Hypoparathyroidマウスを作成するための2つのテクニック：副甲状腺GFP腺およびジフテリア毒素媒介副甲状腺アブレーションを使用して

Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.

Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre⁺ mice with Rosa-mTmG^fl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.

人間の生理と疾患のためのこの小さな内分泌器官の重要性を理解する1880年¹中のヒトおよびサンドストロームによって、いくつかの他の種における副甲状腺の最初の体系的な説明、以来継続的に改善しています。副甲状腺は副甲状腺ホルモン（PTH）、カルシウム代謝の主要な調節因子を分泌します。 PTHはまた、リン酸の恒常性と骨代謝回転^1、2のための重要なホルモンです。首の手術中の副甲状腺の脱落や破損が副甲状腺機能低下症の最も一般的な原因、低い血中カルシウム、低PTH、および高いリン¹によって特徴付けられる疾患です。

優れた研究に副甲状腺機能低下症とテストの新規治療法を取得し、簡単に信頼性が高く、アクセス可能なマウスモデルが必要とされています。遺伝的ツールの多種多様であるため、マウスは、広く研究に使用されていますin vivoで洗練された機構研究を可能にするこの種で利用できます。外科副甲状腺（PTX）は、ラット^{2、3、4、5、}及び大型哺乳類^6、7、8で使用することができるがしかし、それは、技術的理由腺のサイズが小さいと、その変数の解剖学的分布のマウスでは非常に困難です^9。したがって、THYRO、副甲状腺（TPTX）は、典型的には、甲状腺および副甲状腺が一緒¹⁰を除去されたマウスで行われます。しかし、低甲状腺ホルモンレベルは、このモデルを複雑に、実験における潜在的な交絡因子です。また、カルシトニン、げっ歯類におけるカルシウム恒常性に重要なホルモンを産生する甲状腺内のC-細胞は、また目の除去の際に失われますyroids ^11。

副甲状腺機能低下症のいくつかの遺伝的マウスモデルは、PTH-ヌルマウス^12、GCM2ヌルマウス^13、およびカルシウム感知受容体（CaSRを^）14、15における活性化変異を有するNUFマウスが含まれ、存在しています。しかしながら、これらの遺伝的欠損は、胚発生中に既に存在し、副甲状腺の機能は、したがって、既に胚形成の間に損なわれています。これは、骨格のような臓器の発達に影響を与えることができます。これは、その後の人生で病気を取得術後性副甲状腺機能低下症を有する患者とは対照的です。さらに、これらのマウスモデルのいくつかは、さらにそれらの使用^{12、13、14を}複雑早期致死性および減少生殖能力を示します。

我々は2つの新しいマウスメートルを開発しました後天性副甲状腺機能低下症のためodels。具体的には副甲状腺にGFPを発現する遺伝子改変マウスを使用すると、副甲状腺が簡単に甲状腺を除去することなく、外科的除去のために識別することができます。このマウスはROSA ^mTmGマウスで5.5キロバイトのPTHプロモーター¹⁶の制御下でCreリコンビナーゼを発現するPTH-のCreマウスを、交配することにより生成されました。その結果PTHcre; mTmGマウスは副甲状腺細胞に特異的に緑色蛍光タンパク質を発現します。 2番目のマウスモデルは、同じPTH-Creを、副甲状腺に特異的にジフテリア毒素受容体の発現をもたらす、誘導性DTRマウスからSTOPカセットを削除するには、この時間を使用しています。 DTの全身投与は、動物が手術なしでhypoparathyroidレンダリング、副甲状腺細胞を破壊します。

本研究で提示2つのマウスモデルは、3ヶ月の観測周囲にわたって安定した低カルシウム血症の表現型を実証しますOD。手順は実行が容易であり、表現型は再現性があり、かつhypoparathyroidマウスは、高い生存率^17を示します。

この研究は、マサチューセッツ総合病院の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。開始する前に、この動物研究のための適切な制度的承認を得ます。いくつかの技術は、ローカルIACUCの要件に応じて調整することが必要になる場合があります。

1. GFP-PTXマウス

1. さらに交配のために10週齢- 8でPTHcre ^+マウスとローザ・mTmGマウスを入手します。
2. C57BL / 6バックグラウンドをもつマウスを得るために、6世代にわたってC57BL / 6マウスを用いた;（FVB背景129混合）PTHcre ⁺マウスを戻し交配。
3. 近親交配するPTHcre ^+マウス PTHcre ^{+ / +}マウスの^17を得ました。
   注：、ジェノタイピングを行い、尾の先端からDNAを抽出し、PCRのためにそれを使用します。 、フォワードプライマーA、CCTGTCAAGGATGTGGAAGAをプライマーA '、TCAGATCACACCACACAGCAを逆に、F：PCRプライマーは以下の通りであるPTHcre導入遺伝子のヘテロ接合性およびホモ接合性をチェックしますorwardプライマーB、CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG、リバースプライマーB '、GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ^17。
4. ローザ・mTmGマウス¹⁸とのクロスPTHcre ^{+ / +}マウス^16。時4週齢mTmG仔; PTHcreを離乳させます。
5. トリブロモエタノールの腹腔内注射（アベルチン）によってmTmGマウスは0.6mg / g体重、またはそのようなケタミン/キシラジンなどの他の薬剤で、10週齢PTHcre - 8を麻酔。承認されたプロトコルに従って手術後48時間鎮痛剤としてブプレノルフィンを0.1mg / kg皮下12時間ごとを使用してください。つま先のピンチ引っ込め反射または他の手段によって麻酔の適切な深さを確認してください。仰臥位で動物を置きます。
6. 単一エッジのブレードを用いて皮膚を剃ることにより、腹側ネック領域を拡張し、準備します。ポビドンヨード消毒パッドで剃毛した皮膚を消毒します。
7. 手術部位の汚染を低減し、オートクレーブしたマイクを使用するために、滅菌外科用ドレープで動物をカバー外科的処置のためのrosurgical楽器。
8. 手術用メスで皮膚が2cm縦切開をカットします。筋膜を解剖し、湾曲した鋸歯状の鉗子で鈍的切開によって側に唾液腺を押してください。
9. ハロゲンライトと4を用いて解剖顕微鏡下で - 5X倍率を、カットし、シャープな鉗子のヒントを使用して、傍気管筋肉を分離し、気管を露出させます。
10. 次の気管に位置し、右と左葉で甲状腺を特定します。
11. 蛍光灯の光源を切り替えて、2つの緑色の蛍光を発する副甲状腺を可視化します。
    注：典型的には、2つの副甲状腺は、甲状腺の表面またはその近くに配置されていますが、時折、彼らはさらに離れて配置されています。
12. 慎重に手術用鉗子やハサミを使って緑色の副甲状腺を取り除きます。止血のために滅菌ガーゼを使用し、慎重にすべての緑の組織が削除されたことを確認するために気管に沿って確認してください。
13. 6-0ポリグラクチン910縫合糸を用いて結節縫合によって傍気管の筋肉を閉じます。 6-0ポリグラクチン910縫合糸を使用して、ハルステッド縫合によって皮膚切開を閉じます。
14. オプション：水分補給のためにマウスに10μL/ g体重の滅菌正常の0.9％塩化ナトリウム溶液を注入します。
15. 体温回復のための暖かいインキュベーター（37℃）に別々のケージに術後の動物を置きます。マウスが覚醒し、臥位になったら、ケージの床にいくつかのゼラチン食品とペレット餌と水を入れました。
16. 2時間の術後観察期間の後、動物施設にマウスを返し、術後のケアのための地域の要件に従ってください。
17. 3日間副甲状腺後、10μLの尾の血液を取得し、そのような血液ガスシステムのCa ⁺⁺ / pHはアナライザとしてアナライザを使用して^の Ca ⁺⁺イオン化した血液を測定します。血液中の成功した副甲状腺摘出術の結果は、Ca ⁺⁺同等または偽手術詐欺の-2SDよりも低いイオン化ントロールマウス（n = 30の実験で1.20ミリモル/ L）。

2. PTH-CRE-IDTRマウス

1. 交配のために古い10週- 8でPTHcre ⁺およびDTR ^{FL / FL}マウスを入手します。
2. C57BL / 6バックグラウンドをもつマウスを得るために、6世代にわたってC57BL / 6マウスを用いた;（FVB背景129混合）PTHcreマウスを戻し交配。
3. PTHcre ^+（C57BL / 6バックグラウンド）マウスはPTHcre ^{+ / +}マウス^17を得ること^が近親交配します。
   注：マウスの尾の先端からDNAを抽出し、PCRに使用した、遺伝子型決定を実行します。ジェノタイピングプライマー：フォワードプライマーA、CCTGTCAAGGATGTGGAAGA、GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT ¹⁷ 'プライマーB、逆、TCAGATCACACCACACAGCA、フォワードプライマーB、CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG'プライマーAを逆にします。
4. DTRとPTHcre ^{+ / +}マウス^{16メイト FL / FL} PTHcre-IDTRマウスを得るために、マウス^19。
5. diphtheriを希釈しDT溶液を調製0.5μgの/ mLの濃度に滅菌生理食塩水で毒素粉末。 -80℃で滅菌フィルター、および店舗アリコート。
6. 注入実験のための10週齢PTHcre-IDTRマウス - 8を選択してください。室温に解凍DTアリコートは、腹腔内に5μg/キロ（10μL/ g）を、動物の体重でDTを管理します。最大効率および最小毒性のために、DTの投与は3日間隔¹⁷における2回の注射の合計に対して繰り返されます。
7. 3日目の注射後に、各PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-mTmGマウスから10μLの尾の血液を取り、血液のCa ⁺⁺血液ガスシステムのCa ⁺⁺ / pHはアナライザを使用して測定します。
   注：我々は、Ca ⁺⁺ 1.18ミリモルビヒクル注射対照マウスの平均を下回る2SDに等しいhypoparathyroidマウスなど/ L、より低い（N = 22）イオン化した血液をマウスに定義します。

上皮小体の場所

蛍光解剖顕微鏡下で観察されるようにまず、我々は54 PTHcre-mTmGマウスの副甲状腺腺の分布を記録しました。 74％（54分の40）マウス2つの緑色副甲状腺を持っていた（ 図1A、C、E）、26％（54分の14）マウスの追加の第三副甲状腺（ 図1B、D、F）を有していました。単一腺または以上3腺とのマウスは観察されませんでした。通常、副甲状腺は、甲状腺（58％、122分の71の上縁の近くに位置していた; 図1A（1,2）、B（1,2）、C（2）、D（1,2）、E （2）、F（3））。 27％（122分の33）腺が甲状腺の下縁の近くに位置していた（ 図1Cは、（1）、D（3）、F は（1））、および13％（122分の16）を離れトンから位置していましたhyroid腺（ 図1B（3）、E（1）、F（2））。我々の調査結果はと一致しており、副甲状腺²⁰の位置を変化させるまでの知見を拡張します。

GFP-PTXマウス

皮膚切開を閉じるに麻酔から全体の手術は、マウス当たり約20分を要しました。 3ヶ月の観察期間にわたる術後のマウスの生存率は96.3％（53/55）でした。 92.4パーセント（53分の49）GFP-PTXのマウスは、偽手術対照マウス以下の平均より2 SDたイオン化カルシウムレベルを示しました。 GFP-PTXマウス（低カルシウム血症、低PTHおよび上昇した血清リン酸塩）でhypoparathyroid表現型は、3ヶ月の全観察時間安定でした。重要なことは、甲状腺機能は3ヶ月の手術後、偽手術動物からの差はなかった（TSH = 42±24対30±15 mUを/ L、P = 0.171; T4 = 30.0±0.6対3.1±0.9μgの/ dLで、P = 0.707（ 図2）。

PTH-CRE-IDTRマウス

DTは、副甲状腺機能低下症（低血イオン化カルシウム、血中のリン、および不適切低正常PTHレベル）を開発し、PTH-のCre-IDTRマウスを注入しました。我々は以前に測定可能な循環PTHおよびこれらのマウス¹⁷のため若干のより穏やかな表現型を説明する、いくつかのPTH陽性細胞がジフテリア毒素によるアブレーションを逃れることを報告しています。

GFP-PTXマウスおよびPTH-CRE-IDTRマウスにおける副甲状腺機能低下症

重要な血液のCa削減⁺⁺および血清PTHレベルは偽手術マウスで見られるレベル（のCa ⁺⁺ = 1.05±0.40 対に比べて、3日手術後のGFP-PTXマウスで観察されました 1.30±0.03ミリモル/ L、P <0.05; PTH = 32±22対580±137 pg / mlで、P <0.05）。副甲状腺機能低下症の表現型は、（（参照＃17）からの許可を得て転載図3A）3ヶ月の観察期間にわたって安定していました。 3日間隔、最大hypoparathyroid表現型を与えるためにDTの最小量を使用するように最適化された用量およびレジメンでは5μg/ kgのDTの2回注射した後、DTは、PTH-CRE-IDTRのマウスは、と比較して有意な低カルシウム血症と減少PTHを示した注入しました90日間の観察期間にわたって持続した車両制御マウス、（のCa ⁺⁺ = 1.10±0.07ミリモル/ L 対 1.26±0.05ミリモル/ L、P <0.05; = 218±156 pg / mlでの対 572±164 pgのPTH / mLで、P <0.05）（ 図3B、（参照番号17からの許可を得て転載））。

図1： 蛍光解剖顕微鏡下で54 PTHcre-mTmGマウスにおける上皮小体の様々な場所の代表的な画像。マウスは、2つ（A、C、E）又は三（B、D、F）緑色副甲状腺腺のいずれかでした。最も副甲状腺は、上縁の近くに位置した（A（1,2）、B（1,2）、C（2）、D（1,2）、E（2）、F（3）または近く下縁甲状腺（C（1）、D（3）、F（1））。まれに、いくつかは異所的に位置していた（B（3）、E（1）、F（2））。のにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。

図2：GFP-PTX マウスのTSHとT4レベル。 3ヶ月GFP-PTX後、血清TSHとT4のmeasuremのために得られましたエント。 GFP-PTXマウスTSH = 30±15 mUの/ L、P（TSH濃度（42±24 mUの/ L）（A）および対照マウスと異ならなかったT4濃度（3.0±0.6μgの/ dL）で（B）を示しました= 0.171、N = 11、T4 = 3.1±0.9、P = 0.707、N = 11）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：GFP-PTX マウスにおける血中のCa ⁺⁺およびPTHレベルとDTは、PTH-CRE-IDTRマウスを注入しました。両方のGFP-PTXマウス（A）とDTが安定した低カルシウム血症を示し、3ヶ月の観察期間にわたってPTHレベルを低下させたPTH-CRE-IDTRマウス（B）を注入された（N = 6から8、*** P <0.001）（再印刷リファレンス＃17）からの許可を得て。エス/ ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

私たちは、副甲状腺に選択的にGFP発現トランスジェニックマウスを用いて、GFP-導かれた副甲状腺摘出術の技術を実証します。 PTHcreでは、mTmGマウス、二重蛍光（Creを発現した細胞と非のCreの赤いトマトの緑色のGFPは、細胞を発現する）を明確に識別するために、そして正確に甲状腺を除去することなく、すべての副甲状腺を除去することができました。我々は、蛍光赤非副甲状腺組織を同定する能力のための二重蛍光mTmGマウスの使用を好むが、私たちの手順はまた、トマトの赤（B6.Cg-CT（ROSA）26Sortm14（のような単一の蛍光の動物を使用してうまく動作するはずですCAG-tdTomato）Hze / J）マウス。手順は、実行するのが比較的容易であり、マウス当たり約20分を必要とし、重篤かつ持続hypoparathyroid表現型をもたらします。

加えて、GFP陽性の副甲状腺の別の利点は、異常な副甲状腺の検出を容易にします。我々の研究は実証します容易に緑色蛍光によって私たちのマウスモデルで検出されたB6マウス（ 図1）の約四分の一で副甲状腺の誤局在。 THYRO-副甲状腺に反して、私たちの技術は、甲状腺ホルモン補充およびカルシトニン産甲状腺C細胞の除去の未知の効果のためのその後の必要性と甲状腺の除去を回避することができます。蛍光標識された副甲状腺はまた、副甲状腺の単離を必要とする他の調査のために使用することができます。このモデルの制限は、手術のための要件が​​含まれています。基本的なマイクロサージェリーのスキルや蛍光光源と解剖顕微鏡が必要です。

手術の必要性を排除hypoparathyroidマウスを生成するための第2の技術は、実証されています。ジフテリア毒素処理したPTHcre-IDTRマウスは、より穏やかな副甲状腺機能低下症の表現型を示すが、単にマウスの腹腔内にDTを注入する必要があります。 foの重要な部分Rこのモデルを生成する用量および投与レジメンの最適化でした。 DTの高用量は、毒性につながったが、低用量は、アプローチの有効性を減少させました。私たちは、3日おきに投与を5μg/ kgの2回の注射の用量レジメンは、なし/最小の死亡率と信頼性の高い、安定した低カルシウム血症をもたらしたことを決定しました。

最終的に、我々はこれら二つのアプローチは、後天性副甲状腺機能低下症のために有用なマウスモデルを提供することを願っています。小説長時間作用型PTHを使用して、我々は、副甲状腺機能低下症¹⁷のための新薬の有効性を決定する際に、これらのモデルの両方の最初の使用を報告しました。

The authors declare that they have no competing financial interests.

この作品は、口腔疾患オープン資金SKLOD2015OF01（RB）のNIHの助成金R01-DK100584と中国国家重点実験室によってサポートされていました。我々は助けをWenping趙、忠利佐藤、とケリーLauterに感謝します。