שתי טכניקות כדי ליצור עכברים Hypoparathyroid: Parathyroidectomy שימוש בלוטות GFP ודיפטריה-רעלן בתיווך יותרת התריס אבלציה

Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.

Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre⁺ mice with Rosa-mTmG^fl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.

מאז התיאור השיטתי הראשון של בלוטת יותרת התריס ב אדם בכמה מינים אחרים על ידי Sandström בשנת 1880 ^1, הבין את המשמעות של איבר האנדוקרינית הקטן הזו עבור פיזיולוגיה אנושית ומחלות השתפר ברציפות. בלוטות יותרת התריס להפריש הורמון יותרת התריס (PTH), הרגולטור העיקרי של משק הסידן. PTH הוא גם הורמון חשוב עבור הומאוסטזיס פוספט ועצמות מחזור ^{1, 2.} סרה או ניזק מקרי של parathyroids במהלך ניתוח צוואר הוא הגורם השכיח ביותר של היפופרתירואידיזם, מחלה המאופיינת סידן נמוך בדם, PTH הנמוך, וזרחן גבוהה ^1.

ללמוד טוב יותר רכש היפופרתירואידיזם וטיפולי רומן בדיקה, אמין ומודלי עכבר ונגישים נדרשים. עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר כי מגוון רחב של כלים גנטיים הואvailable במינים זו המתירה מחקרים מכניסטית מתוחכמים in vivo. עם זאת, בעוד parathyroidectomy כירורגית (PTX) ניתן להשתמש בחולדות ^{2, 3, 4, 5,} ו גדול יונק ^{6, 7, 8,} מהבחינה טכנית היא מאוד מאתגרת בעכברים בגלל גודלו הקטן של הבלוטות והפצת אנטומי משתנית שלהם ^9. לכן, thyro-parathyroidectomy (TPTX) מבוצעת בדרך כלל בעכברים, שבו התריס בלוטת יותרת התריס יוסרו יחד ^10. עם זאת, רמות הורמון בלוטת תריס נמוכות הם מתערבים פוטנציאל בניסויים, שמסבכים את המודל הזה. בנוסף, C-תאים בתוך בלוטת התריס, אשר מייצרים קלציטונין, הורמון חשוב הומאוסטזיס סידן במכרסמים, הם איבדו גם עם הסרת הyroids ^11.

במודלים של עכברים גנטיים כמה היפופרתירואידיזם להתקיים, הכוללים את עכבר null-PTH ^12, עכבר-null GCM2 ^13, ועכבר Nuf עם מוטציה הפעלה במבנה הקולטן חישת סידן (CaSR) ^{14, 15.} עם זאת, פגמים הגנטיים אלה כבר נמצאים במהלך התפתחות עוברית, והפונקציה של parathyroids לכן כבר לקויה במהלך embryogenesis. זה יכול להשפיע על התפתחות איברים כמו שלד. זאת לעומת חולים עם היפופרתירואידיזם לאחר ניתוח שרוכשים המחלה בשלב מאוחר יותר בחיים. יתר על כן, חלק במודלים של עכברים אלה מפגינים קטלניים מוקדם בפוריות, אשר מסבכת עוד יותר את השימוש בם ^{12, 13, 14.}

פתחנו שני מטר עכבר חדשodels עבור היפופרתירואידיזם רכש. שימוש בעכברים מהונדסים גנטית המבטאים GFP דווקא parathyroids מאפשר בלוטת יותרת התריס להיות מזוהה בקלות על הסרה כירורגית מבלי להסיר את בלוטת התריס. העכבר הזה נוצר על ידי חציית העכבר PTH-Cre, המבטא Cre recombinase תחת שליטה של האמרגן 5.5 kb PTH ¹⁶ עם העכבר ROSA ^mTmG. PTHcre וכתוצאה מכך; עכברים mTmG לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק במיוחד בתאים יותרת התריס. מודל העכבר השני משתמש באותו PTH-Cre, הפעם כדי להסיר קלטת STOP מעכבר DTR המושרה, וכתוצאה מכך הביטוי של הקולטן רעלן דיפתריה דווקא parathyroids. ממשל מערכתי של DT הורס תאי יותרת תריס, טיוח החיות hypoparathyroid ללא ניתוח.

שני מודלי העכבר המוצגים במחקר זה להפגין פנוטיפ hypocalcemic יציב לאורך פרי התצפית של שלושה חודשיםod. הנהלים מהווים קלים לביצוע, פנוטיפ ניתנת לשחזור, ועכברי hypoparathyroid מפגינים שיעור הישרדות גבוה ^17.

מחקר זה אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס. לקבל אישור מוסדי מתאים עבור מחקר בבעלי חיים זה לפני התחילה. טכניקות מסוימות עשויות צריכות להיות מותאמות על פי דרישות IACUC מקומיות.

1. עכברים GFP-PTX

1. השג עכברי PTHcre ⁺ ועכברי רוזה-mTmG ב 8 - 10 שבועות לזיווג נוסף.
2. הכלאה לאחור עכברי PTHcre ⁺ (המעורבים 129; רקע FVB) עם C57BL / 6 עכברים עבור 6 דורות להשיג עכברים עם רקע C57BL / 6.
3. עכברים משפחה מזדווגים PTHcre ⁺ להשיג PTHcre ^{+ / +} עכברים ^17.
   הערה: כדי לבצע גנוטיפ, לחלץ את ה- DNA מן קצה הזנב ולהשתמש בו עבור PCR. פריימרים PCR כדי לבדוק הטרוזיגוטיות ו homozygosity של transgene PTHcre הן כדלקמן: פריימר קדימה, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, הפוכה פריימר ', TCAGATCACACCACACAGCA, fפריימר orward B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, לאחור תחל ב ', ¹⁷ GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT.
4. הצלב PTHcre ^{+ / +} עכברים ¹⁶ עם רוזה-mTmG עכברים ^18. לגמול PTHcre; גורי mTmG כאשר 4 שבועות.
5. להרדים 8 - 10 שבועות PTHcre; עכברים mTmG בזריקה ip של tribromoethanol (Avertin) במשקל הגוף 0.6 מ"ג / g, או סוכנים אחרים כגון קטמין / xylazine. השתמש עצירות 0.1 מ"ג / ק"ג SC כל 12 שעות כמשכך כאבים במשך 48 שעות לאחר הניתוח על פי פרוטוקול שאושר. ודא עומק מתאים של הרדמה על ידי רפלקס נסיגת קמצוץ בוהן או באמצעים אחרים. מניח את החיה במצב שכיבה.
6. רחב ולהכין באזור צוואר הגחון על ידי גילוח לעור באמצעות להבי קצה יחידים. לחטא את העור מגולח עם כרית חיטוי יוד povidone.
7. כסה את בעל החיים עם וילונות כירורגי סטרילי כדי להפחית את זיהום של האתר כירורגית להשתמש במיקרופון autoclavedמכשירי rosurgical עבור ההליך הכירורגי.
8. חותכים חתך אורכי 2 ס"מ העור בעזרת איזמל ניתוחים. לנתח fascia ולדחוף את בלוטות הרוק אל הצד על ידי דיסקציה הקהה עם מלקחיים משוננים מעוקלים.
9. תחת המיקרוסקופ לנתיחה באמצעות אור ההלוגן ו 4 - גדלת 5X, לחתוך ולהפריד את שרירי paratracheal באמצעות טיפי מלקחיים חדים ולחשוף את קנה הנשימה.
10. זהה את בלוטת התריס עם אונת ימין ושמאל הממוקמת ליד קנה הנשימה.
11. החלף את מקור האור לאור ניאון ולדמיין את שתי בלוטות יותרת התריס ירוק-fluorescing.
    הערה: בדרך כלל, שתי בלוטות יותרת התריס ממוקמים בתוך או סמוך לפני השטח של בלוטת התריס, אבל מדי פעם, הם נמצאים רחוק.
12. מוציאים בזהירות את בלוטת יותרת התריס ירוק באמצעות מלקחיים כירורגיים מספריים. השתמש גזה סטרילי עבור המוסטאסיס ובזהירות לבדוק לאורך קנה הנשימה על מנת להבטיח כי כל הרקמות הירוקות הוסרו.
13. סגור את שרירי paratracheal ידי תפר שהופסק באמצעות 6-0 polyglactin 910 תפרים. סגירת החתך בעור על ידי תפר הלסטד באמצעות 6-0 polyglactin 910 תפרים.
14. אופציונלי: להזריק 10 μL / g משקל הגוף סטרילי פתרון נתרן כלורי נורמלי 0.9% על עכברים עבור החלפת נוזל.
15. מניחי חיות לאחר ניתוח כדי בכלוב נפרד על חממה חמה (37 מעלות צלזיוס) במשך התאוששות טמפרטורת גוף. לאחר העכברים הם ערים במצב שכיבה, לשים גלולת צ'או ומים עם קצת אוכל ג'לטין על רצפת הכלוב.
16. לאחר תקופת תצפית שלאחר ניתוח של 2 שעות, לחזור עכבר למתקן בעלי החיים בהתאם לדרישות מקומיות לטיפול לאחר ניתוח.
17. 3 ימים לאחר parathyroidectomy, להשיג 10 μL הזנב דם ולמדוד דם מיונן Ca ⁺⁺ באמצעות מנתח כגון מערכת גז דם Ca ⁺⁺ / מנתח pH. תוצאות parathyroidectomy מוצלחות בדם מיונן Ca ⁺⁺ שווה או נמוך מ -2SD של קון דמה מופעלעכברי trol (1.20 mmol / L בניסויים שלנו של n = 30).

2. PTH-CRE-iDTR עכברים

1. השג PTHcre ⁺ ו- DTR ^{fl / fl} עכברים ב 8 - 10 שבועות לזיווג.
2. הכלאה לאחור עכברי PTHcre (המעורבים 129; רקע FVB) עם C57BL / 6 עכברים עבור 6 דורות להשיג עכברים עם רקע C57BL / 6.
3. משפחה מזדווגים PTHcre ⁺ (רקע C57BL / 6) עכברים להשיג PTHcre ^{+ / +} עכברים ^17.
   הערה: כדי לבצע גנוטיפ, דנ"א טיפי זנב עכברים הופק המשמש PCR. Primers Genotyping: פריימר קדימה, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, הפוך פריימר ', TCAGATCACACCACACAGCA, B פריימר קדימה, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, הפוך B פריימר', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ^17.
4. Mate PTHcre ^{+ / +} עכברים ¹⁶ עם DTR ^{fl / fl} עכברים ¹⁹ להשיג עכברים PTHcre-iDTR.
5. כן פתרון DT ידי דילול diphtheriאבקת רעלן עם תמיסת מלח סטרילית לריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל. aliquots סינון סטרילי, ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
6. בחר 8 - 10 שבועות עכברי PTHcre-iDTR עבור ניסוי הזרקה. ההפשרה DT aliquot לטמפרטורת החדר, לנהל DT intraperitoneally ב 5 מיקרוגרם / ק"ג (10 μL / g) במשקל של החיה. לקבלת יעילות מירבית רעילה לפחות, ממשל DT חוזר עבור סכום כולל של 2 זריקות במרווח 3 ימים ^17.
7. 3 ימים לאחר הזריקה השנייה, לקחת 10 דם הזנב μL מכל מנתח PTHcre-iDTR / PTHcre-iDTR-mTmG העכבר ולמדוד Ca דם ⁺⁺ באמצעות Ca מערכת הדם גז ⁺⁺ / pH.
   הערה: אנו מגדירים עכברים עם דם מיונן Ca ⁺⁺ נמוך מ 1.18 מילימול / ליטר כעכברים hypoparathyroid, אשר שווה 2SD מתחת לממוצע של עכברים שליטה הזריק הרכב (n = 22).

מיקום של בלוטת יותרת התריס

ראשית, הקלטנו את ההפצה של בלוטת יותרת התריס של 54 עכברים PTHcre-mTmG כפי שנצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה. 74% (40/54) עכברים היו שתי בלוטת יותרת תריס ירוק (איור 1 א, ג, ה), 26% (14/54) עכברים היו בלוטת יותרת תריס שלישית נוספת (איור 1 ב ', ד', ו '). שום עכבר עם בלוטה אחת או יותר משלוש בלוטות נצפה. בדרך כלל, בלוטת יותרת התריס אותרו ליד הגבול מעולה של בלוטת התריס (58%, 71/122; איור 1 א (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) בלוטות אותרו ליד הגבול הנח של בלוטת התריס (תרשים 1C (1), ד '(3), F (1)), ו -13% (16/122) היה ממוקם הרחק tבלוטת hyroid (איור 1B (3), E (1), F (2)). הממצאים שלנו עולים בקנה אחד עם ולהרחיב ממצאים קודמים של משתנים המיקומים של בלוטת יותרת התריס ^20.

עכברי GFP-PTX

הניתוח כולו מן ההרדמה כדי לסגור את החתך בעור לקח בערך 20 דקות לכל עכבר. שיעור ההישרדות של עכברים לאחר ניתוח על פני תקופת תצפית 3 חודשים היה 96.3% (53/55). 92.4% (49/53) GFP-PTX עכברים הציגו רמות סידן מיונן שהיו 2 SD מתחת לממוצע של עכברי שליטת דמה מופעל או נמוכים. פנוטיפ hypoparathyroid בעכברי GFP-PTX (היפוקלצמיה, PTH הנמוך פוספט בסרום הגבוה) היה יציב בפעם התצפית כולו של 3 חודשים. חשוב לציין, תפקוד בלוטת תריס לא היה שונה מחיות דמה מופעל 3 חודשים לאחר הניתוח (TSH = 42 ± 24 לעומת 30 ± 15 mU / L, p = 0.171; T4 = 3.0 ± 0.6 לעומת 3.1 ± 0.9 מיקרוגרם / ד"ל, p = 0.707 (איור 2).

עכברים PTH-cre-iDTR

DT מוזרק עכברי PTH-Cre-iDTR היפופרתירואידיזם מפותח (סידן נמוך בדם מיונן, זרחן בדם, ורמות PTH נמוכות נורמליות בצורה בלתי הולם). יש לנו הדיווח בעבר כי כמה תאים חיוביים PTH לברוח אבלציה ידי רעלן הדיפטריה, המסביר את PTH במחזור המדיד ואת ולכן הפנוטיפ מעט מתון יותר של עכברים אלה ^17.

היפופרתירואידיזם עכברים GFP-PTX ו PTH-cre-iDTR עכברים

הפחתה משמעותית של Ca דם ⁺⁺ ורמות PTH בסרום נצפו עכברים GFP-PTX 3 ימים לאחר הניתוח, לעומת רמות שנמצאו בעכברים דמה המופעלים (Ca ⁺⁺ = 1.05 ± 0.40 לעומת 1.30 ± 0.03 מילימול / ליטר, p <0.05; PTH = 32 ± 22 לעומת 580 ± 137 pg / mL, p <0.05). פנוטיפ היפופרתירואידיזם היה יציב לאורך תקופת המעקב 3 חודשים (איור 3 א, נדפס באישור (הפניה # 17)). לאחר 2 זריקות של 5 מיקרוגרם / ק"ג DT במרווח 3 ימים, מנה ואת משטר אופטימיזציה להשתמש את הכמות המינימלית של DT לתת את הפנוטיפ hypoparathyroid המקסימלי באותו DT מוזרק CRE-PTH-iDTR עכברים הראו היפוקלצמיה המשמעותיים PTH מופחת לעומת עכברים שליטים ברכב, שהתמידו במשך תקופת מעקב 90 ימים (Ca ⁺⁺ = 1.10 ± 0.07 מילימול / ליטר לעומת 1.26 ± 0.05 מילימול / ליטר, p <0.05; PTH = 218 ± 156 pg / mL לעומת 572 ± 164 pg / מ"ל, p <0.05) (איור 3 ב, נדפס באישור (הפניה # 17)).

איור 1: תמונות נציג של מיקומים שונים של בלוטת יותרת התריס ב -54 עכברים PTHcre-mTmG תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה. היו עכברים או שני (A, C, E) או שלוש (B, D, F) בלוטת יותרת התריס ירוק. רוב בלוטת יותרת תריס אותר ליד הגבול המעולה (A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3) או סמוך לגבול הנח של בלוטת התריס (C (1), ד '(3), F (1)). במקרים נדירים, חלקם אותרו ectopically (B (3), E (1), F (2)). נא ללחוץ כאן לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: TSH ו- T4 רמה של עכברים GFP-PTX. 3 חודשים לאחר GFP-PTX, סרום הושג עבור TSH ו- T4 measurem מציג. עכברי GFP-PTX הראו ריכוזי TSH (42 ± 24 mU / L) (א) וריכוזי T4 (3.0 ± 0.6 מיקרוגרם / ד"ל) (B) שלא היו שונים מעכברי שליטה (TSH = 30 ± 15 mU / L, p = 0.171, n = 11, T4 = 3.1 ± 0.9, p = 0.707, n = 11). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: דם Ca ⁺⁺ רמות PTH עכברי GFP-PTX ו DT מוזרקים עכברי PTH-CRE-iDTR. שני עכברי GFP-PTX (א) ו DT מוזרקים PTH-CRE-iDTR עכברים (B) הציג היפוקלצמיה יציבה מופחתים רמות PTH מעל 3 תקופת תצפית חודש (N = 6 - 8, *** p <0.001) (מחדש מודפסים באישור התייחסות # 17).es / ftp_upload / 55,010 / 55010fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אנו מדגימים את הטכניקה של parathyroidectomy GFP-מודרך באמצעות עכברים מהונדסים עם ביטוי של GFP סלקטיבי בלוטת יותרת התריס. בשנתי ה PTHcre; עכברי mTmG, הקרינה הכפולה (ה- GFP הירוק בתאים הביעו Cre בניות אדומות הלא-Cre הביע תאים) אפשרה לנו לזהות בבירור, וכדי להסיר כל בלוטת יותרת התריס בדיוק מבלי להסיר את התריס. למרות שאנו מעדיפים את השימוש של עכברי פעמי קרינת mTmG על היכולת לזהות רקמות שאינן יותרת תריס אדום ניאון, ההליך שלנו צריך גם לעבוד גם באמצעות חיות פלורסנט יחידות כגון אדום העגבני (B6.Cg-CT (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) העכבר. ההליך הוא יחסית קל לבצע, דורש כ 20 דקות לכל עכבר, והתוצאות פנוטיפ hypoparathyroid חמורה ומתמשכת.

בנוסף, יתרון נוסף של בלוטת יותרת התריס GFP חיובי הוא הקלות של זיהוי של בלוטת יותרת התריס סוטה. המחקרים שלנו להפגיןmislocalization של parathyroids ב כרבע עכברים B6 (איור 1), אשר מזוהים בקלות במודל העכבר שלנו על ידי פלואורסצנטי ירוק. בניגוד thyro-parathyroidectomy, הטכניקה שלנו תמנע את הסרת בלוטת התריס עם צורך עוקב עבור החלפת הורמון בלוטת תריס ואת האפקט לא הידוע של הסרת תאי C קלציטונין לייצור תריס. Fluorescently שכותרתו בלוטת יותרת התריס יכול לשמש גם עבור חקירות אחרות שדורשות את בידודה של בלוטת יותרת התריס. המגבלה של מודל זה כולל את הדרישה לניתוח. מיומנויות המיקרו-כירורגיה בסיסי מיקרוסקופ לנתיחה עם מקור אור ניאון נדרשים.

טכניקה שנייה ליצירת עכברי hypoparathyroid זה מבטל את הצורך בניתוח מודגמת. דיפטריה רעלן שטופל עכברי PTHcre-iDTR תערוכת פנוטיפ היפופרתירואידיזם מתון, אבל פשוט דורשים הזרקת DT intraperitoneally לתוך העכבר. החלק הקריטי FOr יצירת מודל זה היה אופטימיזציה של מינון ומינון משטר. מינונים גבוהים של DT הובילו רעילות אך במינונים נמוכים ירדו את היעילות של הגישה. קבענו כי הגדוד מנה של 2 זריקות ב 5 מיקרוגרם / ק"ג, מנוהל בנפרד 3 ימים, הביא היפוקלצמיה אמין ויציב ללא / תמותה מינימלית.

בסופו של דבר, אנו מקווים כי שתי גישות אלה מספקים במודלים של עכברים שימושיים היפופרתירואידיזם רכש. באמצעות PTH ארוך טווח רומן, דיווחנו השימוש הראשון של שני המודלים האלה בקביעת היעילות של תרופות חדשות היפופרתירואידיזם ^17.

The authors declare that they have no competing financial interests.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH R01-DK100584 וסין מדינת מפתח מעבדה של מחלות הפה SKLOD2015OF01 מימון פתוח (RB). אנו מודים Wenping זאו, Tadatoshi סאטו, וקלי לאוטר לעזרה.