Method Article
Можно оценить функцию тромбоцитов под действием потока и смоделировать гемостатическую реанимацию с помощью микрофлюидного устройства, которое применяется в травматологии и трансфузионной медицине.
Микрофлюидика включает в себя физиологически значимые субстраты и потоки, которые имитируют сосудистую сеть и, следовательно, являются ценным инструментом для изучения аспектов тромбоза и гемостаза. В средах с большим сдвигом, имитирующих артериальный поток, микрофлюидный анализ облегчает изучение функции тромбоцитов, поскольку богатые тромбоцитами тромбы образуются в локализованной стенотической области проточного канала. Использование устройств, которые позволяют использовать небольшой объем образца, может дополнительно помочь в оценке функции тромбоцитов в потоке из образцов пациентов с ограниченным объемом или животных моделей. Изучение образцов пациентов с травмами или образцов после переливания тромбоцитарных продуктов может помочь в определении терапевтических стратегий для групп пациентов, у которых функция тромбоцитов имеет решающее значение. В этой модели также могут быть изучены эффекты ингибирования тромбоцитов с помощью фармакологических агентов. Целью данного протокола является создание микрофлюидной платформы, которая включает в себя физиологический поток, биологические поверхности и соответствующие гемостатические механизмы для оценки функции тромбоцитов с последствиями для изучения травматической коагулопатии и трансфузионной медицины.
Травма является одной из основных причин смерти и инвалидности во всем мире. Тяжелая травма часто осложняется уникальным эндогенным нарушением гемостаза и тромбоза, называемым травматической коагулопатией (ТИК)1. Тромбоциты играют решающую роль при ТИК, и они были описаны как обладающие как адаптивными, так и дезадаптивными функциями2. Механизмы дисфункции тромбоцитов после травмы остаются неясными, и существует острая необходимость в лучшем понимании клеточного ответа для разработки улучшенной реанимации и терапии. Еще одной неприятной проблемой, связанной с функцией тромбоцитов после травмы, является неопределенность надежности имеющихся показаний функции тромбоцитов у пациента с травмой.
Многочисленные исследования показали, что даже пациенты с легкими травмами, без известного фенотипа клинического кровотечения, имеют аномальную функцию тромбоцитов при использовании обычного тестирования функции тромбоцитов, такого как агрегометрия 3,4. Тем не менее, ограничения в агрегометрии для оценки функции тромбоцитов в условиях травмы включают отсутствие физиологически значимой поверхности повреждения, редукционистский подход к стимуляции агонистов, разведение образцов с помощью импедансной агрегометрии цельной крови, разделение плазмы с помощью агрегометрии оптического пропускания света и оценку застойных образцов. Кроме того, остается неясным, представляет ли эта чувствительность функции тромбоцитов истинную клеточную дисфункцию или артефакт измерения, такой как повышенный исходный электрический импеданс, в условиях травмы2. Таким образом, изучение соответствующих функций тромбоцитов в контексте травмы имеет решающее значение для понимания TIC, и в этой области есть значительные возможности для инноваций и улучшений.
Платформы, традиционно используемые для изучения функции тромбоцитов, не включают динамику и поток жидкости, что может иметь решающее значение для понимания дисфункции тромбоцитов, связанной с травмой и коагулопатией, вызванной травмой5. Механизмы гемостаза, которые зависят от потока, включают удлинение фактора Виллебранда (VWF) при высоком сдвиге, выше критической скорости сдвига, и захват тромбоцитов с помощью гликопротеина 1b 6,7,8, который не захватывается с помощью анализа застойной функции тромбоцитов. Кроме того, тромбоциты преимущественно связываются с VWF или фибриногеном в зависимости от режима кровотока и играют дифференцированную роль в артериальном и венозном тромбозе 9,10. Артериальные тромбы в основном состоят из тромбоцитов, в то время как венозные тромбы в основном состоят из эритроцитов, основанных, в частности, на режимах потока11. Анализы, включающие режимы потока, могут помочь в выяснении дисфункций, относящихся к спектру фенотипов TIC, от гипокоагуляции и фенотипов кровотечения до гиперкоагуляции и тромботических фенотипов. Наконец, ограничения по объему забора крови в популяциях пациентов с травмами могут затруднить традиционное функциональное тестирование тромбоцитов. В то время как такие анализы, как проточная цитометрия, могут и должны использоваться в этих обстоятельствах, результаты часто отражают физическую характеристику образца, а не функциональную оценку гемостаза.
В то время как механизмы дисфункции тромбоцитов могут быть не до конца поняты при травме, моделирование дисфункции тромбоцитов in vitro, например, с антагонистами P2Y12, также может помочь в изучении терапевтических вмешательств. Гемостатическая реанимация критически важна для пациентов с травмами, когда продукты крови переливаются сбалансированным подходом для лечения шока, коагулопатии и эндотелиального повреждения либо цельной кровью, либо компонентами крови (эритроцитами, плазмой и концентратами тромбоцитов) в соотношении единиц 1:1:1 12,13,14. У пациентов с травмами раннее использование препаратов крови связано с улучшением выживаемости15,16. Для продления срока годности все чаще изучаются тромбоцитарные продукты, хранящиеся в холоде. Исследование тромбоцитов, хранящихся в холоде, показывает повышенную гемостатическую активность, а также безопасность при переливании крови после травмы17,18.
Эволюция реанимации тромбоцитов, хранящихся в холоде, подчеркивает необходимость проведения дополнительных тестов, чтобы понять, какой тромбоцитарный продукт наиболее эффективен при травме. Тем не менее, традиционные анализы функции тромбоцитов часто подвергаются чрезмерной или недостаточной потенциации для выявления дисфункции, возникающей как у пациента с травмой, получающего терапевтическое переливание тромбоцитов, так и у самого переливаемого продукта, наблюдаемой при повреждениях при накоплении тромбоцитов. Определение происхождения дисфункции может быть сложной задачей, учитывая ограничения в современных анализах функции тромбоцитов, в том числе статический характер большинства этих тестов. Таким образом, при изучении гемостатической реанимации in vitro платформа и методы обнаружения как реципиентных, так и продуктовых тромбоцитов имеют решающее значение для определения оптимальных терапевтических вмешательств.
Микрофлюидное тестирование предлагает профили потока и биофиделические поверхности для создания физиологически релевантного анализа для изучения тромбоцитов. Микрофлюидные устройства могут быть настроены для изучения определенной патофизиологии или типов травм, таких как пункция сосудов19 или повреждение эндотелия20. Эти устройства обычно состоят из полидиметилсилоксана (PDMS), прикрепленного к предметному стеклу стеклянного микроскопа с модификациями поверхности, такими как коллаген, для имитации субэндотелия и повреждения тканей. Использование этих типов устройств на основе потока может помочь в проведении исследований дисфункции тромбоцитов, связанных с травмой, и помочь в изучении оптимальных подходов трансфузионной медицины для улучшения дисфункции тромбоцитов. Эти стратегии могут помочь прояснить существующую путаницу в отношении актуальности статических анализов тромбоцитов, таких как агрегометрия, у пациента с травмой.
Все исследования проводились в соответствии с институциональными рекомендациями. Было получено одобрение от Управления по защите исследований человека Университета Питтсбурга и получено информированное согласие от здоровых добровольцев.
1. Подготовка микрофлюидных устройств
2. Подготовка образца крови
3. Проверка функции тромбоцитов под действием потока (Метод 1)
4. Проверка функции тромбоцитов в потоке с образцами малого объема (менее 1 мл) (метод 2)
5. Обеззараживание
6. Анализ изображений
Микрофлюидные эксперименты после использования этого метода должны показать образование богатых тромбоцитами тромбов в области стеноза проточного канала (рис. 1). На рисунке 1А показаны репрезентативные результаты, когда функциональные тромбоциты образовывали тромб в стенозированной области канала, блокируя кровоток через канал. Кривые средней интенсивности флуоресценции (MFI) кинетических изображений, полученных в течение эксперимента, иллюстрируют запаздывающую, рост и фазу плато включения тромбоцитов в растущий тромб (рис. 2A, C). Увеличение концентрации антагониста P2Y12, тикагрелора, снижает МФИ тромбоцитов, а также рассчитанную площадь под кривой (AUC) кривых ИМП (рис. 2B, D). Для наблюдения выраженной дисфункции тромбоцитов требуется более длительное время инкубации (30 мин по сравнению с 5 мин) в соответствии с более выраженной зависимостью «доза-реакция» с использованием импедансной агрегометрии цельной крови после 30-минутной инкубации тикагрелора по сравнению с 5-минутной инкубацией (дополнительный рисунок S1). При различных условиях использования транспортных средств аналогичные зависящие от времени эффекты ингибирования P2Y12 наблюдались в микрофлюидной модели (дополнительный рисунок S2).
Визуализация двух популяций тромбоцитов в смоделированном методе гемостатической реанимации иллюстрирует включение обеих популяций тромбоцитов в тромб (рис. 3A). Включение обеих популяций тромбоцитов в соответствующий флуоресцентный сигнал может быть количественно количественно определено кинетически в течение эксперимента с помощью измерений MFI (рис. 3B). Более крутые наклоны в фазе роста, а также увеличение конечных точек измерений MFI демонстрируют повышенную функциональность тромбоцитов и гемостатический потенциал, что можно увидеть в количественном определении тромбоцитов-реципиентов, когда образец крови был индуцирован дисфункцией тромбоцитов путем ингибирования P2Y12, а затем в реанимации, смоделированной путем смешивания свежей аутологичной цельной крови в объемном соотношении 1:10, окрашенной отчетливым флуорофором тромбоцитов. При аутологичном смешивании цельной крови большее количество тромбоцитов было включено из моделируемого трансфункционирующего продукта по сравнению с продуктом аферезного тромбоцитов при 5-м дне хранения при комнатной температуре, что показало минимальное включение продукта в формирующийся тромб. Смешивание тромбоцитов комнатной температуры на 5-й день также показало более низкое включение тромбоцитов реципиентом по сравнению со свежей аутологичной цельной кровью (рисунок 3B).
Рисунок 1: Представление тестирования функции тромбоцитов с использованием микрофлюидики. (A) Показана схематическая микрофлюидная экспериментальная установка для тестирования функции тромбоцитов с использованием образцов крови малого объема, включая насос для отвода шприца, протягивающий кровь через стенотическую проточную камеру, что позволяет получать изображения в режиме реального времени. (B) Показан вид сбоку на стенотическую проточную камеру, включая покрытую коллагеном поверхность, на которой тромбоциты будут прилипать, активироваться и агрегировать, что приводит к росту тромба в стенозированной области. (C) Съемка в режиме реального времени образца цитратной крови под потоком в стенотическом микрофлюидном канале (3500 с-1) и растущего тромба, сформированного в течение 300 с. Масштабные линейки = 200 μм (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Уменьшение изменений кратности ИМП тромбоцитов и площадь под кривой после 30 мин инкубации с антагонистом P2Y12 Тикагрелором. (А) Инкубация с антагонистом P2Y12 в течение всего 5 мин демонстрирует несколько удлиненные запаздывающие фазы кривых ИМП и (В) небольшое снижение AUC ИМП. (C) Инкубация в течение 30 мин с антагонистом P2Y12 приводит к удлинению фаз лага и снижению конечных значений MFI, а также (D) более устойчивой дисфункции, демонстрируемой с помощью MFI AUC. Отдельные точки данных представляют биологические реплики, а среднее ± стандартное отклонение отображается. Сокращения: MFI = средняя интенсивность флуоресценции; AUC = площадь под кривой; HP-β-CD = 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Смешивание продуктов крови с коагулопатическим ингибированием P2Y12 в образце реципиента, имитирующее дисфункцию тромбоцитов пациента, в микрофлюидной камере. (A) Аферезная тромбоцитарная единица (плазма, 7-й день хранения) (CD41 в голубом цвете), смешанная в соотношении 1:10 с цитратной кровью, предварительно инкубированной с 0,8 мкМ тикагрелором в течение 30 мин (CD41 в красном цвете). (B) Репрезентативные нормализованные средние кривые интенсивности флуоресценции образца крови реципиента, получающего либо аферезную тромбоцитарную единицу (5-й день хранения), либо аутологичную свежую цельную кровь (соотношение 1:10), а также кинетику тромбоцитов реципиента с течением времени. Кровь рецитриента предварительно инкубировали с 0,8 мкМ тикагрелором в течение 30 мин перед смешиванием с продуктами крови. (C) Репрезентативное изображение z-стека с модифицированного устройства, прикрепленного к покровному стеклу для конфокальной микроскопии. Продукт тромбоцитов афереза смешивали с образцом тромбоцитопенической крови в объемном соотношении 1:5 (продукт:кровь) в дополнение к антителам к фактору фон Виллебранда (1:600). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Код Matlab для анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S1: Зависимость импедансной агрегометрии цельной крови от времени ингибирования P2Y12 Тикагрелором. Инкубация в течение 30 мин приводит к более выраженной зависимости «доза-реакция» по сравнению с 5 мин. Растворы для транспортных средств и лекарств использовались в концентрации 0,1% по объему. Отдельные точки данных представляют биологические реплики, а среднее ± стандартное отклонение отображается. Сокращения: AUC = площадь под кривой; HP-β-CD = 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2:Зависящее от времени ингибирование P2Y12 Тикагрелором в микрофлюидной модели функции тромбоцитов. Репрезентативные кривые MFI и площадь под значениями кривой для технических реплик от индивидуального здорового донора показаны с использованием этанола (1% v/v), используемого для растворимости препарата. Сокращения: MFI = средняя интенсивность флуоресценции; AUC = площадь под кривой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Вышеуказанный протокол включает в себя некоторые важные шаги для обеспечения надежности и воспроизводимости экспериментов. Во-первых, следует тщательно рассмотреть вопрос о флуоресцентных антителах. Антитела, используемые для обнаружения тромбоцитов в образце, не должны блокировать функцию рецептора гликопротеина Ib (GPIb) тромбоцитов. Согласование партий, когда это возможно между экспериментами, также имеет решающее значение для обеспечения воспроизводимости флуоресцентного сигнала. Еще одним важным шагом в этом протоколе является использование стерильных расходных материалов и растворов, а также отфильтрованных образцов, когда это возможно. Фильтрация образцов крови непосредственно перед экспериментом предотвратит блокирование потока мусором или сгустками тромбоцитов, размер которых превышает размеры канала, что является еще одним важным параметром, который необходимо поддерживать между экспериментами. Кроме того, образцы крови должны быть проверены в течение 4 часов после сбора, как описано в циркуляре с информацией об использовании человеческой крови и ее компонентов, подготовленном AABB, Американским Красным Крестом, Американскими центрами крови и Программой крови вооруженных сил, за исключением случаев тестирования на повреждение продуктов крови при хранении.
В этом протоколе могут быть учтены модификации, такие как приклеивание PDMS к покровному стеклу для конфокальной микроскопии, как показано на рисунке 3C. При необходимости, перед визуализацией, фиксирующий раствор может быть перфузирован через каналы и промыт PBS для хранения перед визуализацией. Кроме того, в то время как воспроизводимые размеры канала являются ключом к обеспечению сохраняющейся скорости сдвига между условиями, высота стенозирующей области может быть изменена, но будет напрямую влиять на время образования тромба, даже если скорость сдвига совпадает. Поскольку большие размеры канала потребуют больше времени для значительного образования тромбов, потребуется больший объем образца. При устранении неполадок в этом протоколе важным фактором должна быть стратегия нанесения покрытия. Конкретный тип коллагена, время, разведение и условия хранения — все это факторы, которые могут повлиять на поверхностное покрытие. Несмотря на то, что этот протокол был валидирован для данного конкретного коллагенового реагента (Таблица материалов), можно рассмотреть альтернативы коллагену, которые могут надежно прилипать к поверхности устройства и проверять адгезию с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания или других мер, которые ранее успешно использовались другими группами24.
Потенциальным ограничением этого протокола является отсутствие прямого эндотелиального ответа. Тем не менее, стратегии нанесения покрытий и модификации могут быть сделаны для включения тестирования функции тромбоцитов в ответ на повреждение эндотелия. Например, воспалительные факторы, которые эндотелиальные клетки выделяют в ответ на повреждение, могут быть изменены в стратегии покрытия данного протокола или добавлены экзогенно в исследуемый образец крови. Добавление этих факторов без сложностей клелюляризации позволило бы разработать целенаправленный подход к изучению влияния эндотелиопатии на функцию тромбоцитов. Аналогичным образом, плазма пациента из больного или здорового контрольного состояния может быть введена в систему для проверки влияния растворимых в плазме медиаторов на функцию тромбоцитов.
Изучение функции тромбоцитов в потоке в соответствии с этим протоколом может облегчить изучение коагулопатии, вызванной травмой, и подходов трансфузионной медицины при травме. Текущее тестирование функции тромбоцитов часто чрезмерно или недостаточно потенцировано, чтобы увидеть дисфункциональную реакцию у пациента с травмой. Этот метод обеспечивает гибкость и модификацию конструкции для наблюдения за функцией тромбоцитов в образцах пациентов с травмой, даже с ограничениями по объему, в дополнение к моделированию дисфункции тромбоцитов для оценки терапевтических вмешательств. Помимо пациентов с травмой, этот метод может быть рассмотрен для пациентов с послеродовым кровотечением, кардиохирургических пациентов или онкологических пациентов для оценки функциональности тромбоцитов и потенциальных терапевтических вмешательств. Важно отметить, что этот метод включает в себя динамику потока, которая имеет решающее значение для механизмов формирования тромбоцитарных пробок и гемостатической функции.
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Авторы выражают признательность и благодарят всех доноров крови, которые приняли участие, а также флеботомистов Исследовательской лаборатории травматологии и трансфузионной медицины и Центр клинических и трансляционных исследований UPMC Montefiore за помощь в сборе средств. SMS поддерживает K25HL161401. MDN поддерживается 1R01HL166944-01A1.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipments | |||
Axio Observer | Zeiss | 491917-0001-000 | |
Bel-Art Space Saver Vacuum Desiccators | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate Stirrer | Fisher Scientific | FB30786161 | |
Nutating Mixer | Fischer Scientific | 88-861-043 | |
OHAUS Scout Balance Scale | Uline | H-5852 | |
Oven | Fisher Scientific | 15-103-0520 | |
Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G (115V) | |
Syringe Pump (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE) | Harvard Apparatus | 883015 | |
Zen 3.4 | Zeiss | Blue edition | Software |
Material | |||
1/16 inch ID - Barbed Elbow Connectors | Qosina | 11691 | |
10 mL syringe | Fischer Scientific | 14-955-459 | |
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin | Cayman Chemicals | 16169 | 30% Dissolved in Phosphate buffered saline |
40-micron filters | Fischer Scientific | NC1469671 | |
CD41 antibody | Novus Biologicals | NB100-2614 | 1:600 Ratio in Whole Blood |
Chrono-Par Collagen Reagent | Chrono Log Corporation | 385 | 1:5 Ratio in 0.9% Saline |
Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mm | Fisher Scientific | NC0856599 | |
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
Essendant 121oz. Clorox Germicidal Bleach | Fischer Scientific | 50371500 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | 70% |
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed Gas | Supra | 1381978 | |
Human TruStain | Biolegend | 422302 | 1:600 Ratio in Whole Blood |
LevGo smartSpatula Disposable Polypropylene Spatula | Fisher Scientific | 18-001-017 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 10010-023 | |
Safety Scalpel | Fisher Scientific | 22-079-718 | |
Saline | Millipore | 567442 | 0.90% |
Sartorius Polystyrene Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-744 | |
Superslip Cover Slips - Superslip No. 1.5 | Fisher Scientific | 12-541-055 | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9285739 | Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ticagrelor | Cayman Chemicals | 15425 | |
Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft length | McMaster-Carr | 6516T11 | |
Ultra-Machinable 360 Brass Bar | McMaster-Carr | 8954K721 | For master mold fabrication |
Vacutainers | BD | 363083 | |
World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mm | Fisher Scientific | NC1215626 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены