اثنين من التقنيات لخلق الفئران قصور الدريقات: استئصال جارات الدرق عن طريق GFP الغدد والخناق-السمية بوساطة الغدة الدرقية تذرية

Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.

Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre⁺ mice with Rosa-mTmG^fl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.

منذ الوصف المنهجي الأول من الغدد الدرقية في الإنسان والعديد من الأنواع الأخرى التي ساندستروم في عام 1880 ^1، وفهم أهمية هذا الجهاز الغدد الصماء صغير لعلم وظائف الأعضاء البشرية ومرض تحسن مستمر. الغدة الدرقية تفرز هرمون الغدة الدرقية (PTH)، المنظم الرئيسي لاستقلاب الكالسيوم. PTH هو أيضا هورمون مهم لتوازن الفوسفات ودوران العظم ^{1 و 2.} إزالة عرضي أو الضرر من parathyroids خلال جراحة الرقبة هي السبب الأكثر شيوعا لقصور جارات الدرق، وهو مرض يتميز منخفضة الكالسيوم في الدم، وانخفاض PTH، والفوسفور مرتفعة ^1.

لدراسة أفضل المكتسبة قصور جارات الدرق واختبار العلاجات الرواية، يمكن الاعتماد عليها وسهولة مطلوبة نماذج الماوس يمكن الوصول إليها. وتستخدم على نطاق واسع في الفئران البحثية لمجموعة واسعة من الأدوات الوراثية هيتوفرة في هذا النوع يسمح دراسات الميكانيكية المتطورة في الجسم الحي. ومع ذلك، في حين استئصال جارات الدرق الجراحية (PTX) يمكن استخدامها في الفئران ^{2، 3، 4، 5،} والثدييات الكبيرة ^{6، 7، 8،} فمن الناحية الفنية صعبة للغاية في الفئران بسبب صغر حجم الغدد والتوزيع التشريحي متغير بهم ^9. لذلك، يتم تنفيذ thyro-استئصال جارات الدرق (TPTX) عادة في الفئران، حيث يتم إزالة الغدة الدرقية والغدة الدرقية معا ^(10). ومع ذلك، وانخفاض مستويات هرمون الغدة الدرقية هي المحير المحتملين في التجارب، وتعقيد هذا النموذج. وبالإضافة إلى ذلك، يتم فقدان C-الخلايا داخل الغدة الدرقية، والتي تنتج الكالسيتونين، وهو هرمون مهم في توازن الكالسيوم في القوارض وأيضا على إزالة الyroids ^11.

عدة نماذج الماوس الوراثية للقصور جارات الدرق موجودة، والتي تشمل-PTH باطل الماوس ^12، و-GCM2 اغية الماوس ^13، والماوس NUF مع طفرة في تفعيل مستقبلات الاستشعار الكالسيوم (CASR) ^{14، 15.} ومع ذلك، هذه العيوب الوراثية موجودة بالفعل أثناء التطور الجنيني، وبالتالي وظيفة parathyroids ضعف بالفعل خلال مرحلة التطور الجنيني. وهذا يمكن أن يؤثر على تطوير الأجهزة مثل الهيكل العظمي. وهذا يتناقض مع المرضى الذين يعانون من قصور جارات الدرق بعد اجراء العمليات الذين يحصلون على المرض في وقت لاحق في الحياة. وعلاوة على ذلك، فإن بعض هذه نماذج الماوس تظهر الفتك المبكرة وانخفاض الخصوبة، مما يزيد من تعقيد استخدامها ^{12 و 13 و 14.}

قمنا بتطوير اثنين من جديد الماوس مodels لقصور جارات الدرق المكتسبة. باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP تحديدا في parathyroids يسمح الغدد الدرقية ليكون من السهل التعرف على الاستئصال الجراحي دون إزالة الغدة الدرقية. تم إنشاء هذا الفأر من خلال عبور الماوس PTH-لجنة المساواة العرقية، التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية recombinase تحت سيطرة 5.5 كيلوبايت PTH المروج ¹⁶ مع الماوس ROSA ^mTmG. الناتج PTHcre، الفئران mTmG تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر تحديدا في الخلايا الدرقية. يستخدم نموذج الفأر الثاني نفس PTH-لجنة المساواة العرقية، وهذه المرة لإزالة كاسيت إيقاف من الماوس DTR محرض، مما أدى إلى التعبير عن مستقبلات ذيفان الخناق على وجه التحديد في parathyroids. إدارة النظامية من DT يدمر الخلايا الدرقية، مما يجعل الحيوانات قصور الدريقات دون جراحة.

نماذج الماوس اثنين المعروضة في هذه الدراسة تثبت النمط الظاهري نقص كالسيوم الدم مستقرا على شبه الملاحظة لمدة ثلاثة أشهرالتطوير التنظيمي. إجراءات سهلة لأداء والنمط الظاهري هو تكرار لل، والفئران قصور الدريقات تظهر ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة ^17.

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من مستشفى ماساتشوستس العام. الحصول على موافقة المؤسسية المناسبة لهذه الدراسة الحيوان قبل البداية. قد يتعين تعديلها وفقا لمتطلبات IACUC المحلية بعض التقنيات.

1. الفئران GFP-PTX

1. الحصول على الفئران PTHcre ⁺ والفئران روزا-mTmG في 8-10 أسابيع من العمر لمزيد من التزاوج.
2. متصالب رجعي على PTHcre ⁺ الفئران (مختلطة 129، FVB الخلفية) مع C57BL / 6 الفئران لمدة 6 أجيال للحصول على الفئران مع C57BL / 6 الخلفية.
3. الفئران Inbreed PTHcre ⁺ للحصول على PTHcre ^{+ / +} الفئران ^17.
   ملاحظة: لإجراء التنميط الجيني، واستخراج الحمض النووي من طرف الذيل واستخدامها لPCR. الاشعال PCR للتحقق من تغاير وجود زيجوت متماثلة الألائل من التحوير PTHcre هي على النحو التالي: إلى الأمام التمهيدي A، CCTGTCAAGGATGTGGAAGA، عكس التمهيدي A '، TCAGATCACACCACACAGCA، وorward التمهيدي B، CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG، عكس التمهيدي B '، GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ^17.
4. الصليب PTHcre ^{+ / +} الفئران ¹⁶ مع روزا-mTmG الفئران ^18. فطم PTHcre، الجراء mTmG عندما 4 أسابيع من العمر.
5. تخدير 8 - PTHcre 10 أسابيع من العمر، الفئران mTmG عن طريق الحقن الملكية الفكرية للثلاثي بروم إيثانول (آفيرتين) في 0.6 ملغ / غرام من وزن الجسم، أو غيرها من العوامل مثل الكيتامين / زيلازين. استخدام البوبرينورفين 0.1 ملغ / كغ الشوري كل 12 ساعة بمثابة مسكن لمدة 48 ساعة بعد الجراحة وفقا لبروتوكول المعتمد. ضمان العمق المناسب لالتخدير بواسطة منعكس قرصة أخمص قدميه انسحاب أو وسائل أخرى. وضع الحيوان في موقف ضعيف.
6. توسيع وتهيئة منطقة الرقبة بطني عن طريق حلق الجلد باستخدام شفرات حافة واحدة. تطهير الجلد حلق مع لوحة مطهر البوفيدون اليود.
7. تغطية الحيوان مع الستائر الجراحية المعقمة للحد من التلوث من موقع الجراحية واستخدام هيئة التصنيع العسكري تعقيمهاأدوات rosurgical لإجراء العمليات الجراحية.
8. قطع شق طولي 2 سم في الجلد مع مشرط جراحي. تشريح اللفافة ودفع الغدد اللعابية إلى الجانب من قبل تشريح حادة مع ملقط مسنن المنحنية.
9. تحت المجهر تشريح باستخدام ضوء الهالوجين و4 - التكبير 5X، وقطع وفصل العضلات المجاورة للرغامى باستخدام الملقط حادة نصائح وفضح القصبة الهوائية.
10. تحديد الغدة الدرقية مع اليمين واليسار الفص تقع بالقرب من القصبة الهوائية.
11. التبديل مصدر الضوء لضوء الفلورسنت وتصور اثنين من الغدد جارات الدرق الخضراء الاستشعاع.
    ملاحظة: عادة، يتم وضع اثنين من الغدد الدرقية عند أو بالقرب من سطح الغدد الدرقية، ولكن في بعض الأحيان، فهي تقع على مسافة أبعد.
12. إزالة بعناية الغدد الدرقية الخضراء باستخدام ملقط الجراحة ومقص. استخدام شاش معقم لالارقاء والتحقق بعناية على طول القصبة الهوائية للتأكد من أن تمت إزالة جميع الأنسجة الخضراء.
13. إغلاق العضلات المجاورة للرغامى التي كتبها خياطة متقطعة باستخدام 6-0 polyglactin 910 الغرز. إغلاق شق الجلد عن طريق خياطة هالستيد باستخدام 6-0 polyglactin 910 الغرز.
14. اختياري: حقن 10 ميكرولتر / ز وزن الجسم معقمة العادي 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم للفئران لاستبدال السوائل.
15. وضع الحيوانات بعد الجراحة إلى قفص منفصل عن حاضنة دافئة (37 درجة مئوية) لمدة الانتعاش درجة حرارة الجسم. وبمجرد أن الفئران هي مستيقظا وفي وضعية الاستلقاء، ووضع طعام بيليه والماء مع بعض الجيلاتين الطعام على الأرض القفص.
16. بعد فترة مراقبة بعد الجراحة من 2 ساعة، والعودة الماوس إلى منشأة الحيوان وتابع المتطلبات المحلية للحصول على الرعاية بعد الجراحة.
17. بعد 3 أيام استئصال جارات الدرق، الحصول على 10 ميكرولتر ذيل الدم وقياس الدم المتأينة ^{الكالسيوم} باستخدام محلل مثل نظام الغاز في الدم ^{الكالسيوم} / درجة الحموضة محلل. النتائج استئصال جارات الدرق الناجحة في الدم المتأين ^{الكالسيوم} يساوي أو أقل من -2SD من يخدع الشام التي تديرهاالفئران المحول المتعدد العادي (1.20 مليمول / لتر في تجاربنا ن = 30).

2. PTH-لجنة المساواة العرقية-iDTR الفئران

1. الحصول على PTHcre ⁺ وDTR ^{فلوريدا / فلوريدا} الفئران في 8-10 أسابيع من العمر للتزاوج.
2. متصالب رجعي الفئران PTHcre (مختلطة 129، FVB الخلفية) مع C57BL / 6 الفئران لمدة 6 أجيال للحصول على الفئران مع C57BL / 6 الخلفية.
3. Inbreed وPTHcre ⁺ (C57BL / 6 الخلفية) الفئران للحصول على PTHcre ^{+ / +} الفئران ^17.
   ملاحظة: لإجراء التنميط الجيني، تم استخراج الحمض النووي من الفئران نصائح الذيل واستخدامها لPCR. الاشعال التنميط الجيني: إلى الأمام التمهيدي A، CCTGTCAAGGATGTGGAAGA، عكس التمهيدي A '، TCAGATCACACCACACAGCA، إلى الأمام التمهيدي B، CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG، عكس التمهيدي B'، GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ^17.
4. ماتي PTHcre ^{+ / +} الفئران ¹⁶ مع سرعة نقل البيانات تصل ^{فلوريدا / فلوريدا} الفئران ¹⁹ للحصول على الفئران PTHcre-iDTR.
5. يعد حل DT عن طريق تمييع diphtheriمسحوق السم مع ملحي معقم إلى تركيز 0.5 ميكروغرام / مل. تصفية العقيمة، وتخزين aliquots في -80 درجة مئوية.
6. اختيار 8 - الفئران PTHcre-iDTR 10 أسابيع من العمر لتجربة الحقن. ذوبان الجليد DT قسامة إلى درجة حرارة الغرفة وادارة DT البريتونى في 5 ميكروغرام / كغ (10 ميكرولتر / ز) وزن الجسم للحيوان. لتحقيق الكفاءة القصوى وأقل سمية، ويتكرر إدارة DT لما مجموعه 2 الحقن في فترة 3 أيام ^17.
7. بعد 3 أيام من الحقنة الثانية، يستغرق 10 ميكرولتر ذيل الدم من كل PTHcre-iDTR / PTHcre-iDTR-mTmG الماوس وقياس الكالسيوم في الدم ⁺⁺ باستخدام نظام الدم الغاز ^{الكالسيوم} / درجة الحموضة محلل.
   ملاحظة: نحن نعرف الفئران مع الدم المتأين ^{الكالسيوم} أقل من 1.18 مليمول / لتر كما الفئران قصور الدريقات، أي ما يعادل 2SD أقل من المتوسط من السيطرة على الفئران المحقونة السيارة (ن = 22).

موقع الغدة الدرقية الغدد

أولا، سجلنا توزيع الغدد الدرقية من 54 الفئران PTHcre-mTmG كما لوحظ تحت المجهر تشريح الفلورسنت. 74٪ زيارتها (40/54) الفئران اثنين من الغدد جارات الدرق الخضراء (الشكل 1A، C، E)، و 26٪ زيارتها (14/54) الفئران الغدة الدرقية ثالثة إضافية (الشكل 1B، D، F). لم يلاحظ أي الفأر مع غدة واحدة أو أكثر من ثلاثة الغدد. عادة، وتقع الغدد الجار درقية بالقرب من الحافة العلوية للغدة الدرقية (58٪، 71/122، الشكل 1A (1،2)، B (1،2)، ج (2)، د (1،2)، E (2)، و (3)). وتقع 27٪ (33/122) الغدد بالقرب من الحدود السفلي للغدة الدرقية (الشكل 1C (1)، د (3)، و (1))، و 13٪ (16/122) وتقع بعيدا عن رالغدة hyroid (1B الشكل (3)، E (1)، و (2)). نتائجنا تتفق مع وتمتد النتائج السابقة للمواقع الغدد جارات الدرق ²⁰ متفاوتة.

الفئران GFP-PTX

عملية جراحية كامل من التخدير لإغلاق شق الجلد أخذت ما يقرب من 20 دقيقة في الماوس. وكان معدل البقاء على قيد الحياة من الفئران بعد الجراحة خلال فترة الملاحظة لمدة 3 أشهر 96.3٪ (53/55). 92.4٪ (49/53) الفئران GFP-PTX أظهرت مستويات الكالسيوم المؤينة التي كانت 2 SD أقل من المتوسط ​​من السيطرة على الفئران الشام التي تديرها أو أقل. كان النمط الظاهري قصور الدريقات في الفئران GFP-PTX (نقص كلس الدم، وانخفاض PTH والفوسفات في الدم مرتفعة) مستقر للمرة الملاحظة بأكمله من 3 أشهر. الأهم من ذلك، كانت وظيفة الغدة الدرقية لا تختلف عن الحيوانات الشام التي تديرها بعد 3 أشهر لعملية جراحية (TSH = 42 ± 24 مقابل 30 ± 15 مو / L، ص = 0.171، T4 = 30.0 ± 0.6 مقابل 3.1 ± 0.9 ميكروغرام / ديسيلتر، ص = 0.707 (الشكل 2).

PTH-لجنة المساواة العرقية-iDTR الفئران

حقن الفئران DT-PTH لجنة المساواة العرقية iDTR قصور جارات الدرق وضعت (دم منخفض المتأينة الكالسيوم، وارتفاع الفوسفور في الدم، ومستويات PTH غير لائق المنخفضة للطبيعية). لقد ذكرت سابقا أن الخلايا إيجابية قليلة PTH هربا من الاجتثاث عن ذيفان الخناق، وشرح للقياس تعميم PTH وبالتالي فإن النمط الظاهري أخف نوعا ما من هذه الفئران ^17.

نقص نشاط جارات الدرق في الفئران GFP-PTX وPTH-لجنة المساواة العرقية-iDTR الفئران

وقد لوحظت تخفيضات كبيرة من الكالسيوم في الدم ⁺⁺ ومستويات PTH المصل في GFP-PTX الفئران بعد 3 أيام من الجراحة، مقارنة مع المستويات التي وجدت في الفئران الشام التي تديرها ^{(الكالسيوم} = 1.05 ± 0.40 مقابل 1.30 ± 0.03 مليمول / لتر، ف <0.05. PTH = 32 ± 22 مقابل 580 ± 137 غ / مل، ف <0.05). كان النمط الظاهري قصور جارات الدرق مستقرا خلال فترة المراقبة لمدة 3 أشهر (الشكل 3A، وأعيد طبعه بإذن من (مرجع رقم 17)). بعد 2 الحقن من 5 ميكروغرام / كغ DT في 3 أيام الفاصلة، جرعة ونظام الأمثل لاستخدام أقل قدر من DT إلى إعطاء النمط الظاهري قصور الدريقات القصوى، حقن DT أظهرت الفئران iDTR-لجنة المساواة العرقية PTH نقص كلس الدم كبير وانخفاض PTH مقارنة الفئران السيطرة على السيارة، والتي استمرت على مدى فترة المراقبة 90 يوما ^{(الكالسيوم} = 1.10 ± 0.07 مليمول / لتر مقابل 1.26 ± 0.05 مليمول / لتر، ف <0.05، PTH = 218 ± 156 غ / مل مقابل 572 ± 164 خريج / مل، ف <0.05) (الشكل 3B، وأعيد طبعه بإذن من (مرجع رقم 17)).

شكل 1: الصور التمثيلية للمواقع مختلفة من الغدة الدرقية الغدد في 54 الفئران PTHcre-mTmG تحت نيون تشريح مجهر. كان الفئران إما اثنين (A، C، E) أو ثلاثة (B، D، F) الغدة الدرقية الخضراء. وتقع الغدد الدرقية الأكثر بالقرب من الحافة العلوية (A (1،2)، B (1،2)، (2) C، D (1،2)، E (2)، و (3) أو بالقرب من الحدود أدنى للغدة الدرقية (C (1)، د (3)، و (1)). وفي حالات نادرة، وتقع بعض ectopically (B (3)، E (1)، و (2)). الرجاء النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: TSH و T4 مستوى من الفئران GFP-PTX. بعد 3 أشهر GFP-PTX، تم الحصول على المصل لTSH و T4 measurem الوالدان. أظهر GFP-PTX الفئران تركيزات TSH (42 ± 24 / مو L) (أ) و T4 تركيزات (3.0 ± 0.6 ميكروغرام / ديسيلتر) (B) التي كانت لا تختلف من السيطرة على الفئران (TSH = 30 ± 15 مو / L، ص = 0.171، ن = 11، T4 = 3.1 ± 0.9، ع = 0.707، ن = 11). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): الدم ^{الكالسيوم} ومستويات PTH في الفئران GFP-PTX وDT المصبوبة الفئران-iDTR-لجنة المساواة العرقية PTH. كل من الفئران GFP-PTX (A) وDT حقن الفئران (ب) عرضت نقص كلس الدم مستقرة، لجنة المساواة العرقية-iDTR PTH وانخفاض مستويات PTH أكثر من 3 أشهر فترة المراقبة (N = 6-8، *** ع <0.001) (إعادة طبع بإذن من المرجع رقم 17).وفاق / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ونحن لشرح تقنية استئصال جارات الدرق الموجهة GFP باستخدام الفئران المعدلة وراثيا مع التعبير GFP انتقائي في الغدد الدرقية. في PTHcre، الفئران mTmG، مضان مزدوج (في GFP الأخضر في خلايا جنة المساواة العرقية، أعرب والأحمر الطماطم في غير لجنة المساواة العرقية أعرب خلايا) مكنتنا من التعرف بشكل واضح، وإزالة بدقة كل الغدة الدرقية دون إزالة الغدد الدرقية. بينما نحن نفضل استخدام مزدوج مضان mTmG الفئران من اجل القدرة على تحديد الأنسجة الحمراء الفلورسنت غير الدرقية، يجب إجراء دينا أيضا تعمل بشكل جيد باستخدام حيوانات الفلورسنت واحدة مثل الأحمر الطماطم (B6.Cg-ط (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) الماوس. هذا الإجراء هو من السهل نسبيا على القيام بها، يتطلب حوالي 20 دقيقة في الماوس، والنتائج في النمط الظاهري قصور الدريقات الشديد والمستمر.

وبالإضافة إلى ذلك، هناك ميزة أخرى في الغدد الدرقية GFP إيجابية هو سهولة الكشف عن الغدة الدرقية الشاذة. تظهر دراساتناmislocalization من parathyroids في حوالي ربع الفئران B6 (الشكل 1)، والتي يتم الكشف عنها بسهولة في نموذج الفأر لدينا من قبل مخضر. وخلافا للthyro-استئصال جارات الدرق، لدينا تقنية تتجنب إزالة الغدة الدرقية مع الحاجة لاحقة لاستبدال هرمون الغدة الدرقية وتأثير غير معروف من إزالة الغدة الدرقية C-الخلايا المنتجة للالكالسيتونين. يمكن أن تستخدم أيضا الغدة الدرقية fluorescently المسمى لالتحقيقات الأخرى التي تتطلب العزلة في الغدد الدرقية. الحد من هذا النموذج يتضمن شرط لإجراء عملية جراحية. مطلوبة مهارات جراحة بسيطة والمجهر تشريح مع مصدر ضوء الفلورسنت.

وأظهر التقنية الثانية لتوليد الفئران قصور الدريقات أن يلغي الحاجة لإجراء عملية جراحية. ذيفان الخناق-معاملة الفئران PTHcre-iDTR تبدي أكثر اعتدالا قصور جارات الدرق النمط الظاهري، ولكن ببساطة تتطلب حقن DT البريتونى في الفأر. الجزء الحاسم FOص يولد هذا النموذج وتعظيم الاستفادة من جرعة ومعايرة نظام. أدت جرعات عالية من DT إلى سمية ولكنها انخفضت الجرعات المنخفضة فعالية هذا النهج. توصلنا إلى أن الفوج جرعة من 2 الحقن في 5 ميكروغرام / كغ، وتدار 3 أيام على حدة، أسفرت عن نقص كلس الدم موثوقة ومستقرة مع رقم / الحد الأدنى من الوفيات.

في نهاية المطاف، ونحن نأمل أن هذين النهجين توفر نماذج الماوس مفيدة لقصور جارات الدرق المكتسبة. باستخدام PTH طويل المفعول الرواية، وذكرت لنا أول استخدام كل من هذه النماذج في تحديد فعالية عقاقير جديدة لقصور جارات الدرق ^17.

The authors declare that they have no competing financial interests.

هذا العمل كان مدعوما من المعاهد الوطنية للصحة منح R01-DK100584 والصين مختبر مفتاح الدولة من أمراض الفم المفتوح SKLOD2015OF01 التمويل (RB). نشكر خه ون بينغ تشاو، تاداتوشي ساتو، وكيلي Lauter للحصول على المساعدة.