Hypoparathyroid 마우스를 만드는 두 기술 : 부갑상선 GFP 땀샘과 디프테리아 독소 매개 부갑상선 절제술을 사용하여

Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.

Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre⁺ mice with Rosa-mTmG^fl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.

인간의 생리 및 질병이 작은 내분비 기관의 중요성을 이해 1880 ⁽¹⁾ 인간과 Sandström에 의해 여러 다른 종의 부갑상선의 첫 번째 체계적인 설명, 이후 지속적으로 개선되었다. 부갑상선은 부갑상선 호르몬 (PTH), 칼슘 대사의 주요 레귤레이터를 분비한다. PTH는 인산 항상성 및 골대사 ^1,2 중요한 호르몬이다. 목 수술 중 부갑상선의 사고 제거 또는 손상 부갑상선 기능 저하증의 가장 흔한 원인, 낮은 혈중 칼슘, 낮은 PTH 및 고가 인 ^1을 특징으로하는 질환이다.

더 나은 연구에 안전하고 쉽게 접근 할 수 마우스 모델이 필요 부갑상선 기능 저하증 및 테스트 새로운 치료를 인수했다. 유전 다양한 도구가이기 때문에 마우스는 널리 연구에서 사용생체 내에서 정교한 기계적인 연구를 허용하는이 종로만 제공. 수술 부갑상선 (PTX)은 래트 ^{2, 3, 4, 5,} 더 큰 포유 동물 ^{6, 7, 8에서} 사용할 수 있지만 그러나, 기술적으로 인해 동맥의 작은 크기와 그 변수 해부학 적 분포의 마우스에서 매우 도전 ^9. 따라서, 등 Thyro-부갑상선 (복강 내 투여)는 일반적 갑상선 부갑상선과 함께 ^열이 제거 된 쥐에서 수행된다. 그러나, 낮은 갑상선 호르몬이 모델을 복잡 실험 잠재적 교란 요인이된다. 또한, 칼시토닌, 설치류 칼슘 항상성에 중요한 호르몬을 생산하는 갑상선 내에서 C 세포는 또한 제의 제거시 손실yroids ^11.

부갑상선 기능 저하증의 몇몇 유전자 마우스 모델은 PTH 널 마우스 ^(12), GCM2 널 마우스 ^(13)와, 칼슘 감지 수용체 (CASR) ^{14 (15),} 활성화 돌연변이와 NUF 마우스를 포함하는 존재한다. 그러나, 이들 유전 적 결함은 이미 배아 발달 동안 존재하고, 부갑상선 기능 따라서 이미 배아 발생 동안 손상된다. 이는 골격으로 장기의 발달에 영향을 미칠 수있다. 이것은 나중에 인생에서 질병을 획득 수술 후 부갑상선 기능 저하증 환자와 대조. 또한,이 마우스 모델의 일부는 상기의 사용 ^{12, 13, 14을} 복잡 조기 치사 감소 불임을 나타낸다.

우리는 두 개의 새로운 마우스 m를 개발인수 부갑상선 기능 저하증에 대한 odels. 갑상선을 제거하지 않고 부갑상선 쉽게 제거 수술을 위해 식별 할 수 있습니다, 특히 부갑상선에서 GFP를 발현 유전자 조작 마우스를 사용. 이 마우스는 ROSA ^{mTmG 마우스로} 5.5 킬로바이트의 PTH 프로모터 ^(16)의 제어하에 Cre 호텔의 재조합 효소를 표현하는 PTH-Cre 호텔 마우스를 교차에 의해 생성되었습니다. 그 결과 PTHcre, mTmG 마우스는 부갑상선 세포에서 구체적으로 녹색 형광 단백질을 발현. 두번째 마우스 모델은 동일한 PTH-Cre 호텔, 부갑상선에 특히 디프테리아 독소의 수용체 발현의 결과로 유도 DTR 마우스에서 STOP 카세트를 제거하는이 시간을 사용한다. DT의 전신 투여는 동물이 수술없이 hypoparathyroid 렌더링, 부갑상선 세포를 파괴한다.

본 연구에 제시된 두 마우스 모델은 3 개월 관찰 요정 위에 안정한 hypocalcemic 표현형을 입증OD. 절차가 수행하기 쉬운, 표현형이 재현하고 hypoparathyroid 마우스는 높은 생존율 ^(17)을 나타낸다.

이 연구는 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 시작하기 전에이 동물 실험에 대한 적절한 기관의 승인을 얻습니다. 일부 기술은 지역 IACUC 요구 사항에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.

1. GFP - PTX 마우스

1. 또한 상대에 대한 이전 십주 - 8시 PTHcre ^{+ 마우스} 및 로사 - mTmG 마우스를 얻습니다.
2. C57BL / 6 배경으로 마우스를 얻기 위해 6 세대 C57BL / 6 마우스와 (FVB 배경 129 혼합)를 PTHcre ⁺ 마우스를 교잡.
3. Inbreed PTHcre ^{+ 생쥐} PTHcre ^{+ / +} 마우스 ^(17)를 얻었다.
   참고 : 유전자형을 수행 꼬리의 끝에서 DNA를 추출하여 PCR을 위해 그것을 사용합니다. 다음과 같이 PCR 프라이머는 이형 접합 및 PTHcre 형질 전환 유전자의 동형 접합체를 확인하십시오 : 정방향 프라이머 A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA을, 프라이머 A를 역 ', TCAGATCACACCACACAGCA을, F를orward 프라이머 B는 CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG는 프라이머 B ', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ^{17 역.}
4. 로사 - mTmG 마우스 ^(18)와 크로스 PTHcre ^{+ / +} 마우스 ^16. 경우 4 주 오래 mTmG 새끼, PTHcre을 유아.
5. 0.6 밀리그램 / g의 체중에 tribromoethanol의 IP 주입 (AVERTIN)에 의해 mTmG 마우스, 또는 케타민 / 자일 라진과 같은 다른 에이전트 10 주 이전 PTHcre - 8 마취. 승인 된 프로토콜에 따라 수술 후 48 시간 동안 진통으로 부 프레 노르 핀 0.1 ㎎ / ㎏ 사우스 캐롤라이나 모든 12 시간을 사용합니다. 발가락 핀치 철수 반사 또는 다른 방법으로 마취의 적절한 깊이를 확인합니다. 앙와위에서 동물을 놓습니다.
6. 확장 및 단일 에지 블레이드를 사용하여 피부를 도용하여 복부 목 영역을 준비합니다. 포비돈 요오드 살균 패드로 면도 피부를 소독.
7. 수술 부위의 오염을 감소시키고 멸균 마이크를 사용하여 무균 수술 드레이프 동물 커버수술에 대한 rosurgical 악기.
8. 수술 용 메스로 피부에 2cm 길이의 절개를 잘라. 근막을 해부과 곡선 톱니 모양의 집게와 무딘 절개에 의해 옆으로 침샘을 누릅니다.
9. 할로겐 빛과 4를 사용하여 해부 현미경 - 5 배 배율을 잘라 날카로운 집게 팁을 사용하여 paratracheal 근육을 분리하고 호흡 관을 폭로.
10. 다음 기관에있는 좌우 엽으로 갑상선을 확인합니다.
11. 형광등을 광원을 전환하고 두 녹색 형광 부갑상선을 시각화.
    참고 : 일반적으로 두 개의 부갑상선은이나 갑상선의 표면 근처에 위치하고 있습니다,하지만 때때로, 그들은 멀리 떨어져 있습니다.
12. 조심스럽게 수술 집게와 가위를 사용하여 녹색 부갑상선을 제거합니다. 지혈을위한 멸균 거즈를 사용하여 조심스럽게 모든 녹색 조직이 제거되었는지 확인 기관을 따라 확인합니다.
13. 6-0 polyglactin에게 910 봉합사를 사용하여 중단 봉합하여 paratracheal 근육을 닫습니다. 6-0 polyglactin에게 910 봉합사를 사용 홀스 테드 봉합하여 피부 절개를 닫습니다.
14. 선택적 : 유체 교체를 위해 마우스에 10 μL / g 체중 통상 0.9 % 멸균 식염수를 주입한다.
15. 체온 복구를위한 따뜻한 인큐베이터 (37 ° C)에 별도의 케이지에 수술 후 동물을 놓습니다. 쥐가 깨어과 가로 누운 위치에되면, 케이지 바닥에 일부 젤라틴 음식 펠릿 차우와 물을 넣어.
16. 2 시간의 수술 후 관찰 기간 후, 동물 시설에 마우스를 반환하고 수술 후 관리를위한 지역의 요구 사항을 따르십시오.
17. 삼일 부갑상선 후, 10 μL 꼬리 혈액을 수득 및 혈액 가스 시스템 칼슘 ⁺⁺ / 산도 분석기와 같은 분석을 사용하여 이온화 칼슘 ⁺⁺ 혈액을 측정한다. 혈액의 성공적인 부갑상선 결과는 칼슘 ⁺⁺ 같거나 가짜로 작동하는 죄수의 -2SD보다 낮은 이온화트롤 마우스 (N = 30의 실험에서 1.20 밀리몰 / L).

2. PTH는-CRE-IDTR 마우스

1. 상대에 대한 이전 십주 - 8에서 PTHcre ^+와 DTR은 ^{FL / FL} 마우스를 얻습니다.
2. C57BL / 6 배경으로 마우스를 얻기 위해 6 세대 C57BL / 6 마우스와 (FVB 배경 129 혼합)를 PTHcre 마우스를 교잡.
3. PTHcre ⁺ (C57BL / 6 배경) 마우스 PTHcre ^{+ / +} 마우스 ^(17)를 얻을 ^수 Inbreed.
   참고 : 마우스 꼬리 끝에서 DNA를 추출하여 PCR에 사용 된, 유전자형을 수행합니다. 유전자형 프라이머 : 정방향 프라이머 A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, '앞으로 프라이머 B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG는, 프라이머 B 역 TCAGATCACACCACACAGCA'GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ⁽¹⁷⁾ 프라이머 A를 역.
4. DTR과 PTHcre ^{+ / +} 마우스 ^{(16) 메이트 FL / FL} PTHcre-IDTR 마우스를 얻기 위해 마우스 ^19.
5. diphtheri을 희석하여 DT 솔루션을 준비0.5 μg의 / ml의 농도로 멸균 식염수 독소 분말. -80 ° C에서 살균 필터 및 저장 분취.
6. 주입 실험 10 주 PTHcre-IDTR 마우스 - (8)을 선택합니다. 실온에서 해동 DT 분취은 복강 5 μg의 / kg (10 μL / g) 동물의 체중에 DT 관리. 최대 효율 최소 독성, DT 투여는 3 일 간격 ^(17)이 주입의 전체에 대해 반복된다.
7. 삼일 두 번째 주사 후, 각 PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR - mTmG 마우스에서 10 μL 꼬리 혈액을 혈액 칼슘 ⁺⁺ 혈액 가스 시스템 칼슘 ⁺⁺ / 산도 분석기를 사용하여 측정한다.
   참고 : 우리는 피와 마우스는 칼슘 차량 주입 제어 마우스 (N = 22)의 평균보다 2SD에 해당 hypoparathyroid 마우스와 같은 ^++보다 낮은 1.18 밀리몰 / L를, 이온화 정의합니다.

부갑상선의 위치

형광 해부 현미경으로 관찰 첫째, 우리는 54 PTHcre-mTmG 마우스의 부갑상선의 분포를 기록했다. 74 %는 (54분의 40) 마우스는 26 % (54분의 14) 쥐가 추가로 세 번째 부갑상선 (그림 1B, D, F)을 가지고 두 개의 녹색 부갑상선 (그림 1A, C, E)를했다. 단일 선 또는 세 개 이상의 땀 샘을 더 마우스는 관찰되지 않았다. 일반적으로, 부갑상선은 갑상선 (58 %, 122분의 71의 우수한 국경 근처에 위치하고도 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E를 (2), F (3)). 27 % (122분의 33) 분비가 갑상선의 열등한 국경 근처에 위치했다 (그림 1C (1), D (3), F (1)), 13 % (1백22분의 16)를 멀리 t에서 위치했다hyroid 선 (도 1B (3) E (1), F (2)). 우리의 연구 결과와 일치하고 부갑상선 ^(20)의 위치를 변화의 이전 연구 결과를 확장 할 수 있습니다.

GFP-PTX 마우스

피부 절개를 폐쇄에 마취에서 전체 수술은 마우스 당 약 20 분 걸렸다. 3 개월의 관찰 기간 동안 수술 후 마우스의 생존율은 96.3 % (55분의 53)이었다. 92.4 % (53분의 49) GFP-PTX 마우스는이 SD 허위 작동 대조군 이하의 평균 하회 이온화 칼슘 농도를 나타내었다. GFP의-PTX 마우스 (저 칼슘 혈증, 낮은 PTH 및 혈청 인산)의 hypoparathyroid 표현형 3 개월의 전체 관측 시간 동안 안정 하였다. 중요한 것은, 갑상선 기능은 42 ± 24 대 = 3개월 수술 (TSH 후 가짜 운영 동물에서 차이가 없었다 (30) ± 15를 mU / L, P = 0.171; T4 = 30.0 ± 0.6 대 3.1 ± 0.9 μg의 / dL로, P = 0.707 (그림 2).

PTH-CRE-IDTR 마우스

DT는 PTH-Cre 호텔 - IDTR 마우스를 개발 부갑상선 기능 저하증 (낮은 혈중 이온화 칼슘, 혈중 인, 그리고 부적절하게 낮은 정상 PTH 수준)을 주입. 우리는 이전에 측정 순환 PTH 이러한 마우스 ^(17)의 때문에 다소 온화한 표현형을 설명하는 몇 PTH 양성 세포는 디프테리아 독소에 의해 절제를 피할 것으로보고있다.

GFP-PTX 마우스와 PTH-CRE-IDTR 마우스에서 부갑상선 기능 저하증

중요한 혈액의 Ca ⁺⁺ 감소 및 혈청 PTH 수준은 모의 - 조작 된 마우스에서 발견 레벨 중 (Ca ⁺⁺ = 1.05 ± 0.40 대에 비해 3 일 수술 후 GFP-PTX 마우스에서 관찰 1.30 ± 0.03 밀리몰 / L, P <0.05; PTH = 32 ± 22 대 580 ± 137 PG / ㎖, p <0.05). 부갑상선 기능 저하증의 표현형은 3 개월의 관찰 기간 동안 안정 하였다 (그림 3A, 허가 (참조 # 17 재 인쇄)). 삼일 간격 최대 hypoparathyroid 표현형을 수득 DT의 최소량을 사용하여 최적 투여 량 및 요법에서 5 μg의 / kg DT 2 주사 후, DT는 PTH-CRE-IDTR의 마우스에 비해 유의 한 저 칼슘 혈증 및 감소 PTH 하였다 주입 90 일의 관찰 기간 내내 지속 차량 제어 마우스 중 (Ca ⁺⁺ = 1.10 ± 0.07 밀리몰 / L 대 1.26 ± 0.05 밀리몰 / L, p <0.05 = 218 ± 156 pg / ml 인 대 572 ± 164 PG PTH / mL로, P <0.05) (그림 (b), (참조 번호 (17)로부터 허가 재판)).

그림 1 : 형광 해부 현미경 하에서 54 PTHcre-mTmG 마우스의 부갑상선의 다양한 위치의 대표 이미지. 마우스 중 하나를 두 개 (A, C, E) 또는 세 (B, D, F) 녹색 부갑상선했다. 대부분의 부갑상선이 우수한 국경 근처에 위치했다 (A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3) 또는 가까운 하부 경계 갑상선의 (C는 (1), D는 (3), F는 (1)). 드문 경우에, 일부는 ectopically에 있었다 (B (3), E (1), F (2)). 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 2 : TSH 및 GFP-PTX 마우스의 T4 수준. 3개월 GFP-PTX 후, 혈청 TSH와 T4의 measurem에 대한 얻었다 엔트. GFP-PTX는 마우스 TSH 농도 (42 ± 24를 mU / L) (A)와 T4 농도를 보였다 (3.0 ± 0.6 μg의 / dL 이상) 제어 마우스 (TSH = 30 ± 15를 mU / L, P 차이가 없었다 (B) = 0.171, N = 11, T4 = 3.1 ± 0.9, P = 0.707, N = 11). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : GFP - PTX 마우스의 혈액 칼슘 ⁺⁺ 및 PTH 수준 및 DT는 PTH-CRE-IDTR 마우스를 주조. (재 인쇄 - (*** p <0.001, 8 N = 6)은 모두 GFP-PTX 마우스 (A) 및 DT는 PTH--IDTR CRE 안정한 저 칼슘 혈증을 나타내 마우스 (B)을 주입 3 개월간 관찰 기간 PTH의 수준을 저하 참조 # 17)에서 권한.에스 / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 부갑상선에 선택적으로 GFP 발현과 유전자 변형 마우스를 사용하여 GFP 유도 부갑상선의 기술을 보여줍니다. PTHcre에서, mTmG 마우스, 이중 형광 (Cre 호텔 발현 세포 및 비 Cre 호텔에서 빨간 토마토의 녹색 GFP 세포를 표현) 명확하게 파악하고, 정확하게 갑상선을 제거하지 않고 모든 부갑상선을 제거 할 수있게. 우리는 형광 적색 비 부갑상선 조직을 식별 할 수있는 능력에 대해 이중 형광 mTmG 마우스의 사용이 선호되지만, 우리의 방법은 또한 토마토 레드 (B6.Cg-CT (ROSA) 26Sortm14 (같이 단일 형광 동물을 사용하여 잘 작동해야 CAG-tdTomato) Hze / J) 마우스입니다. 절차 수행 비교적 쉽게 마우스 당 약 20 분을 요구하고, 심각하고 지속적인 hypoparathyroid 표현형을 초래한다.

또한, GFP 양성 부갑상선의 또 다른 장점은 비정상적인 부갑상선의 검출 용이성이다. 우리의 연구는 보여쉽게 녹색 형광에 의해 우리의 마우스 모델에서 감지 B6 마우스 (그림 1)의 약 분기에 부갑상선의 mislocalization. 등 Thyro-부갑상선 반대로, 우리의 기술은 갑상선 호르몬 대체 및 칼시토닌을 생산하는 갑상선 C 세포의 제거 미지 효과 이후 필요에 갑상선의 제거를 방지한다. 형광 표지 된 부갑상선은 부갑상선의 절연을 필요로하는 다른 연구에 사용될 수 있습니다. 이 모델의 한계는 수술에 대한 요구 사항이 포함되어 있습니다. 기본 미세 기술과 형광 광원과 해부 현미경이 필요합니다.

수술 않아도 hypoparathyroid 마우스를 생성하는 제 2 기술이 설명된다. 디프테리아 PTHcre - IDTR 마우스는 온화한 부갑상선 기능 저하증의 표현형을 전시, 단순히 마우스에 복강 DT 주입이 필요 독소 처리. 중요한 부분 FOR 용량의 최적화는이 모델을했다 생성하고식이 요법을 투여. DT의 과다 복용은 독성 주도하지만 낮은 복용량은 접근의 효능을 감소. 우리는 관리 5 μg의 / kg,에서 2 주사의 용량 연대 3 일 간격, 아니 / 최소한의 사망률 신뢰할 수 있고 안정적인 저 칼슘 혈증의 결과 것으로 판단.

궁극적으로, 우리는이 두 가지 방법은 인수 부갑상선 기능 저하증에 대한 유용한 마우스 모델을 제공 할 수 있기를 바랍니다. 새로운 지속성 PTH를 사용하여, 우리는 부갑상선 기능 저하증 ^(17)에 대한 새로운 약물의 효능을 결정하는 이러한 모델 모두의 첫 번째 사용을보고했다.

The authors declare that they have no competing financial interests.

국립 보건원에 의해 지원되었다이 작품은 구강 질환 열기 자금 SKLOD2015OF01 (RB)의 R01 - DK100584 및 중국 국가 중점 실험실을 부여합니다. 우리는 도움을 Wenping 조, Tadatoshi 사토, 그리고 켈리 Lauter 감사합니다.