Hipoparatiroid Fare oluşturma iki Teknikleri: Paratiroidektomi GFP Rakorlar ve Difteri-Toksin-Aracılı Paratiroid Ablasyonu kullanma

Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.

Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre⁺ mice with Rosa-mTmG^fl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.

Insan fizyolojisi ve hastalık için bu küçük endokrin organ önemini anlamak 1880 ¹ insan ve Sandström tarafından diğer bazı türlerde paratiroid bezlerinin ilk sistematik açıklama beri sürekli artmıştır. Paratiroid bezleri paratiroid hormonu (PTH), kalsiyum metabolizması başlıca regülatörü salgılar. PTH aynı zamanda fosfat homeostasis ve kemik döngüsü ^{1, 2} için önemli bir hormondur. Boyun cerrahisi sırasında paratiroid Kaza çıkarılması veya hasar hipoparatiroidizm en sık nedeni, düşük kan kalsiyum, düşük PTH ve yüksek fosfor ¹ ile karakterize bir hastalıktır.

Daha iyi çalışmaya, güvenilir ve kolay erişilebilir fare modelleri gereklidir hipoparatiroidizm ve test yeni tedaviler, satın aldı. genetik araçları bir çok çeşit, çünkü Fare yaygın araştırmalarında kullanılanin vivo gelişmiş mekanik çalışmalar izin bu türlerde ullanılabilir. Cerrahi paratiroidektomi (PTX) ^{sıçanlarda, 2, 3, 4, 5,} ve daha büyük memelilerde ^{6, 7, 8} kullanılabilir Ancak, bu teknik, çünkü bezlerin küçük boyutu ve değişken bir anatomik dağılımı farelerde çok zor ^9. Bu nedenle, Thyro paratiroidektomi (TPTX), tipik olarak, tiroid, paratiroid bezleri birlikte ¹⁰ kaldırılır olduğu fare, gerçekleştirilir. Ancak, düşük tiroid hormon düzeyleri bu modeli komplike deneylerde potansiyel karıştırıcı vardır. Buna ek olarak, kalsitonin, kemirgenlerde Kalsiyum homeostazında önemli bir hormon üreten tiroid bezi olan Cı-hücrelerinin, aynı zamanda th çıkarılması üzerine kayıpyroids ^11.

Hipoparatiroidizm çeşitli genetik fare modelleri PTH nul faresi ¹² GCM2 boş fare ¹³ ve kalsiyuma duyarlı reseptörü (CaSR) ^{14, 15,} bir aktive mutasyonu ile NUF fare dahil olduğu, bulunmaktadır. Ancak, bu genetik bozukluklar zaten embriyonik gelişim sırasında mevcut ve paratiroid fonksiyonu, bu nedenle zaten embriyogenez sırasında bozulur. Bu, iskelet gibi organların gelişimini etkileyebilir. Bu sonraki yaşamında hastalığı kazanmak cerrahi sonrası hipoparatiroidi hasta ile tezat. Ayrıca, bu fare modelleri, bazı başka kullanımını ^{12, 13, 14} karmaşık hale erken öldürücülüğü ve azaltılmış doğurganlık, sergiler.

Biz iki yeni fare m geliştirdiedinilen hipoparatiroidi için MODELLERİ. tiroid bezi çıkarmadan paratiroid bezleri kolayca cerrahi olarak çıkarılması için belirlenen sağlar, özellikle paratiroid GFP ifade genetiği fareler kullanma. Bu fare ROSA ^mTmG fare ile 5.5 kb PTH promoterinin ¹⁶ kontrolü altında Cre rekombinazı ifade PTH Cre fare kapısı ile oluşturulmuştur. Elde edilen PTHcre; mTmG farenin paratiroid hücrelerde spesifik olarak, yeşil floresan proteini ifade eder. İkinci bir fare modeli, aynı PTH Cre, paratiroid spesifik olarak difteri toksini reseptörünün eksprese edilmesine yol açan, uyarılabilir DTR fare DUR kaseti çıkarmak için bu kez kullanır. DT sistemik uygulaması hayvanlar ameliyat olmadan hipoparatiroid render, paratiroid hücreleri yok eder.

Bu çalışmada sunulan iki fare modelleri üç aylık gözlem peri üzerinde istikrarlı bir hipokalsemik fenotip gösterene. Prosedürler gerçekleştirmek kolay, fenotip tekrarlanabilir ve hipoparatiroid fareler yüksek hayatta kalma oranı ¹⁷ sergilerler.

Bu çalışma Massachusetts General Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. başlamadan önce bu hayvan çalışması için uygun kurumsal onayını. Bazı teknikler yerel IACUC gereklerine göre ayarlanması gerekebilir.

1. GFP-PTX Fareler

1. Daha fazla çiftleşme için eski 10 hafta - 8 at PTHcre ⁺ fare ve Rosa-mTmG fareler edinin.
2. C57BL / 6 geçmişi olan fareler elde 6 kuşaktır, C57BL / 6 fareleri (FVB arka 129 karışık) PTHcre ⁺ fareler geri-melez.
3. Kendilenmiş PTHcre ⁺ fareler PTHcre ^{+ / +} fareler ¹⁷ elde edildi.
   NOT: genotipleme gerçekleştirmek kuyruk ucundan DNA ayıklamak ve PCR için kullanın. aşağıdaki gibi PCR primerleri olan heterozigot ve PTHcre Transgen homozigotluğu kontrol etmek için: ileri primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, astar A ters ', TCAGATCACACCACACAGCA, forward astar B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, astar B ', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ¹⁷ ters.
4. Rosa-mTmG fareler ¹⁸ Çapraz PTHcre ^{+ / +} fareler ^16. zaman 4 haftalık mTmG yavrular; PTHcre vazgeçirmek.
5. 0.6 mg / g vücut ağırlığı tribromoethanol ip enjeksiyonu (Avertin) ile mTmG fareler, ya da, ketamin / ksilazin gibi başka maddeler; 10 haftalık PTHcre - 8 anestezisi. onaylanmış bir protokole göre ameliyat sonrası 48 saat boyunca bir analjezik olarak buprenorfin, 0.1 mg / kg sc, 12 saatte kullanın. ayak tutam çekilme refleksi ya da başka yollarla anestezi uygun derinliğini sağlamak. yatar pozisyonda hayvan yerleştirin.
6. Uzatın ve tek kenar bıçakları kullanarak cilt tıraş ventral boyun bölgesini hazırlamak. Bir povidon iyot antiseptik ped ile traş cildi dezenfekte edin.
7. cerrahi bölgenin kirlenmesini azaltmak ve otoklava mikrofon kullanmak için steril cerrahi örtüler ile hayvan Kapakcerrahi işlem için rosurgical aletleri.
8. cerrahi bisturi ile cilt 2 cm insizyonu kesin. fasya teşrih ve kavisli tırtıklı forseps ile künt diseksiyon ile yan tükürük bezleri itin.
9. halojen ışık ve 4 kullanarak diseksiyon mikroskobu altında - 5X büyütme, kesme ve keskin forseps ipuçlarını kullanarak paratrakeal kasları ayrı ve trakea maruz kalmaktadır.
10. Bir sonraki trakea bulunan sağ ve sol lob ile tiroid bezi tanımlayın.
11. Floresan ışık ışık kaynağı açın ve iki yeşil-floresan paratiroidleri görselleştirmek.
    NOT: Genellikle, iki paratiroid bezleri veya tiroit bezi yüzeyine yakın bulunan, fakat bazen, onlar daha uzakta yer almaktadır.
12. Dikkatle cerrahi forseps ve makas kullanılarak yeşil paratiroidleri kaldırın. hemostaz için steril gazlı bez kullanın ve dikkatli bir şekilde tüm yeşil doku çıkarıldığından emin olmak için trakea boyunca kontrol edin.
13. 6-0 polyglactin 910 sütür kullanılarak kesintiye dikişle paratrakeal kasları kapatın. 6-0 polyglactin 910 sütür kullanılarak Halsted sütür ile cilt kesisi kapatın.
14. İsteğe bağlı: Sıvı değiştirilmesi için farelere 10 uL / ​​g vücut ağırlığı steril normal% 0,9 sodyum klorid çözeltisi enjekte edilir.
15. vücut ısısı geri kazanımı için sıcak bir inkübatör (37 ° C) ayrı bir kafes cerrahi sonrası hayvanların yerleştirin. Fareler uyanık ve yatar pozisyonda bir kez kafes kattaki bazı jelatin gıda pelet yemi ve su koyun.
16. 2 saatlik bir ameliyat sonrası gözlem döneminden sonra, hayvan tesis için fareyi dönmek ve cerrahi sonrası bakım için yerel gereksinimleri takip.
17. 3 gün Paratiroidektomi sonra, 10 uL kuyruk kan elde etmek ve bu tür kan gazı sistemi Ca ⁺⁺ / pH analizörü gibi bir analizör kullanarak ⁺⁺ Ca iyonize kan ölçün. Kandaki başarılı paratiroidektomi sonuçları Ca ⁺⁺ eşit veya sahte çalışan con -2SD daha düşük iyonizekumanda fareleri (n = 30 Deneylerimizde 1.20 mmol / L).

2. PTH CRE-iDTR Fareler

1. Çiftleşme eski 10 hafta - 8 de PTHcre ⁺ ve DTR ^{fl / fl} fareler edinin.
2. C57BL / 6 geçmişi olan fareler elde 6 kuşaktır, C57BL / 6 fareleri (FVB arka 129 karışık) PTHcre fareler geri-melez.
3. PTHcre ⁺ (C57BL / 6 background) fareler PTHcre ^{+ / +} fareler ¹⁷ elde etmek için aynı soydan çiftleştirmek.
   NOT: fareler kuyruk uçları DNA ayıklanır ve PCR için kullanılan, genotipleme gerçekleştirmek için. Genotiplendirme Astarlar: ileri primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, 'ileri primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, primer B ters TCAGATCACACCACACAGCA' GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ¹⁷ primer A ters.
4. DTR ile PTHcre ^{+ / +} fareler ¹⁶ Mate ^{fl / fl} PTHcre-iDTR fareler elde etmek için fareler ^19.
5. diphtheri seyreltilmesi ile DT çözüm hazırlayın0.5 ug / mL bir konsantrasyona steril tuzlu su ile bir toksin toz. -80 ° C'de steril filtre ve depolamak alikot.
6. Enjeksiyon deney için 10 haftalık PTHcre-iDTR fareler - 8 seçin. oda sıcaklığına kadar eritilir DT kısım, intraperitonal 5 ug / kg (10 uL / ​​g), bir hayvanın vücut ağırlığı DT uygulayın. Maksimal etkinlik ve en toksisite için, DT Yönetimi 3 günlük aralıklarla ¹⁷ 2 enjeksiyon toplam tekrarlanır.
7. 3 gün ikinci enjeksiyondan sonra, her PTHcre-iDTR / PTHcre-iDTR-mTmG fareden 10 uL kuyruk kan alıp kan Ca ⁺⁺ Kan Gazı Sistemi Ca ⁺⁺ / pH analizörü kullanarak ölçün.
   NOT: kan fareler Ca araç-enjekte edilmiş kontrol farelerinin (n = 22) ortalamasının altında 2SS eşit hipoparatiroid fare gibi ⁺⁺ daha düşük 1.18 mg / L, iyonize tanımlar.

Paratiroid Bezleri Konumu

Floresan diseksiyon mikroskobu altında görüldüğü gibi Öncelikle, biz 54 PTHcre-mTmG farelerin paratiroid bezlerinin dağılımını kaydedildi. % 74 (40/54), farenin% 26 (14/54), farenin bir ilave üçüncü paratiroid bezi (Şekil 1B, D, F) olan iki yeşil paratiroid bezleri (Şekil 1A, C, E), vardı. Tek bir bez veya üçten fazla bezleri ile Resim fare gözlenmiştir. Genellikle, paratiroid bezleri, tiroid bezi (% 58, 71/122 üst sınırına yakın bulunduğu Şekil 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), e (2), A (3)). % 27 (33/122) bezlerin tiroid bezinin alt sınırına yakın bulunduğu (Şekil 1C (1), D (3), F (1)), ve% 13 (16/122) uzak t bulunduğuTiroid bezi (Şekil 1B (3), D (1), E (2)). Bulgularımız ile tutarlı ve paratiroid bezlerinin ²⁰ yerleri değişen önceki bulguları uzatmak.

GFP-PTX Fareler

cilt insizyonu kapatma anestezi tüm cerrahi fare başına yaklaşık 20 dakika sürdü. 3 aylık gözlem dönemi boyunca ameliyat sonrası farelerin hayatta kalma oranı% 96.3 (53/55) idi. % 92.4 (49/53) GFP-PTX fareler 2 SD sahte çalışan kontrol fareleri veya daha düşük ortalama altındaydı iyonize kalsiyum düzeyleri sergiledi. GFP-PTX farelerde (hipokalsemi, düşük PTH ve serum fosfat) olarak hipoparatiroid fenotip 3 ay tüm gözlem süresi boyunca stabil idi. Önemlisi, tiroid fonksiyon 42 ± 24 vs = 3 ay cerrahi (TSH sonra yapay olarak ameliyat edilmiş hayvanlardan farklı değildi 30 ± 15 mU / L, p = 0.171; T4 = 30,0 ± 0,6 vs 3,1 ± 0,9 mg / dL, p = 0.707 (Şekil 2).

PTH-CRE-iDTR Fareler

DT PTH-Cre-iDTR farelere geliştirilen hipoparatiroidizm (düşük kan iyonize kalsiyum, yüksek kan fosfor ve uygunsuz düşük-normal PTH düzeyleri) enjekte edilir. Daha önce ölçülebilir, dolaşımdaki PTH ve bu farelerin ^17, bu nedenle biraz daha yumuşak fenotipi açıklayan birkaç PTH pozitif hücreler difteri toksini ile ablasyon kaçış bildirmiştir.

GFP-PTX Fareler ve PTH-CRE-iDTR Farelerde hipoparatiroidizm

Önemli kan Ca indirimleri ⁺⁺ ve serum PTH düzeyleri sham operasyonu farelerde bulunan seviyelerde (Ca ⁺⁺ = 1.05 ± 0.40 vs ile karşılaştırıldığında, 3 gün ameliyat sonrası GFP-PTX farelerde gözlendi 1.30 ± 0.03 mg / L, p <0.05; PTH = 32 ± 22 vs 580 ± 137 pg / ml, p <0.05). Hipoparatiroidizm fenotip 3 aylık gözlem dönemi boyunca istikrarlı oldu (Şekil 3A, izniyle (referans 17. yeniden basıldı)). 3 gün arayla, maksimal hipoparatiroid fenotip vermek için DT en az miktarda kullanmak için optimize edilmiş dozda ve rejimi de 5 ug / kg DT 2 enjeksiyondan sonra, DT PTH-CRE-iDTR fareler ile karşılaştırıldığında önemli hipokalsemi ve düşük PTH gösterdi enjekte 90 günlük gözlem süresi boyunca devam araç kontrol fareleri, (Ca ⁺⁺ = 1.10 ± 0.07 mmol / L genel 1.26 ± 0.05 mmol / L, p <0.05 '= 218 ± 156 pg / ml vs 572 ± 164 pg PTH / ml, p <0.05) (Şekil 3B, (referans # 17 izniyle)).

Şekil 1: Floresan Diseksiyon Mikroskop altında 54 PTHcre-mTmG Farelerde Paratiroid Bezleri çeşitli yerler Temsilcisi Görüntüler. Fareler, ya iki (A, C, E) ya da üç (B, D, F), yeşil paratiroid bezleri vardı. En paratiroid bezleri üst sınırının yakınında bulunan (A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), D (2), A (3) ya da yakınındaki alt sınırı tiroid bezinin (C (1), D (3), F (1)). nadir durumlarda, bazı ektopik bulunduğu (B (3), E (1), F (2)). için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.

Şekil 2: TSH ve GFP-PTX Fare T4 seviyesi. 3 ay GFP PTX sonra serum TSH ve T4 measurem elde edildi hastalar. GFP-PTX fareler TSH konsantrasyonları (42 ± 24 mU / L) (A) ve T4 konsantrasyonları gösterdi (3.0 ± 0.6 ug / dl) kontrol farelerine (TSH = 30 ± 15 mU / L, p farklı değildi (B) = 0.171, n = 11, T4 = 3.1 ± 0.9, p = 0.707, n = 11). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: GFP-PTX Farelerde Kan Ca ⁺⁺ ve PTH Düzeyleri ve DT PTH-CRE-iDTR Fare Enjekte. (Yeniden basılmış - (*** p <0.001, n = 8 6) Hem GFP PTX fareleri (A) ve DT PTH-iDTR cre stabil hipokalsemi sergilenen fareleri (B) enjekte edilmiş ve 3 aylık bir gözlem dönemi boyunca, PTH seviyeleri, indirgenmiş referans # 17) izni ile.es / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Biz paratiroid bezleri seçici GFP ifade ile transgenik fareler kullanılarak GFP güdümlü Paratiroidektomi tekniğini göstermektedir. PTHcre ise; mTmG fareler, çift floresan (Cre-ifade hücreleri ve non-Cre kırmızı domates yeşil GFP hücreleri ifade edilmiştir) açıkça belirlemek ve tam olarak tiroid çıkarmadan tüm paratiroid bezleri kaldırmak sağladı. floresan kırmızı olmayan paratiroid dokusunun belirlenmesi yeteneği için çift floresan mTmG farelerin kullanımını tercih ederken, bizim prosedür aynı zamanda domates kırmızısı (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 (as tek floresan hayvanları kullanarak iyi çalışması gerekir CAG-tdTomato) Hze / J) fare. prosedür gerçekleştirmek için nispeten kolaydır fare başına yaklaşık 20 dakika gerektirir ve şiddetli ve uzun süreli hipoparatiroid fenotipe yol açar.

Buna ek olarak, GFP pozitif paratiroid bezlerinin bir başka avantajı, anormal paratiroid bezlerinin saptanması kolaylığıdır. Çalışmalarımız göstermektedirhali hazırda, yeşil floresan eden fare modelinde tespit edilir B6 sıçanlarında (Şekil 1), yaklaşık dörtte paratiroid mislocalization. Thyro-Paratiroidektomi aksine, bizim teknik tiroid hormon replasmanı ve kalsitonin üreten tiroid C-hücre çıkarılması bilinmeyen etkisi müteakip ihtiyacı olan tiroid kaldırılmasını önler. Floresan etiketli paratiroid bezleri paratiroid bezlerinin izolasyonunu gerektiren diğer araştırmalar için kullanılabilir. Bu modele göre sınırlama cerrahi gereksinimler arasında. Temel mikrocerrahi beceri ve floresan ışık kaynağı olan bir diseksiyon mikroskobu gereklidir.

Ameliyat ihtiyacını ortadan kaldırır hipoparatiroid fareler üretmek için ikinci bir teknik gösterilmiştir. Difteri PTHcre-iDTR fareler daha hafif bir hipoparatiroidizm fenotip sergileyen, ama sadece fare içine intraperitoneal DT enjekte gerektiren toksin-tedavi. kritik bir parçası for doz optimizasyon bu model oldu üreten ve doz rejiminde. DT yüksek dozlarda toksisite yol açtı, ancak düşük dozlarda yaklaşımın etkinliğini azaltmıştır. Bu tatbik 5 ug / kg, 2 enjeksiyon doz rejiminin 3 gün arayla, NO / minimum mortalite ile, güvenilir ve kararlı bir hipokalsemi neden olduğu tespit edilmiştir.

Sonuçta, bu iki yaklaşım edinilen hipoparatiroidi için yararlı fare modelleri sağladığını umuyoruz. Yeni bir uzun etkili PTH kullanarak, hipoparatiroidi ¹⁷ için yeni ilaçların etkinliğini belirlemede bu modellerin her ikisi de ilk kez kullanıldığını bildirdi.

The authors declare that they have no competing financial interests.

NIH tarafından desteklenen bu çalışma Ağız Hastalıkları Açık Fonlama SKLOD2015OF01 (RB) ve R01-DK100584 ve Çin Devlet Anahtar Laboratuvarı verir. Biz yardım için Wenping Zhao, Tadatoshi Sato ve Kelly Lauter teşekkür ederiz.