Флуоресцентные анализы для изучения взаимодействия микобактерий туберкулеза с иммунным рецептором SLAMF1

В этом исследовании представлен протокол оценки взаимодействия Mycobacterium tuberculosis с микробным сенсором SLAMF1. Анализы проводились на макрофагах, полученных из моноцитов человека, с использованием проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Описанные инструменты актуальны для изучения взаимодействий между патогенами и иммунорецепторами.

Оценка прямого взаимодействия между патогенами и иммунными рецепторами обычно включает в себя сложные методы или подразумевает использование трансгенных штаммов и генетически модифицированных клеток. В данной работе описан альтернативный метод выявления биохимического взаимодействия между макрофагальным микробным сенсором SLAMF1 и Mycobacterium tuberculosis . Были разработаны два технических подхода с использованием проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Генерировали экстракты общих клеточных белков из макрофагов человека, затем инкубировали с целыми клетками антигенов M. tuberculosis (WCMtb) или M. tuberculosis (Mtb Ags) в течение ночи при 4 °C и, наконец, сшивали с помощью обработки формальдегидом/глицином/этиленгликолем bis (сукцинимидилсукцинатом).Взаимодействие SLAMF1 с WCMtb с помощью проточной цитометрии было обнаружено с помощью PE-специфического антитела против SLAMF1. Существование взаимодействия с помощью флуоресцентной микроскопии осуществляли путем присоединения окрашенных Rhodamine-PE Mtb Ags к предметным стеклам, покрытым поли-D-лизином, которые инкубировали с экстрактом общего белка из макрофагов, полученных из моноцитов. После лечения кросслинкингом SLAMF1 визуализировали с использованием первичных (анти-SLAMF1) и вторичных (Alexa Fluor 488) антител. Эти анализы обеспечили мощный биохимический инструмент для измерения взаимодействий патогенов и иммунорецепторов, преодолев трудности, связанные с трансгенными клеточными линиями и экспериментами по модуляции экспрессии белковых генов.

Mycobacterium tuberculosis, возбудитель туберкулеза, выявленный 142 года назад, остается глобальной проблемой, в настоящее время инфицируя, по меньшей мере, четверть^{населения} мира1. Передаясь воздушно-капельным путем от инфицированных людей, M. tuberculosis достигает альвеолярных макрофагов в легких, где может выживать в течение длительных периодов времени в латентном состоянии ^2,3. Мало того, что активируется местный макрофагический ответ, но в последние годы было описано, что периферические моноциты могут рекрутироваться в дыхательные пути и дифференцироваться в альвеолярные макрофаги, вызывая еще более устойчивый ответ против M. tuberculosis, чем их аналог фетального^{происхождения.}

Макрофаги являются основными игроками врожденного иммунитета. При приеме внутрь M. tuberculosis макрофаги проявляют многочисленные микробицидные функции, такие как секреция провоспалительных цитокинов, слияние фаголизосомы и активация других иммунных клеток для уничтожения M. tuberculosis ^2,3. Тем не менее, сложная архитектурная структура этого патогена обеспечивает эффекторы (например, белки и липиды), способные регулировать метаболизм и функции макрофагов и, как следствие, воспалительный^{процесс.} Это манипулирование реакциями макрофагов посредством секреции факторов вирулентности или эксплуатации факторов хозяина приводит к различным стратегиям убегания, применяемым M. tuberculosis. Некоторые ключевые механизмы уклонения включают индукцию противовоспалительных цитокинов, ингибирование созревания и закисления фаголизосом, изменения окислительного стресса, нарушение аутофагии и дефицит во время процессинга и презентации антигена ^3,5.

Жестко регулируемое взаимодействие между макрофагами и M. tuberculosis имеет решающее значение для развития правильного иммунного ответа. Таким образом, изучение этих синапсов является ключом к выявлению иммунопротекторных или иммунопатогенных механизмов, индуцированных перекрестными помехами между хозяином и патогеном, а также к выявлению потенциальных терапевтических мишеней. Многие рецепторы опосредуют распознавание и/или интернализацию M. tuberculosis, в том числе TLR ^6,7,8, NLR ^7,8, рецепторы комплемента ^6,8, лектиновые рецепторы^{С-типа 6,8} и рецепторы мусорщика ^6,8. Накапливающиеся данные указывают на то, что как поверхностные, так и внутриклеточные PRR играют важную роль во время инфекции, распознавая опсонизированные и неопсонизированные M. tuberculosis.

Zihad and Sifat et al. недавно рассмотрели участие PRR в индуцированных M. tuberculosis ответах врожденных клеток⁹. В частности, большинство представителей семейства TLR были вовлечены во взаимодействие с лигандами M. tuberculosis ^6,7. Surface TLR2 распознает антигены микобактерий, такие как ацилированные липопротеины, липопротеин 19 кДа, липопротеин LprA, липопротеин LprG, антиген 30 кДа, антиген 38 кДа, MymA, пролин-пролин-глутаминовая кислота (PPE)-57, LAM, LM, PIM, белок теплового шока 60, сигнатурный белок Rv1509 и секретируемый белок ESAT-6⁷. Мембрана TLR4 взаимодействует с белками теплового шока, антигеном 38 кДа, RpfE, Rv0652, Rv0335c, Rv2659c, Rv1738, Rv2627c, Rv2628, GrpE и HBHA. С другой стороны, лиганды для эндосомальных TLR (TLR 3, 7, 8 и 9) включают дцРНК, тРНК, ссРНК, фагосомальную РНК и дцДНК M. tuberculosis. Кроме того, TLR2 играет активную роль в инициировании иммунных реакций при совместном действии с TLR1 и TLR6, TLR4 и TLR9 ^6,7. NOD2 и NLRP3 являются наиболее хорошо охарактеризованными цитоплазматическими NLR при туберкулезе. Хотя их специфические лиганды остаются изученными, эти рецепторы активируются мурамилдипептидом или ESAT-6, соответственно ^7,8. Лектиновые рецепторы С-типа классически участвуют в эндоцитозе M. tuberculosis. В то время как Dectin-2 действует как прямой PRR для ManLAM клеточной стенки M. tuberculosis, лиганд Dectin-1 еще не обнаружен⁸. Mincle и MCL распознают гликолипидный трегалоз-6,6'-димиколат (TDM), также называемый фактором кордового мозга⁷. DCAR взаимодействует с микобактериальными гликолипидами фосфатидил-мио-инозитолманнозидами (PIMs⁾⁷. CR3 распознает микобактериальные LAM и PIM, DC-SIGN лигирует ManLAM, MR распознает ряд компонентов M. tuberculosis, включая ManLAM, PIM, LM, гликопротеин 38 кДа, антиген 19 кДа и другие маннозилированные белки, в то время как лиганд DCIR до сих пор не идентифицирован.

Растворимые CLR включают SP-A, который распознает ManLam, LM, гликопротеин 60 кДа и гликопротеин Apa; SP-D, взаимодействующий с LAM, LM и PILAM; и MBL, которая специализируется на распознавании ManLAM ^6,7. SR-A и MARCO имеют TDM в качестве лиганда, SR-B1 распознает ESAT-6, а CD36 связывается с ManLAM и LM ^7,8. Кроме того, Dectin-1, Mincle и MARCO также могут сочетаться с TLR2 или TLR4 для запуска сигналов после обнаружения M. tuberculosis PAMPs ^6,7. CD14 является поверхностным рецептором, который обладает способностью интернализировать неопсонизированные бактерии, а также распознает белок теплового шока Шаперонин 60.1. В частности, CD14 функционирует как корецептор наряду с MARCO и TLR2⁶. AIM2 является цитозольным рецептором, который может воспринимать одноцепочечную ДНК при выходе M. tuberculosis из фагосомы⁸. Наконец, AhR является лиганд-активируемым транскрипционным фактором, который связывается с пигментированным фактором вирулентности нафтохинон-фтиоколом M. tuberculosis⁶.

Многие из описанных выше взаимодействий были постулированы, а не строго продемонстрированы. Даже лиганды для некоторых рецепторов остаются неизвестными, что усиливает необходимость лучшего понимания области иммунораспознавания M. tuberculosis. В этом контексте костимулирующая молекула SLAMF1 (Signaling Lymphocytic Activation Molecule) была недавно описана как рецептор M. tuberculosis в Barbero et ^al.10. Действуя не только как сигнальная молекула, но и как сенсор M. tuberculosis, SLAMF1 играет особенно интригующую роль при туберкулезе. SLAMF1 может индуцировать активацию иммунных клеток путем модуляции защитных функций, таких как производство ИФН-γ Т-клетками посредством фосфорилирования Erk/CREB 11,12,13, аутофагия в нейтрофилах ¹⁴ и бактериальный клиренс в макрофагах¹⁵.

Взаимодействие рецепторов и лигандов изучалось на протяжении многих лет с использованием таких методов, как ИФА, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), изотермическая титрованная калориметрия (ITC), флуоресцентная поляризация (FP), рентгеновская кристаллография, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), микромасштабный термофорез (MST), резонансный перенос энергии (например, BRET или FRET), конфокальная микроскопия, электронная микроскопия, криоэлектронная микроскопия (крио-EM) и атомно-силовая микроскопия (AFM)^16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Некоторые из этих подходов подразумевают использование репортерных генов, меченых рекомбинантных белков или химерных молекул, моделей нокаута, нокдауна или сверхэкспрессии. В качестве альтернативы, вычислительные инструменты могут предсказывать рецептор-лигандные взаимодействия и сайты связывания и часто используются в сочетании с биологическими подходами для получения всестороннего понимания взаимодействий 29,30,31. В этой статье описываются две альтернативы для обнаружения биохимического взаимодействия, а также раздел о том, как флуоресцентно мечить бактерии. Представлен протокол, который позволяет изучать рецептор-патогенные взаимодействия in vitro, в частности, оценивать взаимодействие SLAMF1-M. tuberculosis с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии, двух обычно доступных и регулярно используемых методов.

Все процедуры с участием макрофагов, полученных из моноцитов человека, были выполнены в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013) и по согласованию с Комитетом по этике UNNOBA (COENOBA). Письменное информированное согласие было получено до сбора пробы. Распределение мужчин и женщин в группах было 13/6, а средний возраст составил 32 года, с межквартильным диапазоном (МКР) 18-75 лет. Наличие предшествующих патологий, сопутствующих заболеваний или положительный диагноз на туберкулез были определены как критерии исключения. Подробная информация о реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Культивирование и стимуляция макрофагов, полученных из моноцитов

1. Забор крови
   1. Получить 60 мл крови от здоровых доноров методом венепункции в гепаринизированном шприце.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Забор крови должен быть выполнен биохимиком или техником по флеботомии.
   2. Выбросьте иглу в контейнер для утилизации острых предметов и любой материал, который контактировал с кровью донора, в контейнер для патологических отходов.
2. Выделение моноцитов и генерация макрофагов
   1. Осторожно перелейте кровь в пробирки объемом 50 мл и разбавьте ее наполовину физиологическим раствором.
   2. Выполнение центрифугирования на среде с градиентом плотности для получения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ).
   3. Соберите PBMC с белесого ореола.
   4. Выполните два промывки солевым раствором при 400 х г в течение 10 минут и последнее промывание при 200 х г в течение 15 минут при 20 °C для устранения тромбоцитов.
   5. Определите количество PBMC в камере для подсчета клеток и выполните положительный магнитный отбор CD14 с помощью гранул CD14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе магнитного поля внимательно следуйте инструкциям производителя. Кроме того, проверить чистоту выделенных моноцитов можно с помощью проточной цитометрии.
   6. Ресуспендировать выделенные клетки в RPMI 1640 и определить количество моноцитов в камере для подсчета клеток.
   7. Затравка 500 мкл 1 × 10⁶/мл CD14 положительных отобранных моноцитов на лунку в 24-луночном планшете для культивирования клеток в отсутствие сыворотки для повышения адгезивности.
   8. Через 2 ч удалите неадгезивные клетки, промыв их предварительно подогретым РПМИ 1640.
   9. Для дифференцировки макрофагов культивируют адгезивные моноциты в течение дополнительных 16-18 ч (в течение ночи) в 1 мл полной среды (среда RPMI 1640 с добавлением L-глутамина, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина).
   10. На следующий день смените питательную среду. Удалите среду, промойте 1 мл 1x PBS и добавьте 1 мл готового носителя.
   11. Стимулируйте макрофаги ультразвуком M. tuberculosis (M. tuberculosis antigens (Ags)) в течение 24 ч. Используйте 10 мкл M. tuberculosis Ags (10 мкл = 1 ×^{10 6} бактерий) на 1 ×^{10 6} моноцитарных макрофагов.
       ПРИМЕЧАНИЕ: 10 μL M. tuberculosis Ags (Mtb Ags) = 1 × 10⁶ бактерий, количественно определяемых по O.D. 600_нм в спектрофотометре с учетом O.D. 1 как 1 x 10⁸ бактерий/мл. Используйте шкафы биобезопасности BSL2 и инкубатор при температуре 37 °C в атмосфере с 5%_CO2 для всех этапов культивирования.
3. Подтверждение экспрессии SLAMF1
   1. Соберите макрофаги из одной лунки. Поставьте тарелку с культурой на холодную поверхность. Отделите ячейки движениями вверх и вниз, добавив 1 мл холодного FACS (1x PBS + 2% FBS) два раза подряд. Для сбора используйте цитометрическую трубку с круглым дном.
   2. Центрифугируйте клетки при давлении 500 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, сбросив ее.
   3. Окрашивать клетки флуорофорным антителом SLAMF1 к человеку в течение 30 минут при 4 °C в темноте. Вихрь после добавления 1,25 мкл антитела.
   4. Промойте клетки для устранения избытка антител с помощью FACS, повторно суспендируйте гранулу в FACS и получите образец с помощью проточного цитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1,25 мкл антитела против SLAMF1 соответствует 0,0625 мкг, которое используется для мечения 0,5 x 10⁶ макрофагов. Тем не менее, настоятельно рекомендуется титрование антитела, а также выполнение соответствующего изотипа или контроля флуоресценции минус один (FMO).

2. Приготовление экстракта общего клеточного белка

1. Подготовка буфера для лизиса
   1. Приготовьте буфер для радиоиммуноципитации (RIPA) с NaCl 150 мМ, Трис 10 мМ, ЭДТА 5 мМ, SDS 1%, Тритон X-100 1% и дезоксихолат натрия 1%.
   2. Дополните буфер RIPA 1 мМ фенилметилсульфонилфторидом (PMSF) и ингибиторами протеазы, такими как пепстатин А и лейпептин.
2. Сбор клеток и выделение белков
   1. Отбросьте полный RPMI из лунок планшета с помощью пипетки P1000 и соберите макрофаги путем пипетирования вверх и вниз холодным 1x PBS.
   2. Переложите ячейки в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Соберите по одной лунке на микротрубку.
   3. Центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
   4. Добавьте 1 мл холодного PBS и повторите шаги 2.2.2 и 2.2.3, собирая клетки в ту же микроцентрифужную пробирку.
   5. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 100 мкл 1x PBS и объедините четыре пробирки. Повторите шаг 2.2.3. Каждая пробирка будет содержать 2 x 10⁶ макрофагов.
   6. Добавьте 100 мкл дополненного буфера RIPA и инкубируйте суспензию на льду в течение 1 ч, вортексируя каждые 10 мин.
   7. Центрифугируйте при давлении 14 000 x g в течение 15 мин. Соберите надосадочную жидкость и сохраните до использования при температуре -20 °C.

3. Взаимодействие M. tuberculosis -SLAMF1 методом проточной цитометрии

1. Белково-бактериальная сшивка
   1. Инкубировать 1 × 10⁶ целых инактивированных клеток M. tuberculosis (WCMtb, M. tuberculosis , инактивированных гамма-облучением) с экстрактом белка из 1 x 10⁶ макрофагов (50 мкл) в течение ночи при 4 °C во вращающемся держателе микротрубок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мкл WCMtb = 1 × 10⁶ бактерий, количественно определяемых по O.D. 600_нм на спектрофотометре с учетом O.D. 1 как 1 x 10⁸ бактерий/мл.
   2. На следующий день добавьте 500 мкл 1% формальдегида, разведенного в 1x PBS. Инкубировать в течение 15 минут при перемешивании (шейкере) при комнатной температуре (RT).
   3. Добавьте 25 мкл 0,125 М глицина, разведенного в воде. Инкубировать в течение 5 минут при перемешивании (шейкере) при RT.
   4. Дважды вымойте 1 мл 1x PBS при 14 000 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость между этапами стирки.
   5. Повторно суспендируйте гранулу и инкубируйте суспензию в 500 мкл 2 мМ сшивающего агента этиленгликоля биса (сукцинимидилсукцината) (EGS), разведенного в смеси ледяной уксусной кислоты:вода в соотношении 1:1 в течение 1 ч при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется готовить реагенты во время использования. Для приготовления EGS необходимо смешать ледяную уксусную кислоту и воду в равных пропорциях и нагреть до 70 °C. Если раствор не горячий, EGS не полностью ресуспендируется.
2. Окрашивание SLAMF1
   1. Повторите шаг 3.1.4, используя 500 мкл 1x PBS в первой стирке и 1 мл во второй.
   2. Окрашивайте белково-бактериальный комплекс в течение 30 мин при 4 °C в темноте антителом против человека SLAMF1 (как на шаге 1.3.3) путем добавления антитела в микротрубку и вортексинга. Используйте количество антитела, подходящее для 1 x 10⁶ клеток (2,5 мкл или 0,125 мкг).
   3. Промойте клетки для устранения избытка антител с помощью FACS, повторно суспендируйте гранулу в FACS и получите образец в проточном цитометре (как в шаге 1.3.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните управление соответствующим изотипом или FMO.

4. Мечение антигенов M. tuberculosis

1. Ресуспендируйте родамин В в этаноле в исходной концентрации 5 мг/мл (1000x). Хранить при температуре -20 °C до использования.
2. Добавьте 1 мкл родамина B на 100 мкл M. tuberculosis Ags в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
3. Инкубировать в течение 45 мин при РТ при непрерывном перемешивании (вихре).
4. Простирайте не менее 3 раз при 14 000 x g в течение 5 минут при 24 °C с использованием 1 мл 1x PBS до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Пеллета (Mtb-R Ags) будет выглядеть светло-розовой.
5. Суспендируйте Mtb-R Ags в 100 мкл 1x PBS для восстановления исходного объема.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать в стерильных условиях. Убедитесь, что окрашивание выполняется непосредственно перед проведением экспериментов.

5. Взаимодействие M. tuberculosis и SLAMF1 методом флуоресцентной микроскопии

1. Сшивание бактерий и белков
   1. Введите круглые покровные стекла диаметром 12 мм в 24-луночные культуральные планшеты (1 покровное стекло на лунку) с помощью хирургического пинцета с круглым носиком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно очистите покровные стекла 70% этанолом. При желании они могут быть автоклавированы или стерилизованы под ультрафиолетовым излучением в течение 30 минут.
   2. Инкубируйте покровное стекло с 400 мкл 10 мкг/мл поли-D-лизина в течение ночи при 4 °C. Накройте тарелку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света.
   3. На следующий день достаньте тарелку из холодильника и дважды промойте покровную крышку 1 мл воды.
   4. Дайте покровному листу высохнуть.
   5. Разведите 20 мкл (2 x 10⁶) Mtb-R Ags в 180 мкл 1x PBS. Последних 200 мкл достаточно, чтобы полностью покрыть покровное стекло.
   6. Инкубируйте покровное стекло с Mtb-R Ags в течение 1 ч при 37 °C в клеточном инкубаторе.
   7. Слейте остатки жидкости и дважды промойте 1 мл 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе правильная адгезия Mtb-R к покровному стеклу может быть проверена с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием фильтров, соответствующих красному каналу.
   8. Добавьте 400 мкл блокирующего буфера (10% FBS в 1x PBS) в течение 30 минут при RT в перемешивании (шейкере).
   9. Дважды промойте с 400 μл блокирующего буфера.
   10. Инкубировать со 100 мкл белкового экстракта, разведенного в 300 мкл 1x PBS, в течение 2 ч при RT в перемешивании (шейкере).
   11. Добавьте 400 мкл 1% формальдегида, разведенного в 1x PBS. Инкубировать в течение 15 минут при перемешивании (шейкере) при RT.
   12. Добавьте 500 мкл глицина 0,125 М, разведенного в воде. Инкубировать в течение 5 минут при перемешивании (шейкере) при RT.
   13. Умойтесь дважды 1 мл 1x PBS.
   14. Добавьте 400 мкл 2 мМ EGS в течение 1 ч при RT при перемешивании (шейкере).
   15. Повторите шаг 5.1.13
       ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется готовить реагенты во время использования.
2. Окрашивание SLAMF1
   1. Заверните крышку тарелки для культуры в парафиновую пленку.
   2. Добавьте каплю 60 мкл предварительно титруемого первичного антитела против SLAMF1 (разведение 1:75) на крышку, покрытую парафиновой пленкой.
   3. Осторожно снимите покровное стекло с пластины с помощью изогнутого хирургического пинцета с тонким концом и игл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить снятие покровных стекол, иглу можно согнуть примерно под углом 45°.
   4. Переверните покровную крышку над каплей, содержащей антитело. Инкубировать в течение 30 минут при RT в темноте.
   5. Поднимите покровное стекло и дважды промойте с помощью блокирующего буфера.
   6. Переверните покровное стекло над новой каплей, содержащей вторичное антитело (разведение 1:200). Инкубировать в течение 30 минут при RT в темноте.
   7. Повторите шаг 5.2.5.
   8. Удалите лишнюю жидкость и закрепите покровное стекло на каплю монтажной жидкости, помещенную на предметное стекло.
   9. Наблюдайте под флуоресцентным микроскопом с использованием соответствующих фильтров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать в стерильных условиях. Разведите антитела в блокирующем буфере. Обращайтесь с покровным стеклом осторожно, чтобы не поцарапать его, которые могут затруднить наблюдение под микроскопом. Настоятельно рекомендуется использовать монтажную жидкость, подходящую для флуоресценции.

В данной работе представлен протокол, позволяющий оценить взаимодействие M. tuberculosis с иммунным рецептором SLAMF1 в макрофагах человека (рис. 1). С этой целью была получена периферическая кровь от здоровых доноров. Затем PBMC разделяли центрифугированием на среде с градиентом плотности, а моноциты выделяли методом магнитного положительного отбора (чистота ≥95%, рис. 2A, B). Выделенные моноциты приклеивали к пластиковым культуральным планшетам в течение 2 ч для получения макрофагов, полученных из моноцитов, а затем культивировали ON. После этого макрофаги стимулировали ультразвуковой M . tuberculosis (Mtb Ags) для индуцирования поверхностной экспрессии SLAMF1, как сообщалось ранее¹⁰, а поверхностные уровни SLAMF1 подтверждали с помощью проточной цитометрии (рис. 2C)). Макрофаги были окончательно лизированы с использованием буфера для лизиса RIPA в сочетании с вортексингом и инкубацией на льду для облегчения лизиса клеток. Полученный экстракт общего белка был использован в анализах взаимодействия.

В первом наборе экспериментальных процедур для изучения взаимодействия SLAMF1 с целыми клетками M. tuberculosis (WCMtb) использовалась проточная цитометрия (рис. 3). Во-первых, физическое взаимодействие между SLAMF1 (содержащимся в белковом экстракте) и WCMtb стимулировалось путем их совместной инкубации ON в непрерывном вращении при 4 °C. Затем проводили лечение перекрестным сшиванием, и с помощью специфического антитела против SLAMF1 обнаруживали рецептор SLAMF1, который был связан с WCMtb. В этом анализе только WCMtb был использован для установки напряжений, соответствующих размеру и зернистости M. tuberculosis в проточном цитометре, который представлял интерес для обнаружения связывания SLAMF1.

Во втором экспериментальном подходе флуоресцентная микроскопия использовалась для обнаружения взаимодействия SLAMF1-M. tuberculosis (рис. 4). Этот анализ, в котором использовался ультразвуковой анализ M. tuberculosis (Mtb Ags), дополняет предыдущий. Для облегчения детектирования флуоресценции в канале/фильтре, соответствующем флуорохрому ПЭ, использовали окрашенные Mtb Ags с родамином B (Mtb-R Ags). Mtb-R Ag прикрепляли к покровным стеклам, покрытым поли-D-лизином, и успешное окрашивание проверяли с помощью микроскопа (рис. 4A). После этого предметные стекла, покрытые Mtb-R Ags, инкубировали с белковыми экстрактами, содержащими SLAMF1. После сшивки SLAMF1 был обнаружен с помощью первичного специфического антитела против SLAMF1, за которым следовало вторичное антитело, связанное с совместимым флуорохромом, для совместного наблюдения с ТЭЛА. После получения отдельных изображений флуоресцентной микроскопии в двух каналах для Mtb-R Ags и SLAMF1 взаимодействие было подтверждено слиянием изображений (рис. 4B).

Выполнение этих подходов продемонстрировало существование взаимодействия между SLAMF1 и M. tuberculosis. Было обнаружено перекрестное взаимодействие SLAMF1 как с цельными, так и с облученными бактериями, что подкрепило гипотезу, указывающую на SLAMF1 как на новый врожденный рецептор макрофагов человека для M. tuberculosis¹⁰.

Рисунок 1: Рабочий процесс по выявлению взаимодействия SLAMF1-M. tuberculosis . Периферическую кровь получали от здоровых доноров методом венепункции и центрифугировали в среде с градиентом плотности для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ). После определения количества клеток PBMC подвергали положительному магнитному отбору для очистки моноцитов CD14^pos . Затем моноциты приклеивали к культуральным планшетам в течение 2 ч в отсутствие фетальной бычьей сыворотки, а затем культивировали в течение ночи в дополненном RPMI (стадия покоя) для получения макрофагов, полученных из моноцитов. После этого макрофаги стимулировали ультразвуковым M . tuberculosis (Mtb Ags) в течение 24 ч для индуцирования поверхностной экспрессии SLAMF1. Уровни SLAMF1 были проверены с помощью проточной цитометрии с использованием специфического антитела человека против SLAMF1 в части популяции макрофагов. Остальные макрофаги были использованы для получения экстрактов общего белка. Лизис клеток проводили путем совмещения вортексинга и инкубации на льду в буфере для лизиса. Наконец, взаимодействие между SLAMF1 и M. tuberculosis оценивали с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии после сшивания белков макрофагов с Mtb Ags или целыми клетками M. tuberculosis (WCMtb). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Экспериментальный и технический контроль. (A) Моноциты CD14^pos были выделены из PBMC методом положительного магнитного отбора. Полученные положительные (моноциты, синие) и отрицательные (красные) клеточные фракции оценивали методом проточной цитометрии (SSC-A в сравнении с SSC-A. FSC-A) для подтверждения успешного выбора. (B) Чистота положительной фракции была подтверждена проточной цитометрией, анализирующей зернистость и размер клеток (SSC-A в сравнении с SSC-A в сравнении с SSC-A FSC-A). (C) Макрофаги, полученные из моноцитов, были отобраны с помощью SSC-A в сопоставлении. FSC-A, а затем стробируется для исключения дублетов с помощью стратегии двойного синглета (FSC-A против FSC-H, за которым следует SSC-A vs. SSC-H). Поверхностную экспрессию SLAMF1 оценивали в одиночных клетках. Во всех случаях (A-C) отображаются репрезентативные графики или гистограммы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Взаимодействие SLAMF1-M. tuberculosis с помощью проточной цитометрии. Кросслинкинг между белками макрофагов и целыми клетками M. tuberculosis (WCMtb) осуществляли путем обработки формальдегидом/глицином/этиленгликолем бисом, как описано в разделе протокола. Затем взаимодействие оценивали с помощью проточной цитометрии путем обнаружения положительного сигнала SLAMF1 (PE) после выбора интересующей популяции (SSC-A vs. FSC-A). На верхней панели отображается положительный сигнал для SLAMF1, сравнивая контроль флуоресценции минус один (FMO) (слева) с положительным окрашиванием (справа). На нижней панели показано наложение (слева, точечный график и справа, гистограмма) между сигналом SLAMF1 и FMO управлением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Взаимодействие SLAMF1-M. tuberculosis с помощью флуоресцентной микроскопии. (A) Mtb Ags окрашивали родамином B (Mtb-R Ags) и прикрепляли к круглому покровному стеклу. Правильная адгезия и флуоресценция Mtb-R Ags были подтверждены флуоресцентной микроскопией с использованием фильтров, соответствующих красному каналу. (B) Перекрестное сшивание между белками макрофагов и Mtb-R Ags осуществляли путем обработки формальдегидом/глицином/этиленгликолем bis, как описано в разделе протокола, путем добавления белкового экстракта поверх прикрепленного Mtb-R Ags. Взаимодействие оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием человеческого антитела против SLAMF1 с последующим добавлением вторичного антитела, меченного Alexa Fluor 488. На верхних микрофотографиях видны положительные сигналы SLAMF1 (слева, зеленый) и Mtb-R Ags (справа, красный). Низкий микроснимок свидетельствует о взаимодействии желтым цветом (слияние обоих каналов). Масштабные линейки соответствуют 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Это исследование является полезным руководством для изучения биохимического взаимодействия между M. tuberculosis и микробными сенсорами, экспрессируемыми в макрофагах человека, ключевом типе клеток, участвующем в реакции хозяина во время туберкулеза. Предоставленные протоколы будут актуальны для расшифровки молекул, которые играют роль в проникновении M. tuberculosis в фагоциты.

Характеристика биомолекулярных взаимодействий, таких как взаимодействие между патогенами и иммунорецепторами, имеет решающее значение для понимания как иммунозащитных механизмов, так и стратегий уклонения, вызванных M. tuberculosis. Во многих случаях демонстрация прямого взаимодействия рецептора с его бактериальным лигандом может быть сложной задачей и может потребовать сложных методов или систем, лишенных универсальности. Driessen et al. изучали роль фосфатидилинозитол маннозидов во взаимодействии между микобактериями и DC-SIGN с использованием мутантных дефицитных штаммов M. bovis BCG³². Несмотря на то, что им удалось изучить эти взаимодействия, авторы не обнаружили различий для мутантных штаммов и отметили, что создание мутантных бактерий, демонстрирующих сниженное связывание, будет^{огромной задачей.} Другие авторы провели отличную и кропотливую работу, чтобы продемонстрировать взаимодействие между TLR2 и некоторыми белками PE/PPE M. tuberculosis^33,34. Эти исследования требовали использования мышей с нокаутом для получения рецептора, трансфекции клеток и очистки вышеупомянутых белков или определенных белковых доменов^33,34. Кроме того, часто делается вывод о функции рецепторов, но взаимодействие достоверно не демонстрируется. В качестве примера можно привести растворимый рецептор PTX3, для которого были обнаружены гаплотипы, связанные с исходом заболевания, но специфическое взаимодействие которого с M. tuberculosis ^{строго не} изучено. В связи с этими недостатками наш метод позволяет оценить взаимодействие исследуемого рецептора-мишени с M. tuberculosis простым способом и с помощью доступных методик легкой интерпретации.

Что касается предыдущих пунктов, в частности для SLAMF1, то ранее было оценено взаимодействие с OmpC и OmpF из E. coli³⁶ и Omp25 из B. abortus³⁷. Degos et ^al.37 использовали клетки COS-7, трансфицированные плазмидой, кодирующей только внеклеточный домен SLAMF1, чтобы затем очистить SLAMF1 и проанализировать взаимодействие с Omp25 с помощью вестерн-блоттинга. Они также проводили эксперименты с использованием мышей SLAMF1^-/- и B. abortus дикого типа или Omp25-дефектного мутанта. Berger et al. ^{В 36} работах также были представлены убедительные доказательства прямого взаимодействия между SLAMF1 и E. coli Omp и S. typhimurium ^SseB-. Они использовали различные подходы, в том числе мышей SLAMF1^-/-, макрофаги RAW264.7, кодирующие конструкцию SLAMF1mCherry, а также анализ амплификации с использованием SLAMF1-трансфицированных Т-клеток Jurkat. Они разработали анализ чувствительного усиления сигнала с помощью люциферазного репортера с использованием 1 x 10⁸E. coli. В связи с этим, одним из преимуществ анализов биохимического взаимодействия, представленных в этом отчете, является то, что взаимодействие было фактически обнаружено с использованием клеток дикого типа и того же соотношения клеток:бактерий, которое использовалось для функциональной оценки в предыдущей работе¹⁰, без необходимости сверхэкспрессии или отмены экспрессии SLAMF1. 

Предоставленный протокол включает в себя некоторые важные шаги. Одним из них является подтверждение экспрессии SLAMF1 в макрофагах человека перед проведением анализов взаимодействия. Это имеет решающее значение для того, чтобы избежать получения ложноотрицательного результата, который на самом деле был бы связан с отсутствием экспрессии рецепторов. Здесь уровни SLAMF1 были проверены с помощью проточной цитометрии, поскольку это быстрый метод, позволяющий получить эти данные менее чем за 2 часа. Тем не менее, можно использовать и другие методы, такие как микроскопия или вестерн-блоттинг. Мы не рекомендуем такие методологии, как ПЦР в реальном времени, которые определяют уровни мРНК, когда конечной целью является изучение рецептора на уровне белка. Еще одним фундаментальным этапом является этап сшивки. Использование сшивающих агентов направлено на стабилизацию белок-белковых взаимодействий. Во время анализа на основе проточной цитометрии нам не удалось обнаружить сигнал на SLAMF1 без применения этапа сшивки. В случае микроскопического подхода мы наблюдали взаимодействие без использования лечения кросслинкингом, но с очень низкой чувствительностью. Поэтому этап сшивания настоятельно рекомендуется во всех случаях.

Описанный протокол предоставляет доказательства взаимодействия между SLAMF1 и антигенами M. tuberculosis , доступными на поверхности патогена, помогая продемонстрировать, что SLAMF1 распознает молекулярную сигнатуру, присутствующую у M. tuberculosis. Однако эта модель имеет некоторые ограничения. Слабым местом является то, что этот протокол не позволяет определить, какой именно антиген M. tuberculosis взаимодействует с SLAMF1. Несмотря на это, протокол может быть изменен для достижения этой цели, например, с использованием очищенных антигенов бактерий. Еще одним ограничением является необходимость знать, какой стимул индуцирует экспрессию SLAMF1 в макрофагах. Это может означать осложнение, если выбранный рецептор не экспрессируется в базальных условиях или для которых характер экспрессии неизвестен. Наконец, эти подходы не различают, требуются ли SLAMF1 другие молекулы для взаимодействия с M. tuberculosis. В этом случае можно было бы провести иммунопреципитацию или использовать в методической схеме большее количество антител.

Предложенная в данном отчете методология может быть легко адаптирована для изучения других иммунных рецепторов, того же рецептора в других типах клеток, в которых он экспрессируется, или для оценки взаимодействия с другими бактериями или штаммами различных микобактерий. Более того, в данном случае предоставляется краткий и простой протокол для флуоресцентного окрашивания M. tuberculosis ультразвуком, маркировка, которая может быть применена к другим бактериям и даже живым штаммам. Тем не менее, эта процедура фокусируется на перекрестных помехах SLAMF1-M. tuberculosis , другие потенциальные применения включают понимание результата заблокированного, отсроченного или неадекватного взаимодействия, изучение механизмов уклонения или выявление потенциальных молекулярных мишеней, участвующих в распознавании патогенов. Аналогичным образом, этот протокол может быть применен для изучения новых терапевтических стратегий и иммунотерапии для понимания коэволюции M. tuberculosis и макрофагов или других клеток-хозяев, а также может быть использован в различных областях, которые стремятся понять динамику лиганд-рецепторов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Эта работа была поддержана Национальным университетом Норвегии провинции Буэнос-Айрес (номера грантов SIB 0618/2019, SIB 2582/2012 для V.P.), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, номера грантов PICT-2012-2459 и PICT A 2017-1896 для V.P. и PICT-2021-I-INVI-00584 для A.B.); Фонд Флоренсио Фиорини; и Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, grant no PIO 157201501000CO to V.P.). Благодарим Наталью Мените и Гастона Вильяфанье за техническую поддержку. Мы выражаем признательность д-ру Пауле Баррионуэво и д-ру Лусиане Бальбоа за научную дискуссию во время публикации, которая привела к разработке анализов, представленных в этой работе. Наконец, мы благодарим доктора Эстермана за его советы по протоколам кросслинкинга, Lic. Морони за советы по работе с полилизином и ликом. Морикони за помощь в составлении схематических рисунков.