Method Article
תחבורה יון הסלולר לעתים קרובות יכול להיות מוערך על ידי ניטור pH תאיים (pHאני). גנטית Encoded pH-אינדיקטורים (GEpHIs) לספק אופטי כימות תאיים pH בתאים ללא פגע. פרוטוקול זה פרטים כימות של החומציות תאיים באמצעות הסלולר שמחוץ לחיות-הדמיה של בקוריאנית Malpighian של דרוזופילה melanogaster עם pHerry, פסאודו-רציומטרי גנטית מקודד ה-pH-מחוון.
יון אפיתל תחבורה חיוני יון מערכתית הומאוסטזיס, כמו גם התחזוקה של מעברי צבע אלקטרוכימי הסלולר חיוני. החומציות תאיים (pHאני) מושפע על ידי מובילי יון רבים, ובכך ניטור pHאני כלי שימושי עבור הערכת פעילות המשלח. מודרני גנטית מקודד ה-pH-אינדיקטורים (GEpHIs) לספק כימות אופטי של pHאני בתאים שלמים בסולם סלולרית ו- subcellular. פרוטוקול זה מתאר כימות בזמן אמת של pH הסלולראני תקנה ב Malpighian בקוריאנית (MTs) של דרוזופילה melanogaster דרך שמחוץ לחיות הדמיה של pHerry, GEpHI פסאודו-רציומטרי עם pK מתאים היטב כדי לעקוב אחר שינויים pH ציטוזול. לעוף למבוגרים שחולצו MTs מורכבים חלקים נפרדים מורפולוגית והן מבחינה תפקודית של שכבה חד-תא epithelia, ו יכול לשמש מודל נגיש, צייתן גנטית לחקירה התחבורה אפיתל. GEpHIs מציעים כמה יתרונות על פני צבעי פלורסנט קונבנציונלי רגיש pH ואלקטרודות יון סלקטיבי. GEpHIs יכול תווית אוכלוסיות תאים נפרדים בתנאי מקדם המתאים רכיבים זמינים. תיוג זה שימושי במיוחד ב- ex-vivo ויוו, בחיי עיר ההכנות, אשר מטבעו הטרוגנית. GEpHIs גם היתר כימות של pHi ברקמות תקין לאורך זמן ללא צורך לצבוע חוזרות טיפול או רקמות הוצאתו. החיסרון העיקרי של GEpHIs הנוכחי הוא נטייה לצבור ב תכלילים cytosolic בתגובה נזק לרקמות ולבנות ביטוי יתר. חסרונות אלה הפתרונות שלהם, את היתרונות של GEpHIs הם הפגינו את פרוטוקול זה דרך הערכת התחבורה פרוטון (H.+) basolateral בתאי stellate ועקרוני נפרדים פונקציונלית של זבוב שחולצו MTs. טכניקות וניתוח תיאר בקלות להתאמה למגוון רחב של חוליות, הגעה ההכנות, ניתן לשנות את התחכום של וזמינותו של מעבדות להגדרה הסבוך של יון השטף דרך שנאים ספציפי.
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את כימות של החומציות תאיים (pHi) שימוש בקידוד גנטית pH-מחוון (GEpHI), להדגים כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך basolateral H+ תחבורה חרק מודל (נפטר ב- melanogaster) מבנה הכליות, צנורית Malpighian (MT). MTs לשמש הריקון של זבוב הפירות, דומים מבחינה תפקודית נפרון בתרבית של כבוד מפתח מספר1. MTs מסודרים 2 זוגות של בקוריאנית (anterior ואת אחורי) בית החזה, הבטן של הזבוב. הצינור אפיתל בתא יחיד של כל הר מורכב סמויה הפעיל העיקרי תאים עם ברורים הפסגה (luminal), basolateral (hemocoel) קוטביות, כמו גם תאי stellate intercalated. MTs הקדמי מורכבות 3 מורפולוגית, פונקציונלי, ומורחבים מקטעים נפרדים נכה, ובייחוד הראשונית קטע, קטע המעבר ואת הפרשה קטע הראשי, אשר מצטרף שופכן2 את המשקל הסלולר תחבורה טרנס-אפיתל יון לתוך לומן מושגת על ידי של קרום פלזמה הפסגה V-ATPase3 ו מחליף אלקלי-מתכת/H+ , כמו גם של basolateral Na+-K+-ATPase4, K פנימה-יישור+ ערוצי5, Na+-מונע Cl−/HCO3− מחליף (NDAE1)6ו- Na+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, ואילו תאי stellate לתווך Cl– ולהעביר מים8,9. מערכת הפיזיולוגיות זו מורכבת אך נגיש מספקת הזדמנויות מצוינות עבור חקירת מנגנוני הובלה יון אנדוגני בשילוב עם toolsets גנטיות והתנהגותיות מגוונות של דרוזופילה.
הרציונל עבור פרוטוקול זה היה לתאר מערכת גנטית חמרן ללמוד יון אפיתל תחבורה עם פוטנציאל לשילוב מתא כדי התנהגות וייצוא של כלים למערכות אחרות מודל. הביטוי של pHerry10GEpHI נגזר מן שילוב של ירוק מישור המילקה סופר רגיש pH pHluorin11,12 (ע) ו אדום mCherry pH-רגישות13, ב- MTs מאפשרת כימות של תחבורה H+ תאים בודדים MT דרך גבוהה K+/nigericin כיול טכניקה14. מובילי יון רבים עובר H+ מקבילות, כימות של החומציות תאייםאני משמש ייצוג פונקציונלי של יון תנועה באמצעות מגוון רחב של שנאים. מערכת מודל דרוזופילה MT מציע גם כלים רבי-עוצמה גנטי רקמות ספציפיות transgene15 ו RNA הפרעה (RNAi)16 הביטוי, אשר יכול להיות משולב עם הדמיה הסלולר ואת מבחני כולו אורגן17 , 18 , 19 של פונקציה צנורית כדי ליצור ערכת כלים חזקים עם אינטגרציה אנכית ממולקולות להתנהגות. זה סתירותיה מציבה ניגוד לחיים פרוטוקולים רבים אחרים עבור הערכת ביולוגיה אפיתל, כמו מדידות היסטורית כאלה צריכים לסמוך על מורכבות, מרתיעה אלקטרודות יון סלקטיבי ניתוח מיקרו, מתוחכם20,21, רגיש pH יקר צבענים22 עם דרישות הטעינה מגבילות וספציפיות הסלולר המסכן ברקמות הטרוגנית. GEpHIs היו בשימוש נרחב למדידת pHאני במגוון סוגי תאים23. בתחילת העבודה מנוצלת הגלום pH-הרגישות של ירוק ניאון חלבון (GFP) כדי לפקח על pHאני בתרבית תאים אפיתל24 , אבל בשני העשורים לראות GEpHIs משמש נוירונים25, עכשיו, דונלד26, פטריות27 , צמח תאי28. השילוב של הפוטנציאל של פילוח הסלולר של מבנים גנטיים באמצעות המערכת את הביטוי GAL4/UAS15 הנגישות הפיזיולוגיות של דרוזופילה MT שזה הכנה אידיאלית של חקירות של pHאני תקנה ותעבורה יון אפיתל.
pHאני תקנה נחקר במשך עשרות שנים, והוא חיוני לחיים. הכנת MT מציע מודל חזקים כדי ללמד את הפיזיולוגיה של pHאני רגולציה, אבל גם לבצע מתוחכם חקירות של pHi לתקנה ex-vivo ו vivo בתוך. פרוטוקול זה מתאר כימות של H+ תנועה על פני קרום basolateral של תאי אפיתל של דרוזופילה MT באמצעות ה NH4Cl הדופק חומצה טעינה טכניקה21, אבל כמו מחוון ה-pH היא גנטית מקודד, שיטות אלה ומסגרת תיאורטית שלהם ניתן ליישם כל הכנה נוטה transgenesis, הדמיה לחיות.
כל השלבים פרוטוקול זה לעמוד בהנחיות שימוש בבעלי חיים מאיו קליניק (רוצ'סטר, MN).
1. גידול לעוף
2. הכנת שקופיות פולי-L-ליזין.
3. הכנת לנתח מאכל ומוטות זכוכית
איור 1: בדיית זכוכית מוטות לטיפול Malpighian בקוריאנית.
A - E. תהליך של חימום ומושך מוט זכוכית לייצר להתחדד, זווית מתאימה לטיפול MTs. חצים מציינות כיוון ובהיקף של כוח כדי להחיל. F. צילום של כלי זכוכית כראוי מפוברק. סרגל קנה מידה = 10 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
4. הכנת פתרונות ומערכת זלוף
הערה: מערכות זלוף שונים על-ידי יצרן. פרוטוקול זה בנויה סביב הכבידה-fed 8 ערוצים פתוחים מאגר עם הרגולטור קצב זרימה קלט, יצוא מונחה ואקום, אבל השיטה של הרכבה ש-mts כפי שמתואר כאן יכול להיות מותאם לעבודה עם כל מערכת זלוף.
איור 2: מערכת זלוף והדמיה של תצורה.
הרכיבים הנחוצים פיזיולוגיים להערכת תפקוד התחבורה basolateral MT דרך בו זמנית חיים פלורסצנטיות הדמיה ומהירה פתרון exchange. קווי הגז המוצגות הן אופציונליות ו היתר הרחבת סדרת ניסויים ההערכה התחבורה HCO3– . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: זרימה סכמטית זלוף מכשירי NH4Cl הדופק ניסויים.
חצים מתארים זרימת והנתיב שסתום מיתוג נקודות. פתרון עובר מן המאגר הדגימה על ידי זרימת הכבידה, מצויר מן החדר הדגימה הבקבוקון פסולת ביניקה ואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
5. ניתוח למבוגרים דרוזופילה Anterior Malpighian בקוריאנית.
6. אימות של הדמיה פרוטוקול ובריאות צנורית
הערה: פרוטוקול זה מתבצע על מיקרוסקופ פלורסנטי רחב-שדה הפוך עם GFP (ע), מערכות סינון RFP (mCherry) (470/40 ננומטר עירור (לשעבר), nm 515 longpass פליטה (em), 500 ננומטר ודיקרואיק זוהר, 546/10 ננומטר לשעבר, 590 nm longpass em, 565 nm ודיקרואיק זוהר), 10 X / 0.45 אוויר המטרה, מצלמה מונוכרומטי עבור לכידת תמונה חיה, ותוכנת הדמיה. הפרוטוקול ניתן להתאים עבור כל זקוף או הפוכה מיקרוסקופ עם מסנן אוטומטי מעבר בין GFP ו- RFP אופטיקה ותמונה רכישת תוכנה, אף פעמים חשיפה אופטימלית, עוצמת האור ופרמטרים binning משתנים. בניתוח כל, עוצמת קרינה פלואורסצנטית צריך להיות מנותח כמו עוצמת פיקסל רע באזור של הריבית (ROI), לאחר חיסור רקע בכל אחד מהערוצים באמצעות רועי עם מכיל אין קרינה פלואורסצנטית סמוכים לאות ROI.
7. כיול מלאה של pHerry ב Malpighian בקוריאנית Vivo לשעבר.
8. כימות של חומצה Basolateral שחול מ לשעבר Vivo צנורית Malpighian Epithelia.
רקמות בריאים וזיהוי נאותה של MTs הקדמי הכרחיים להצלחה של פרוטוקול זה. במהלך ניתוח, כדאי לשים לב למגע לא ישיר של MTs, לטפל רק אותם על ידי השופכן כמו מרתק של MTs ישירות יוביל שבירה (איור 4A– B). כאשר MTs נסחפים השטוח אותן לשקופית, בקוריאנית חייב להיות נגע מעט ככל האפשר, עודף תנועה כמו זה יגרום נזק שכבת האפיתל של תא בודד (איור 4C). גזור כראוי MTs הקדמי יראה אפילו חלוקת פלורסצנטיות אדום וירוק דרך ציטוזול של תאים אפיתל ואת מקטעי צנורית מורפולוגית ברורים. בקוריאנית פגום על-ידי זלוף פסולים או הנזק יציג צבירה של פלואורסצנטי אדום עם אין אגרגטים ירוק לזווג ולא טעינו בזיהוי MTs האחורי יראה מורפולוגיה אחיד מהקצה עיוור מקורב אל השופכן הדיסטלי (איור 4D) .
וחייבות להיות מאושרות לתפקוד תקין של pHerry הערכת למרות הפיזיולוגיות, כמו גם מורפולוגיה. השיטה הכי מועיל של המאשר חישה pH נכונה היא להחיל NH4הדופק Cl. בתנאים אלה ע ירוק האות צריך לדווח את השינויים הצפויים pH (עלייה ב- pHאני במהלך הדופק NH3 חודרים לתא, ירידה הדרגתית במהלך הדופק כמו NH4+ נכנס דרך מובילי K+ , ערוצי, ו acidification מהיר התאוששות הדרגתית על NH4Cl נסיגה21, ואילו האות mCherry אדום יישאר קבוע (איור 5A– B). השינויים בתוך האות ע ישתנו עם פרוטוקול והם סוג התא, אך האות mCherry צריך להיות יציב בכל המקרים. שינויים בתוך האות mCherry במהלך הניסויים בודדים מציינים תנועה חפצים או דור מתקדם של חיישן אגרגטים עקב נזק לתאים. האחרון תמנע כימות של pHאני , עליך להימנע. לאחר סיום NH4Cl דופק חשוב לבצע כיול של 2 נקודות (כיול iPBS, pH 7.4 ו- 9.0, nigericin 10 מיקרומטר) כדי לאשר את מנוחתו pHאני ליד 7.4 ולהבטיח כי הפרמטרים הדמיה הנוכחיים ואינן להוביל הרוויה של קרינה פלואורסצנטית הזיהוי כאשר קרינה פלואורסצנטית מוגדל ב- pH 9.0 (איור 5C). אם נח pH נמוך משמעותית מאשר 7.4, הפרוטוקול יש לחזור עם MTs בריא; אם רוויה מתרחשת ב- pH 9.0, הפרוטוקול יש לחזור עם הזמן בעוצמה או חשיפה אור נמוכה יותר. ברגע נקבעים פרמטרים הדמיה נאותה, הם אין לשנות בין ניסויים או ולידציות אם היחס פלורסצנטיות מוחלטת כדי לשמש. ואילו הטבע פסאודו-רציומטרי של pHerry יכול לספק שיטה של התנועה תיקון בהכנות נוטה תנועה או שינויים בקוטר תא, כימות מוחלטת של pHאני דורש מתאם מלא שיטתית של pHerry ע / mCherry יחס החומציותאני דרך הטכניקה K+ nigericin/גבוהה. הכיול של pHerry בהכנות בריא צריך לייצר עקומות כיול עקבית עם נראית לעין pK של 7.1-7.4 בהתאם תא סוג וכיול לתנאים (איור 5D). על ההכנות צבירת איזה mCherry הוא בלתי נמנע, נורמליזציה של ערכים יחס כזה יחס זריחה של 1.0 מקביל pHאני 7.0 אמור להניב תוצאות דומות (איור 5E). אם נקודת הכיול ועיקולים מנורמל משמשים, ניתן למטב הדמיה פרמטרים עבור כל הכנה.
PH מכוילתאני עקבות יכול לשמש כדי להשוות בין מנגנון רגולטורי pH בין סוגי תאים. מערכת GAL4/UAS ביטוי דרוזופילה ניתן לבטא pHerry תאים עיקריים, תאי stellate הר הקדמי (איור 6A). pHאני רגולציה יכול להיות מוערך על ידי חומצה העמסה תאים עם הקצב של pHאני שחזור NH4Cl פולסים וכימות. זה יכול להתבצע על ידי התאמת פונקציות מעריכי לשלב התאוששות בתנאי ניסוי שונים כדי לחלץ את קבוע דעיכה (τ) כמו תאים עם מהירה יותר בזרימת H+ יציג החלמה מהירה יותר (וערכים נמוכים יותר ובכך של τ). בהתבסס על ניתוח זה, תאי stellate הר מופיעים יש הבלטה חומצה חזקים יותר מאשר תאים עיקריים (איור 6B). ניתוח זה תקיים כל עוד מנוחתו pHאני, מידת הטעינה חומצה, אגירה קיבולת דומים בין קבוצות הניסוי. עם זאת, כאשר לא מתקיימים תנאים אלה, יש צורך להסביר התצפית כי קיבולת חציצה פנימי של ציטוזול (βi) של תאים רבים היא עצמה תלויי-pH35,37,38 ולכן קצב pHאני השינוי ב pH שוניםi אולי לא ישתווה ישירות. במקרים כאלה, עקומות אקספוננציאליות מתאים לגורמים הבאים שלב חומצה ההבלטה של NH4הדופק קלרנית והערכות בעבר נחושה של קיבולת חציצה פנימי (βi) יכול לשמש כדי להתוות את שיעור ההבלטה חומצה (JH +) פונקציה של pHאני ולקבוע שיעור מדובבים של חומצה שחול (משוואות 3 & 4). ברגע הבדלים חומצה וטעינה נח pHאני ספורים עבור, זה ברור ההבלטה חומצה בתאים העיקרי של המקטע המעבר לחרוג כי תאי stellate (איור 6C). בעוד משכנע, ניתוח זה אינו מתייחס למדידה pHאני הוא פונקציה של עוצמת הקול בזמן ההבלטה חומצה על פני קרום פלזמה היא פונקציה של שטח הממברנה. חלוקת JH + מאת פני השטח יחס נפח התא עניין תניב הערכים שומות מקבילות חומצה ליחידת שטח פני יחידת הזמן (משוואת 5), ובכך מאפשר תיקון עבור הבדלי גודל תא, מורפולוגיה. כ שני התאים העיקריים המרכיבים את היקף MT בקטעים המעבר, ובכך יכול להיות הדגם תאים בודדים כמו חצי צינור (מיקרומטר הקוטר הפנימי 24; מיקרומטר 48 הקוטר החיצוני; גובה 50 מיקרומטר). תאי stellate הם קטנים יותר, נוטים להיות בצורת בר קטע המעבר של MT2. כימות מדויק של פני השטח והנפח קשה אבל הערכות שמרניות אפילו צורת המעבר תאי stellate (גליל לגובה של 50 מיקרומטר, קוטר של 10 מיקרומטר) מצביעים על פני שטח האחסון יחס לפחות 2 x של תאים עיקריים. לוקח את זה בחשבון מגלה כי שטף חומצה תאי stellate באופן משמעותי מתחת לזה של תאי המעבר העיקרי, והוא למעשה מתקרבת לזו של התאים העיקריים קטע הראשונית (6D איור).
איור 4: ניתוח למבוגרים דרוזופילה Anterior Malpighian בקוריאנית.
א. ייצוג סכמטי של הסרת MT הקדמי עם 2 זוגות של מלקחיים בסדר במדיום של שניידר צוננת. "א צנורית" = הר הקדמי "עמ' צנורית" = הר האחורי B. תהליך אחזור של הרכבה MTs חילוץ באמצעות מוטות זכוכית. ג. תהליך של הקפדה באורך מלא של חילוץ MTs לשקופית להערכת הדמיה, הפיזיולוגיות. D. נציג widefield תמונות של ע (470/510 ננומטר ex / em) ו mCherry (556/630 ננומטר ex / em) מרכיבי UAS-pHerry מונע על ידי capaR-GAL4 המתארים בריא הקדמי MTs, MTs קדמי פגום על-ידי לא מספיקות זלוף, ו טעינו בזיהוי האחורי MTs. הערה כי MTs הקדמי בריא להציג ברור מורחבים עיוור הראשונית קטע, קטע המעבר מכווץ עם ביטוי מוגבר יחסית UAS-pHerry כאשר מונע על ידי capaR-GAL4, ואת צינור ראשי הדיסטלי פלח. נזק MTs מורגש התצוגה מצבורי mCherry זריחה עם פלורסצנטיות ע המתאימים אין. MTs האחורי הם מדים בקוטר אין מקטעים נפרדים מורפולוגית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: אימות וכיול של pHerry ב Malpighian בקוריאנית.
א. נציג widefield תמונות של ע (470/510 ננומטר ex / em) ו mCherry (556/630 ננומטר ex / em) רכיבים של UAS-pHerry מונע על ידי capaR-GAL4 המתארים MTs. anterior בריא "רועי" סימני אותות לאזור עניין. "BG" אזור רקע סימני עניין אשר היה לאחר מכן שהוחסר את האות רועי ב- אותו ערוץ. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. B. קרינה פלואורסצנטית יחסית לשינויים אותות ע ו mCherry של pHerry בתגובה 20 s 40 מ מ NH4הדופק Cl. שימו לב כי האות mCherry הינה יציב בעוד האות ע מציג עלייה אופיינית במהלך הדופק (מעיד על alkalization, דהיינו גדל pHאני), ירידה חדה על שטיפה (מצביע על כך acidification, קרי ירד pHאני). ג. יחס זריחה של pHerry (ע/mCherry) מחושב מנתונים ב' עם נתונים נוספים לאחר דגירה 30 דקות ב- iPBS כיול (10 מיקרומטר nigericin, 130 מ מ K+, pH 7.4 ו- 9.0). ד. עקומת כיול בנוי יחס pHerry המוחלט (ע / mCherry) כפי פונקציה של הטיל pHאני במהלך חשיפה iPBS כיול buffered לאחד ערכי pH 8. עיגולים אפורים הם הערכים הבודדים טופס 8 ההכנות. ריבועים שחורים וברים ±SD מרושע. עקומת בולצמן מתאים. E. אותם נתונים כמו D מנורמל כזה יחס זה זריחה ב- pH 7.0 הוא 1.0. עקומת השתנה עקומת sigmoidal מתאים (ראה שלב 7.4, משוואה 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: כימות של חומצה ההבלטה בתוך צנורית Malpighian Epithelia.
א. Widefield התמונה של זריחה ע (מתוך pHerry) בתאים העיקרי של MT הקדמי (משמאל, מונחה על-ידי מנהל capaR-GAL4 ), תאי stellate הר הקדמי (נכון, מונע על ידי c724-GAL4). שימו לב כי תאי stellate הם בצורת בר במגזר הראשוני, משתנה, קטע המעבר, להציג תחזיות הסלולר ברורים בקטע המרכזי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. B. מכויל pHאני בתגובה לשינויים 20 s 40 מ מ NH4Cl הדופק באזורי עניין מסומן (תאים העיקרי של קטע המעבר, התאים העיקריים של המגזר הראשוני, תאי stellate מעבר מקטע). עקומות מקווקו מציינות מתאים מעריכי יחיד שהוחל שלב ההתאוששות חומצה בעקבות NH4נסיגה Cl שממנה נגזרים ערכי קבוע (τ) דעיכה המוצהרת. ג. שיעור ההבלטה חומצה (JH +) להתוות כפי pH הפונקציהi נגזר המעריך מתאים ראה ב'. ראה שלב 8.3.1 עבור JH + חישוב (משוואה 3). עקומות מקווקווים הם מתאים מעריכי מוחל על כל חלקה נתונים בתוך אזור חופפים pHאני מסומן על ידי התיבה האפורה. ד. חומצה השטף המותווים כפי pH הפונקציהi נגזר המעריך מתאים ב B ו- 5 משוואת. עקומות מקווקווים הם מתאים מעריכי מוחל על כל חלקה נתונים בתוך אזור חופפים pHאני מסומן על ידי התיבה האפורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
iPBS | מלון NH4Cl דופק iPBS | כיול iPBS | |
NaCl | 121.5 | 81.5 | 0 |
מלון NH4קלרנית | 0 | 40 | 0 |
אשלגן כלורי | 20 | 20 | 130 |
גלוקוז | 20 | 20 | 20 |
מאגר | HEPES; 8.6 | HEPES; 8.6 | MES, HEPES או ברזים; 8.6 |
NaHCO3 | 10.24 | 10.24 | 0 |
NaH2PO4 (1 H2O) | 4.5 | 4.5 | 0 |
NMDG | 0 | 0 | 30.5 |
ה-pH | 6.8 | 6.8 | משתנה |
Osmolarity | 350 ±5 | 350 ±5 | 350 ±5 |
טבלה 1: פתרונות לטוס ניסיוני.
iPBS פתרונות מוכנים בטמפרטורת החדר, pH מוגדר על-ידי טיטור עם HCl, NaOH. כיול פתרון טיטרציה עם HCl ו NMDG. מאגר של כיול פתרון מגוון המבוסס על ה-pH הרצוי [2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) עבור pH = 4.0-6.0; חומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 (HEPES) עבור pH = 6.5-7.5; N-[טריס (hydroxymethyl) מתיל]-3-חומצה aminopropanesulfonic (ברזים) עבור pH = 8.0-9.0]. כל הערכים מ מ, למעט ה-pH (unitless) ו osmolality (mmol/ק ג). Nigericin מניות ב דימתיל סולפוקסיד נוסף לפתרונות כיול כדי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר רק לפני השימוש.
GEpHI | עירור (אן אם) | פליטה (אן אם) | pK | הערות |
Superecliptic pHluorin (ע)11 | 395, 488 | 530 | 7.2 | טווח ליניארי גדול, קיפול גדול (50 x) להגדיל ב- pH תלויית קרינה פלואורסצנטית על פני טווח ליניארי |
Pt GFP42 | 390, 475 | 540 | 7.3 | תוקף לשימוש בתאי צמח |
Superecliptic pHluorin - פיוז'ן mCherry31 | 488, 556 | 530, 620 | 7.2 | מפיק mCherry אינטראקצית אגרגטים כמה תאים |
ClopHensor40 | 488, 545 | 525, 590 | 6.8 | pH, חיישן Cl– . Varient30 ClopHensorN מעודכן מראה פחות צבירת בנוירונים |
pHerry10 | 488, 556 | 530, 620 | 7.2 | מעודכן ע-mCherry פיוז'ן עם מקשר בין ClopHensor |
mNectarine44 | 558 | 578 | 6.9 | תיקון עבור photobleaching יש לעיתים קרובות צורך |
pHluorin245 | 395, 475 | 509 | 6.9 | וריאנט של רציומטרי pHluorin12 |
pHred47 | 440, 585 | 610 | 7.8 | Varient מעודכן של משמרת ארוכה-סטוקס mKeima49, תואם עם הדמיה 2-פוטון FLIM ניר |
pHuji43 | 566 | 598 | 7.7 | Varient של מאפל; נמוך יותר רגישות הצפוי pH בתאים מסוימים |
pHtomato46 | 550 | 580 | 7.8 | אימות כדי לעקוב אחר אנדוציטוזה vesicular, רגישות pH cytocolic המסכנה |
pHoran443 | 547 | 561 | 7.5 | רגיש pH משופרת חלבון פלואורסצנטי כתום |
SypHer-248 | 427, 504 | 525 | 8.1 | גרסה בהירה של רציומטרי SypHer51, במקור למדידות מיטוכונדריאלי |
טבלה 2: רשימת שפורסמה GEpHIs Cytosolic
Maxima עירור, פליטה maxima וערכים לכאורה pK מקורבים, יכול להשתנות בהתאם למערכת ביטוי, טכניקת דימות כיול בשיטה. FLIM = קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ. ניר = קרוב אינפרא-אדום.
ההצלחה של כימות של pHאני ב- MTs דרוזופילה תלויה לגמרי הבריאות של MTs שחולצו ואיכות הרכבה, דיסקציה (איור A – C). לכן, טיפול זהיר של רקמות כמו שמתואר הכרחי. שקופיות טרי מצופה PLL באופן משמעותי סיוע MT הרכבה כפי שהם נוטים להיות דבק הרבה יותר מאשר שקופיות אשר נחשפו בעבר לפתרון. הרכבה זהיר יסייע גם בזיהוי של MT ברורים מקטעים (איור D). MTs בריא להקל על כיול pHerry והערכה תפקודית על ידי הפחתת צבירה mCherry מניב כימות עקביים הרבה יותר של חומצה שחול, בהתאמה. במקרים מסוימים, הימנעות צבירה mCherry אינה אפשרית כפי התנאים ניסיוני מטבעו נזק MT epithelia או לייצר משמעותי ביטוי יתר של הכתבת פלורסנט. במקרים אלה, כיול פסאודו-רציומטרי מנורמל כזה יחס פלורסצנטיות 1.0 מקביל pHאני 7.0, נקודת הכיול יאפשר כמת (איור E). כדאי לשים לב בעת ביצוע ולידציות נקודת למנוע חשיפת היסודות קבוע של מערכות הדמיה זלוף כדי nigericin כמו ionophore דוגלים זכוכית ופלסטיק. כיול אפילו פסאודו-רציומטרי אינה אפשרית בנסיבות שבהן מניפולציה ניסויית גורם נזק תאי במהלך ניסוי, דהיינו נזק זה יגרום מתקדמים לעין לודיג mCherry קרינה פלואורסצנטית לאורך כל הניסוי. במקרים אלה מאוחר יותר, האות פלורסצנטיות ע ניתן להשתמש עם עקומת כיול מנורמל והצבע ולידציות, לפרסמה ההדמיה כבר לא לתקן עבור משמרות מוקד והאיורים של התנועה.
GEpHIs לשאת מספר מגבלות כללי בהשוואה לכימות של pHאני עם צבעי פלורסנט. שימור צבע יכול לשמש כמחוון של קרום התא של תקינות בריאות39, אך אין assay מקביל זמין לשימוש GEpHIs. ככזה, בריאות הכנה חייב להיות במעקב באמצעים עצמאיים, אם נזק לתאים לנבא תוצאות לבלבל. GEpHIs העלול לאפשר הדמיה של הפרעה מינימלית ויוו ההכנות אך רקמת מטבעו מגביל את המניפולציות ניסיוני, יכול להפוך את נקודת הכיול אפשרי. הגבלה ספציפית אחרת הגלום באמצעות pHerry של אחרים מציינים pH cytosolic fluorophore כפולה (כגון ClopHensor40) נובעת הנטייה של fluorophores שני לשנות שלהם פלורסצנטיות ללא תלות אחד בשני וגם pHאני . RFP צבירת חפצים הביטוי המשמעותי ביותר של מגבלה זו, אבל גם יכול להיות בסכנה כימות מאת photobleaching של fluorophores אחת או את שתיהן. לפיכך, הדמיה בפרוטוקולי הרבה להיות מותאם כדי למזער את photobleaching, אשר יכול להוביל הרבה פעמים חשיפה וקצבי רכישה < 0.2 פעמים חשיפה ארוכה הרץ. ייכשל לדווח rapid pHאני משמרות. קרינה פלואורסצנטית ע מציגה מתאם ליניארי ל pHאני מ- pH 6.8-7.8 רוב ההכנות, אך מידת הדיוק של מדידות כאלה תלויה הדיוק של שיטת קיי+ nigericin/גבוהה. Nigericin משמש ionophore /H K++ וכן ראוי כיול על equilibrating חוץ-תאית [K+] עם תאיים [K+]. הערכות של תאיים [K+] אינם זמינים או השגה בקלות לכל מערכות ניסיוני. הדיוק של ה-pHאני כימות יהיה כמו הערכות של תאיים [K+], רק למרות המחירים של השינוי היחסי ב pHאני יהיה עקבי. שגבה תאיים [H+] מגבלה זו והקשר לוגריתמי ההופכי של pHאני , תמיד עדיף לדווח נתונים כמו שיעורי השינוי ב pHאני, של שיעור ההבלטה חומצה (JH +, איור 6C), או חומצה השטף (איור 6D) ולא מוחלט שינויים ב- pHאני. ניתוח של הנתונים כפי השטף חומצה יתרון נוסף לתיקון הבדלים על פני השטח הם יחס נפח בין סוגי תאים.
בטח יהיה מוערך מספר אזהרות כאשר הנתונים תרגום סימולטני במבוגר לטוס הכנה MT שמתואר פרוטוקול זה. ההבחנה מורפולוגי של תיבות, המעבר, ואת מקטעי הראשי הוא כנראה פישוט של המגוון האמיתי של תחומים גנטי פונקציונלי נוכח MTs2. יתר על כן, בעוד פרוטוקול זה תוכנן כדי לזהות את תפקידה של מסועי חומצה basolateral זה אפשרי כי התחבורה הפסגה יכול להשפיע על pHi מידות כמו גם. איטום של ureters כאשר הרכבה של MTs (שלב 5.9) מבטיח פתרון חילופי בעיקר מתרחש על פני השטח basolateral אבל פארא-סלולר ולבלוב תנועת יונים עדיין עשויים להשפיע pHi כפי basolateral תחבורה בסופו של דבר משנה צד cytoplasmic של מעברי צבע יון לומן/cytosolic. הפרדה מוחלטת בין הפסגה פונקציה basolateral יכול להתבצע על ידי באופן עצמאי פרפוזיה את luminal ואת basolateral משטחים של MT אבל שיטות כאלה באופן משמעותי יותר מבחינה טכנית דורשים כפי שהם דורשים micropipette תעלות41 .
GEpHIs יתרונות רבים על פני שיטות קונבנציונליות של מדידת pH, ולהתאים את העוצמות האלה הם מוגבר כאשר בשילוב עם גמישות גנטי עלות נמוכה של הכנת דרוזופילה MT. כימות של pHאני מבחינה היסטורית יש לסמוך על צבעי פלורסנט כגון ((BCECF) 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein22 או מסובך אלקטרופיזיולוגיות להערכת באמצעות אלקטרודות יון סלקטיבי20 ,21. כפי pHerry מקודד גנטית, זה יכול לבוא לידי ביטוי באוכלוסיות הסלולר ספציפיים על-ידי היזמים ספציפי (כפי שמוצג כאן תאים עיקריים, תאי stellate של MT, איור 6), והוא נוטה להשתמש בכל רקמות נתון transgenesis, תרביות תאים, או זיהום ויראלי בתיווך. צבעי מוגבלים על ידי עלות של ההכנות בודדים ופרוטוקולים היישום שעשוי להיות מסובך אשר מעבירים ללא ירידה לפרטים תאים ברקמות הטרוגנית. אלקטרודות יון סלקטיבי דורשים ציוד מיוחד עבור ייצור ומדידה, בזמן pHerry דורש widefield היחידים מיקרוסקופ פלורסנטי עם קונבנציונאלי GFP ו- RFP לסנן סטים. השימוש צבעי ואלקטרודות מחייבים פיזית כמו גם גישה אופטי הרקמה של הריבית בעוד GEpHIs ניתן לנטר ברקמות שחולצו טרי ושוב פעם ויוו. ההזדמנות עבור הדמיה חיה בהכנות שלם הוא עניין מיוחד כאשר הערכת והפיזיולוגיה pHאני תקנה כמו שום טכנולוגיה אחרים התאית מאפשרת כימות של pHאני בנוכחות אגירה אנדוגני מנגנונים.
דרוזופילה למבוגרים MT ההכנה מציג תכונות אטרקטיביות רבות עבור אלו המעוניינים בהעברה רגולציה ויון השתגעת לגמרי. דרוזופילה האחזקה זולה, כלים כגון מקודד גנטית ביוסנסור בונה והוספות ביטוי RNAi הינם זמינים בקלות מתוך מגוון מניות מרכזי (בלומינגטון דרוזופילה מניות במרכז באוניברסיטת אינדיאנה; וינה דרוזופילה מרכז המחקר). דרוזופילה MTs מורכבים שכבה אחת של תאי אפיתל מקוטב, הופכות אותה לאידיאלית לחקירה התחבורה יון transepithelial. תחבורה Basolateral יכול להיות בקלות לבדיקה (כפי שמוצג כאן) אבל אישיותי של הפסגה, basolateral יון תנועה אפשרי עם תעלות micropipette41. בנוסף, מבחני תפקוד האיבר כמו רמזי הפרשת assay17 את התצהיר של סידן luminal-אוקסלט18 הם מאופיין היטב ומאפשרים קורלציה של אפיתל פיסיולוגיה תאית למודלים של הפרשת נוזלים, nephrolithiasis, בהתאמה. ואילו תכונות אלה מספקות הזדמנויות עבור ניתוח חזקים, הזמינות בעלות נמוכה ורחבה של מיקרוסקופ פלורסנטי הופך המודל דרוזופילה MT לאידיאלי עבור הפגנות של פיזיולוגיה הסלולר ו כל-עוגב בהוראת מעבדות.
שליטתו של שיטות אלה מאפשר כימות של pHאני רגולציה על ידי basolateral H+ שטף של MTs דרוזופילה למבוגרים, נגישה עדיין חזקים מודל של יון transepithelial תחבורה. השימוש GEpHIs כגון pHerry ניתן להתאים בקלות כדי להעריך pH תקנהi בסוגי תא הגעה, תרבותי בתרבית של תאים, וההכנות ויוו . התפתחות חדשה GEpHIs סביר יעברו של סידן מקודד גנטית אינדיקטורים, עם הדור החדש פורש את הספקטרום והטיפול הנוכחי מגבלות כגון צבירת חפצים30,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49. GEpHIs כבר בשימוש נרחב לדווח מטריקס מיטוכונדריאלי pH50,51, subcellular אסטרטגיות מיקוד קיים כדי להתאים לשפה ביולוגיים כדי רשתית תוך-פלזמית52, גרעין 53, הסינפטיות12,43, ואת cytoplasmic54 המשטחים החיצוניים של קרום פלזמה הסלולר55 (לקבלת רשימה של ריאגנטים שפורסמו, ראה בטבלה 2 ). ככזה כלים זמינים הם יאפשר אינטגרציה אנכית של תקנת משנה השתגעת עם היבטים אחרים של פיסיולוגיה תאית, כגון Ca2 + טיפול והאיתות תאיים, ותפקוד כל האיבר במגוון של בעלי חוליות ההכנות הגעה.
המחברים אין לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH DK092408, DK100227 אל MFR. AJR נתמכה על ידי T32-DK007013. המחברים רוצים להודות ד ר ג'וליאן ש א דאו כדי להפוך את CapaR-GAL4 c724-GAL4 מניות דרוזופילה . אנו מודים גם יעקב ב. אנדרסון לסיוע שמירה על ניסיוני צלבים לעוף.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Poly-L-Lysine (PLL) Solution | Sigma-Aldrich | P4832 | Store at 4 °C, can be reused. |
Nigericin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | N7143 | CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C. |
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm | Sigma-Aldrich | GBL622105 | Can be substituted as needed to match perfusion system. |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Available from multiple vendors. |
Helping Hands Soldering Stands | Harbor Freight Tools | 60501 | Available from multiple vendors. |
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors | Bioscience Tools | PS-8S | Any comparable perfusion system can be used. |
Flow Regulator | Warner Instruments | 64-0221 | Can be substituted as needed to match perfusion system. |
Schneider's Medium | Fisher Scientific | 21720024 | Store at 4 °C in sterile aliquots. |
#5 Inox Steel Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Can be substituted based on experimenter comfort. |
35 x 10 mm polystyrene Petri dish | Corning Life Sciences | Fisher Scientific 08-757-100A | Exact brand and size are unimportant. |
75 x 25 mm Microscope Slides | Corning Life Sciences | 2949-75X25 | Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible. |
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm | Warner Instruments | 64-0796 | Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells. |
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" | Fisher Scientific | 14-171-129 | Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system. |
Vacuum Silicone Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | Available from multiple vendors. |
Plastic Flow Control Clamp | Fisher Scientific | 05-869 | Available from multiple vendors, sterility not required |
Glass rods, 5 mm diameter | delphiglass.com | 9198 | Exact size is personal preference, multiple vendors available |
PAP Hydrophobic Pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Available from multiple vendors. |
Sealing Film | Sigma-Aldrich | P7668 | Available from multiple vendors. |
15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | Available from multiple vendors. |
50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | Available from multiple vendors. |
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | H3375 | Available from multiple vendors. |
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 69892 | Available from multiple vendors. |
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | T5130 | Available from multiple vendors. |
10X/0.45 Air Objective | Zeiss | 000000-1063-139 | Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging. |
Dissecting Stereoscope | Zeiss | Discovery.V8 | Any dissecting stereoscope can be used. |
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 10 | |
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 32 | |
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 2 | |
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera | Zeiss | Axiocam 506 mono | Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging. |
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic | Chroma | CZ909 | Any GFP/FITC filer set can be substituted. |
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic | Chroma | CZ915 | Any GFP/FITC filer set can be substituted. |
Inverted Epifluoescent Microscope | Zeiss | Axio Observer Z.1 | Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives. |
Statistical Analysis Software | Microcal | Origin 6.0 | Any software with comparable functionality can be substituted |
Image Analysis Software | National Institutes of Health | ImageJ 1.50i | Any software with comparable functionality can be substituted |
Image Acquisition Software | Zeiss | Zen 1.1.2.0 | Any software with comparable functionality can be substituted |
Single-edged Carbon Steel Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 71960 | Available from multiple vendors. |
Microscopy Slide Folder | Fisher Scientific | 16-04 | Available from multiple vendors. |
Bunsen Burner | Fisher Scientific | 50-110-1231 | Available from multiple vendors. |
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs | Genesee Scientific | 32-109BF | Comparable items can be substituted. |
2.5 L Laboratory Ice Bucket | Fisher Scientific | 07-210-129 | Available from multiple vendors. |
NMDG; N-Methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | Available from multiple vendors. |
200 uL barrier pipette tips | MidSci | AV200 | Available from multiple vendors. |
200 μL variable volume pipette | Gilson Incorporated | PIPETMAN P200 | Available from multiple vendors. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved