الناتجة عن ذلك لمقارنة تدفقات حمض بين الخلايا وقطاعات النقل المتعدد الوسائط (الشكل 6).

الأنسجة السليمة والتحديد السليم للنظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية أمران حيويان لنجاح هذا البروتوكول. أثناء التشريح، ينبغي الحرص على اتصال غير مباشر النظام التجاري المتعدد الأطراف والمؤشر الوحيد لهم الحالب كالتي تجتاح النظام التجاري المتعدد الأطراف مباشرة سوف يؤدي إلى الكسر (الشكل 4A– ب). عندما اجتاحت MTs شقة على الشريحة، ويجب أن تطرق الأنابيب بأقل قدر ممكن والحركة الزائدة تجنبها كهذا سيضر على طبقة أحادية الخلايا الظهارية (الشكل 4). تشريح بشكل صحيح سوف تظهر MTs الأمامي حتى توزيع الأسفار كل من الأحمر والأخضر عن طريق سيتوسول الخلايا الظهارية وقطاعات أنبوب شكلياً متميزة. الأنابيب التي تضررت التروية غير لائق أو امتهان سيتم عرض تجميع الأسفار أحمر مع لا المجاميع الخضراء المزدوجة، وسوف تظهر تعريف MTs الخلفي مورفولوجيا موحدة من نهاية أعمى الدانية إلى الحالب القاصي (الشكل 4) . 

يجب تأكيد وظيفة مناسبة من فري الفسيولوجية على الرغم من التقييم فضلا عن مورفولوجيا. الأسلوب الأكثر ملاءمة لتأكيد الاستشعار عن درجة الحموضة المناسبة لتطبيق NH₄نبض Cl. في ظل هذه الظروف SEpH الخضراء إشارة ينبغي تقرير التغييرات المتوقعة من الأس الهيدروجيني (ارتفاع في درجة الحموضة_أنا خلال النبض ك NH₃ يدخل الخلية، انخفاضا تدريجيا خلال النبض NH₄⁺ يدخل عن طريق ناقلي ك⁺ و القنوات، وتحمض السريع والانتعاش التدريجي عند NH₄Cl انسحاب²¹، بينما إشارة حمراء مشري ينبغي أن تظل ثابتة (الشكل 5A– ب). حجم التغييرات في إشارة SEpH سوف تختلف مع البروتوكول ونوع الخلية، ولكن إشارة متشيري ينبغي أن يكون مستقرا في جميع الحالات. التغييرات في إشارة مشري أثناء تجارب فردية تشير إلى حركة القطع الأثرية أو توليد التدريجي لاستشعار المجاميع بسبب تلف الخلايا. هذا الأخير سوف يمنع القياس الكمي لدرجة الحموضة_أنا ويجب تجنبه. عند إكمال NH₄نبض Cl من المهم القيام بمعايرة النقطة 2 (ستوجز المعايرة، ودرجة الحموضة 7.4 و 9.0، 10 ميكرون نيجيريسين) لتأكيد يستريح حموضة_أنا قرب 7.4 والتأكد من أن المعلمات التصوير الحالي لا يؤدي إلى تشبع الأسفار الكشف عند تكبير fluorescence في pH 9.0 (الشكل 5). إذا كان يستريح الأس الهيدروجيني أقل بكثير من 7.4، البروتوكول ينبغي أن تتكرر مع صحة النظام التجاري المتعدد الأطراف؛ وإذا كان يحدث التشبع في pH 9.0، يجب تكرار البروتوكول مع أقل وقت كثافة أو التعرض للضوء. حالما يتم تحديد معلمات التصوير الكافي، أنهم لا ينبغي تغيير بين تجارب أو معايرات إذا كانت نسب fluorescence المطلق لاستخدامها. بينما طبيعة الزائفة-راتيوميتريك فري يمكن أن توفر وسيلة لتصحيح الحركة في الأعمال التحضيرية المعرضة للحركة أو التغييرات في قطر الخلية، يتطلب التحديد الكمي المطلق لدرجة الحموضة_أنا الارتباط الكامل المنتظم من فري SEpH/ مشري نسبة إلى درجة الحموضة_وأنا من خلال هذا الأسلوب ك⁺ نيجيريسين/عالية. معايرة فري في استعدادات صحية ينبغي أن ينتج منحنيات المعايرة متسقة مع الظاهر فك من 7.1-7.4 تبعاً لظروف الخلية نوع والمعايرة (الشكل 5). الأعمال التحضيرية في أي مشري التجميع أمر لا مفر منه، تطبيع نسبة القيم بنسبة 1.0 fluorescence يناظر الرقم الهيدروجيني_أنا 7.0 ينبغي أن تسفر عن نتائج مماثلة (الشكل 5E). إذا كان يتم استخدام معايرات نقطة ومنحنيات طبيعية، تصوير معلمات يمكن أن يكون الأمثل لكل إعداد. 

يمكن استخدام معايرة درجة الحموضة_أنا آثار مقارنة الرقم الهيدروجيني إليه تنظيمية بين أنواع الخلايا. يمكن استخدام نظام GAL4/UAS التعبير في المورفولوجية للتعبير عن فري في الخلايا الرئيسية والخلايا النجمية من MT الأمامي (الشكل 6A). يمكن تقييم درجة الحموضة_أنا التنظيم بالخلايا حمض-تحميل مع NH₄Cl البقول وقياس معدل درجة الحموضة_أنا الانتعاش. يمكن أن يتحقق هذا بتقريب الدوال الأسية لمرحلة الانتعاش في ظروف تجريبية مختلفة لاستخراج ثابت الانحلال (τ) كما سيتم عرض الخلايا مع زيادة سرعة ح⁺ افلوكس انتعاش سريع أكثر (و وبالتالي انخفاض قيم τ). استناداً إلى هذا التحليل، يبدو الخلايا النجمية من MT البثق حمض أقوى من الخلايا الرئيسية (الشكل 6B). سوف يعقد هذا التحليل طالما يستريح الأس الهيدروجيني_وأنا، على قدر من حمض التحميل والتخزين المؤقت قدرة مماثلة بين المجموعات التجريبية. ومع ذلك، عند عدم استيفاء هذه الشروط، ضروري لمراعاة هذه الملاحظة أن قدرة التخزين المؤقت المضمنة سيتوسول (β_i) من العديد من الخلايا نفسها تعتمد على درجة الحموضة^35،،من³⁷³⁸ وهكذا معدل درجة الحموضة_أنا التغير في الرقم الهيدروجيني مختلفة_i قد لا تكون قابلة للمقارنة مباشرة. وفي مثل هذه الحالات، تناسب المنحنيات الأسية النتوء حمض المرحلة التالية يمكن استخدامها NH₄نبض Cl وتقديرات سبق تحديدها من قدرة التخزين المؤقت المضمنة (β_i) الأرض بمعدل البثق حمض (J_{H +}) كدالة لدرجة الحموضة_أنا وتحديد تعويض معدل البثق حمض (المعادلات 3 و 4). متى تحسب الاختلافات في حمض تحميل ويستريح الأس الهيدروجيني_وأنا ، لأنه من الواضح أن قذف حمض في الخلايا الرئيسية للجزء الانتقالي تتجاوز الخلايا النجمية (الشكل 6). بينما مقنعة، هذا التحليل لا يتناول أن قياس درجة الحموضة_أنا دالة لحجم حين قذف حمض عبر غشاء البلازما دالة لمساحة سطح الغشاء. تقسيم J_{H +} بمساحة السطح إلى نسبة حجم الخلية للفائدة سوف تسفر عن القيم في جزيئات مكافئات حمض وحدة المساحة السطحية كل وحدة زمنية (المعادلة 5)، مما يسمح لتصحيح الاختلافات في حجم الخلية ومورفولوجيا. حوالي اثنين من الخلايا الرئيسية تشمل محيط MT في قطاعات الانتقالية وهكذا يمكن على غرار الخلايا المفردة كنصف أنبوب (القطر الداخلي 24 ميكرومتر؛ ميكرومتر 48 القطر الخارجي؛ وارتفاع 50 ميكرومتر). الخلايا النجمية أصغر حجماً وتميل إلى أن تكون على شكل شريط في الجزء الانتقالي²طن متري. من الصعب التحديد الكمي الدقيق لمساحة وحجم ولكن تقريبية حتى المحافظ الانتقالية الخلية النجمية الشكل (اسطوانة بارتفاع 50 ميكرون ويبلغ قطرها 10 ميكرون) تشير إلى مساحة لنسبة حجم يقل عن 2 × من الخلايا الرئيسية. مع أخذ هذا في الاعتبار ويكشف أن تدفق حمض الخلية النجمية هي إلى حد كبير أقل من الخلايا الرئيسية الانتقالية، وفي الواقع نهج من الخلايا الأولية الجزء الرئيسي (الشكل 6).

الشكل 4: تشريح للأنابيب مالباييان الأمامي الكبار المورفولوجية .
أ-التمثيل التخطيطي لإزالة طن متري الأمامي مع 2 زوجاً من الملقط غرامة في المتوسط مبردة شنايدر. "ألف أنبوب" = جبل الأمامي "ص أنبوب" = جبل الخلفي ب. عملية استرداد وتصاعد استخراج MTs باستخدام قضبان رقيقة من الزجاج. ج. استخراج عملية التقيد بطول كامل من النظام التجاري المتعدد الأطراف إلى شريحة لتقييم التصوير والفسيولوجية. د. صور ويديفيلد الممثل SEpH (470/510 نانومتر السابقين/م) ومشري (556/630 نانومتر السابقين/م) مكونات UAS-فري يقودها كبار-GAL4 التي تصور سليم الأمامي MTs MTs الأمامي تضررت من نقص التروية، و ضريبي الخلفي "mts. علما" أن عرض MTs الأمامي صحية واضحة متوسعة أعمى أولى قطعة، قطعة انتقالية مقيدة نسبيا زيادة التعبير عن فري UAS عندما يقودها كبار-GAL4، ورئيسي القاصي الجزء. تلف النظام التجاري المتعدد الأطراف عرض المجاميع ملحوظ من الأسفار متشيري مع لا الأسفار SEpH المقابلة. النظام التجاري المتعدد الأطراف الخلفية موحدة في قطر مع لا جزأين متمايزين شكلياً. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5: التحقق ومعايرة فري في "الأنابيب مالباييان".
A. صور ويديفيلد الممثل SEpH (470/510 نانومتر السابقين/م) ومشري (556/630 نانومتر السابقين/م) مكونات من فري UAS يقودها كبار-GAL4 التي تصور سليم الأمامي mts. "عائد الاستثمار" إشارة علامات منطقة فائدة. "حرس الحدود" علامات المنطقة الخلفية للاهتمام الذي طرح في وقت لاحق من إشارة عائد الاستثمار في القناة نفسها. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. ب. التغييرات fluorescence النسبي في إشارات SEpH ومشري من فري في الاستجابة إلى 20 s 40 مم NH₄نبض Cl. لاحظ أن الإشارة مشري مستقرة بينما يعرض إشارة SEpH بزيادة مميزة خلال النبض (يدل على الكاليزيشن، أي زادت درجة الحموضة_أنا) وانخفاض حاد عند تبييض (تشير إلى التحمض، أي انخفضت درجة الحموضة_أنا). ج. حساب نسبة الأسفار من فري (SEpH/مشري) من البيانات في ب مع بيانات إضافية بعد 30 دقيقة حضانة في المعايرة المتكاملة (10 مكم نيجيريسين، 130 مم ك⁺، ودرجة الحموضة 7.4 و 9.0). د-منحنى المعايرة التي شيدت من نسبة فري المطلق (SEpH/مشري) دالة من المفروض درجة الحموضة_أنا أثناء التعرض لمعايرة ستوجز مخزنة مؤقتاً إلى واحدة من ثماني قيم الأس الهيدروجيني. دوائر رمادية هي القيم الفردية النموذج 8 الأعمال التحضيرية. هي مربعات سوداء وأشرطة يعني ±SD. منحنى بولتزمان صالح. ه-نفس البيانات كما هو الحال في د تطبيع هذه هو أن نسبة الأسفار في درجة الحموضة 7.0 1.0. يتم تعديل المنحنى منحنى سيجمويدال تناسب (راجع الخطوة 7، 4، 1 المعادلة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 6: القياس الكمي لحمض البثق في ابيثيليا ومالباييان.
أ. صورة ويديفيلد من الأسفار SEpH (من فري) في الخلايا الرئيسية من MT الأمامي (يسار، مدفوعة بسائق كبار-GAL4 ) والخلايا النجمية من MT الأمامي (يمين، مدفوعا ب c724-GAL4). نلاحظ أن الخلايا النجمية هي على شكل شريط في الجزء الأول، متغير في الجزء الانتقالي، وعرض الإسقاطات الخلوية متميزة في الجزء الرئيسي. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. ب. معايرة درجة الحموضة_أنا التغيرات في الاستجابة إلى 20 s 40 مم NH₄نبض Cl في مناطق الاهتمام التي تتم الإشارة إليها في (خلايا رئيسية الجزء الانتقالي والخلايا الرئيسية من الجزء الأول، والخلايا النجمية الجزء الانتقالي). منحنيات متقطعة تدل على تطبيق واحد يناسب الأسى إلى مرحلة الانتعاش حمض عقب NH₄انسحاب Cl تستمد منها قيم ثابتة (τ) تسوس المعلن. ج. معدل البثق حمض (J_{H +}) المرسومة كما درجة حموضة دالة_i المستمدة من إس يناسب المشاهدة في باء. راجع الخطوة 8.3.1 J_{H +} حساب (3 المعادلة). منحنيات متقطع أسي يلائم المطبقة على كل قطعة بيانات داخل منطقة تداخل الحموضة_أنا النطاق المرمز إليه بواسطة مربع رمادي. د. تدفق حمض المرسومة حسب درجة حموضة دالة_i المستمدة من إس يناسب المشاهدة في ب و 5 المعادلة. منحنيات متقطع أسي يلائم المطبقة على كل قطعة بيانات داخل منطقة تداخل الحموضة_أنا النطاق المرمز إليه بواسطة مربع رمادي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: حلول يطير التجريبية.
وتعد الحلول المتكاملة في درجة حرارة الغرفة ويتم تعيين الرقم الهيدروجيني بالمعايرة مع HCl وهيدروكسيد الصوديوم. الحل المعايرة هو معاير مع HCl ونمدج. المخزن المؤقت للحل معايرة يتنوع استناداً إلى درجة الحموضة المطلوبة [2-(ن-morpholino) حمض اثانيسولفونيك (MES) للأس الهيدروجيني = 4.0-6.0؛ 4 حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (هيبيس) للأس الهيدروجيني = 6.5-7.5؛ ن-[تريس (هيدروكسيميثيل) الميثيل]-3-حمض أمينوبروبانيسولفونيك (الصنابير) للأس الهيدروجيني = 8.0 9.0]. كافة القيم في ملم، فيما عدا الأس الهيدروجيني (انيتلس) وأوسمولاليتي (mmol/كغ). نيجيريسين الأسهم في [دمس] يضاف إلى حلول المعايرة لتركيز 10 ميكرون فقط قبل الاستخدام نهائي.

الجدول 2: قائمة جيفيس سيتوسوليك المنشورة
ماكسيما الإثارة، ماكسيما الانبعاثات والظاهر فك قيم تقريبية ويمكن أن تختلف تبعاً لنظام التعبير وتقنية التصوير وأسلوب المعايرة. فليم = عمر fluorescence التصوير المجهري. نير = القرب من الأشعة تحت الحمراء.

نجاح التحديد الكمي لدرجة الحموضة_وأنا في MTs المورفولوجية يعتمد كلياً على صحة المستخرجة من النظام التجاري المتعدد الأطراف ونوعية تركيب وتشريح (الشكل A – ج). وهكذا، المعالجة الدقيقة للأنسجة كوصف الحتمي. شرائح طازجة مغلفة في PLL إلى حد كبير المعونة MT تصاعد كما أنها تميل إلى أن تكون لاصقة أكثر بكثير من الشرائح التي تعرضت سابقا للحل. التركيب الدقيق وسوف تساعد أيضا في تحديد طن متري جزأين متمايزين (الشكل دال). تيسير MTs صحية المعايرة فري والتقييم الوظيفي بالحد من التراكم مشري والغلة الكمي أكثر اتساقا لقذف حمض، على التوالي. وفي بعض الحالات، تجنب التجميع متشيري لا يمكن الظروف التجريبية طبيعتها الضرر ابيثيليا طن متري أو إنتاج هامة التعبير المفرط للمراسل الفلورسنت. وفي هذه الحالات، تطبيع بمعايرة زائفة-راتيوميتريك أن يتوافق مع نسبة الأسفار 1.0 إلى درجة الحموضة_أنا 7.0، وسوف تسمح معايرات نقطة القياس الكمي (الشكل الإلكتروني). وينبغي توخي الحذر عند إجراء التحديدات نقطة لتجنب تعريض العناصر الدائمة نظم التصوير ونضح نيجيريسين كما إيونوفوري سوف تلتزم بالزجاج والبلاستيك. معايرة راتيوميتريك الزائفة حتى لا يمكن للظروف التي يدفع تلاعب تجريبية الأضرار الخلوية أثناء تجربة، أي سوف يسبب هذا الضرر تدريجي واضح زيادة في الأسفار مشري في جميع أنحاء هذه التجربة. في هذه الحالات لاحقاً، يمكن استخدامها مع منحنى معايرة تطبيع إشارة fluorescence SEpH وأشر معايرات، مع التحذير بأن التصوير سيتم تصحيح لم يعد للتحف الحركة والتحولات المحورية.

جيفيس تحمل العديد من القيود العامة بالمقارنة مع التحديد الكمي لدرجة الحموضة_وأنا مع الأصباغ الفلورية. الاحتفاظ بصبغة يمكن أن تستخدم كمؤشر للغشاء النزاهة وخلية الصحة³⁹، ولكن لا ما يعادل المقايسة متوفرة للاستخدام جيفيس. على هذا النحو، يجب رصد صحة إعداد وسائل مستقلة إذا تلف الخلايا ومن المتوقع لإرباك النتائج. جيفيس يحتمل أن تسمح بالتصوير من الحد الأدنى من الانزعاج في فيفو الاستعدادات لكن سلامة الأنسجة طبيعته يحد من التلاعب التجريبية، ويمكن أن تجعل نقطة معايرات مستحيلة. قيد محدد آخر الكامنة في استخدام فري ومؤشرات الأس الهيدروجيني fluorophore المزدوج سيتوسوليك أخرى (مثل كلوفينسور⁴⁰) التي تستمد ميل fluorophores اثنين إلى تبديل هذه الأسفار مستقلة عن بعضها البعض ودرجة الحموضة . طلب تقديم العروض تجميع القطع الأثرية أهم مظاهر هذا القيد، ولكن القياس الكمي يمكن أن يثير الشبهة أيضا من فوتوبليتشينج فلوروفوريس أحدهما أو كليهما. وهكذا التصوير البروتوكولات الكثير أن يتكيف مع تقليل فوتوبليتشينج، الذي يمكن أن يؤدي إلى التعرض لأوقات طويلة ومعدلات اقتناء < تحولات 0.2 مرات التعرض الطويل هرتز. ستفشل لتقرير درجة الحموضة السريع_أنا . الأسفار SEpH يبين العلاقة الخطية إلى درجة الحموضة_أنا من الأس الهيدروجيني 6.8-7.8 في معظم الأعمال التحضيرية، ولكن دقة هذه القياسات يعتمد على دقة هذا الأسلوب ك⁺ نيجيريسين/عالية. نيجيريسين بمثابة ionophore/H ك⁺⁺ والمعايرة السليم يعتمد على اكويليبراتينج خارج الخلية مع داخل الخلايا [ك⁺] [ك⁺]. تقديرات من داخل الخلايا [ك⁺] ليست متاحة أو يسهل الحصول عليها لجميع النظم التجريبية. دقة درجة الحموضة_أنا الكمي ستكون موثوقة كتقديرات لداخل الخلايا [ك⁺]، على الرغم من أن معدلات التغير النسبي في درجة الحموضة_أنا سوف تكون متسقة. ونظرا لهذا القيد والعلاقة العكسية لوغاريتمي لدرجة الحموضة_وأنا إلى داخل الخلايا [ح⁺]، دائماً الأفضل لإبلاغ البيانات كمعدلات التغير في درجة الحموضة_أنا، معدل البثق حمض (J_{H +}، الشكل 6)، أو حمض التمويه (الشكل 6) بدلاً من التغيرات المطلقة في الأس الهيدروجيني_وأنا. تحليل البيانات حسب تدفق حمض له فائدة إضافية لتصحيح الاختلافات في السطح نسبة الحجم بين أنواع الخلايا.

يجب أن يكون موضع تقدير محاذير عدة عند تفسير البيانات من الكبار يطير إعداد MT الموصوفة في هذا البروتوكول. التمييز المورفولوجي الأولية والانتقالية، والأجزاء الرئيسية من المرجح تبسيط التنوع الحقيقي للمجالات الوظيفية والوراثية الحالية في النظام التجاري المتعدد الأطراف². وعلاوة على ذلك، بينما تم تصميم هذا البروتوكول للكشف عن الوظيفة للناقلين حامض باسولاتيرال فمن الممكن أن النقل قمي يمكن أن يؤثر pH_i القياسات، وكذلك. ختم الحالب عند تركيب النظام التجاري المتعدد الأطراف (الخطوة 5.9) يضمن أن تبادل الحلول أساسا تحدث في السطح basolateral لكن حركة الفقرة الخلوية وقمي أيونات قد لا يزال التأثير pH_i كما يغير النقل باسولاتيرال في نهاية المطاف هيولى الجانب من التجويف/سيتوسوليك أيون التدرجات. الفصل المطلق بين قمي ويمكن إنجازه الدالة باسولاتيرال التي بيرفوسينج بشكل مستقل لومينال والأسطح باسولاتيرال طن متري ولكن هذه الأساليب يطالبون أكثر بكثير من الناحية التقنية كما أنها تتطلب ميكروبيبيتي كانوليشن⁴¹ .

جيفيس يقدم مزايا عديدة أكثر من الطرق التقليدية لقياس درجة الحموضة_وأنا، وتتضخم هذه القوة عندما جنبا إلى جنب مع قابلية تطويع الوراثية ومنخفضة التكلفة لإعداد المورفولوجية طن متري. التحديد الكمي لدرجة الحموضة_أنا تاريخيا اعتمد على صبغات الفلورسنت مثل (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (بسيكف)²² أو تقييم الكهربية معقدة عبر أقطاب الأيوني الانتقائي^{20 ،21}. حيث يتم ترميز فري وراثيا، فإنه يمكن التعبير عنها في فئات معينة من السكان الخلوية من المروجين محددة (كما هو موضح هنا في الخلايا الرئيسية والخلايا النجمية من MT، الشكل 6) وقابلة للاستخدام في أي أنسجة رهنا ترانسجينيسيس، تعداء، أو العدوى الفيروسية بوساطة. الأصباغ محدودة بتكلفة الاستعدادات الفردية ويحتمل أن تكون معقدة تطبيق بروتوكولات الذي ينقل لا خصوصية الخلية في الأنسجة غير متجانسة. أقطاب الأيوني الانتقائي يتطلب معدات متخصصة لتصنيع والقياس، بينما يتطلب فري ويديفيلد فقط ابيفلوريسسينت المجهري مع التقليدية التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض تصفية مجموعات. استخدام الأصباغ واقطاب تستلزم المادية فضلا عن الوصول البصرية للأنسجة للفائدة بينما يمكن رصد جيفيس في الأنسجة المستخرجة حديثا وعلى مر الزمن في فيفو. الفرصة لتصوير مباشر في الأعمال التحضيرية سليمة باهتمام خاص عند تقييم الفيزيولوجيا الخلوية لدرجة الحموضة_أنا التنظيم لا تكنولوجيا أخرى يسمح التحديد الكمي لدرجة الحموضة_وأنا حضور التخزين المؤقت المحلية الآليات.

يعرض إعداد MT الكبار المورفولوجية العديد من السمات الجذابة للراغبين في النقل التنظيم وأيون الخلوية الأس الهيدروجيني. تربية المورفولوجية غير مكلفة وأدوات مثل بيوسينسور ترميز وراثيا بنيات وإدراج التعبير [رني] متوفرة بسهولة من مجموعة متنوعة من مراكز الأسهم (بلومينغتون المورفولوجية الأسهم مركز جامعة إنديانا؛ مركز أبحاث فيينا المورفولوجية ). المورفولوجية وتتكون من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية الاستقطاب، يجعلها مثالية للتحقيق في نقل أيون ترانسيبيثيليال النظام التجاري المتعدد الأطراف. نقل Basolateral يمكن أن تكون بسهولة جزيئي (كما أثبت هنا) لكن تقييم كامل قمي وحركة أيون باسولاتيرال ممكن مع ميكروبيبيتي كانوليشن⁴¹. بالإضافة إلى ذلك، وظيفة الجهاز فحوصات رامزي إفراز الإنزيم¹⁷ و ترسيب أكسالات الكالسيوم لومينال¹⁸ هي تتسم جيدا، والسماح للعلاقة المتبادلة بين الظهارية الفيزيولوجيا الخلوية لنماذج إفراز السوائل و نيفروليثياسيس، على التوالي. توافر منخفضة التكلفة وواسعة للفحص المجهري ابيفلوريسسينت بينما هذه الميزات توفر فرصاً لتحليل متين، يجعل نموذج المورفولوجية MT مثالية لمظاهرات فيزيولوجيا الخلوية وكل جهاز في تدريس مختبرات.

إتقان أساليب هذه رخص الكمي تنظيم الأس الهيدروجيني_وأنا باسولاتيرال ح⁺ الجريان في MTs المورفولوجية الكبار، موجوداً بعد نقل نموذج قوي لايون ترانسيبيثيليال. استخدام جيفيس مثل فري يمكن تكييفها بسهولة لتقييم التنظيم_i درجة الحموضة في سائر أنواع الخلايا اللافقارية، مثقف خلايا الثدييات، والتحضيرات في فيفو . تطوير جيفيس الجديد المرجح تتبع من مؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا، مع الأجيال الجديدة التي تغطي الطيف المرئي، ومعالجة أوجه القصور الحالية مثل تجميع القطع الأثرية^{30،42، 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49}-جيفيس فعلا قد استخدمت على نطاق واسع لتقرير مصفوفة المتقدرية pH^50،51، وتوجد استراتيجيات تستهدف سوبسيلولار لتعريب أجهزة استشعار العوامل البيولوجية إلى هيولى⁵²، نواة ⁵³، حويصلات متشابك^12،43، و هيولى⁵⁴ والأسطح الخارجية للغشاء الخلوي البلازما⁵⁵ (انظر الجدول 2 للحصول على قائمة كواشف المنشورة). على هذا النحو أدوات تصبح متاحة سوف تسمح التكامل الرأسي من تنظيم الأس الهيدروجيني دون الخلوية مع الجوانب الأخرى للفيزيولوجيا الخلوية، مثل Ca^{2 +} المناولة والإشارات داخل الخلايا، ووظيفة الجهاز كله عبر مجموعة متنوعة من فقاريات والأعمال التحضيرية اللافقارية.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

هذا العمل كان يدعمها DK092408 المعاهد الوطنية للصحة وأيد T32-DK007013 DK100227 على أجر MFR.. الكتاب نود أن نشكر الدكتور جوليان داو أ. ت. GAL4 كابار و c724-GAL4 الأرصدة المورفولوجية . ونشكر أيضا يعقوب باء أندرسون للمساعدة في الحفاظ على الصلبان الطيران التجريبي.