JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمكن تقييم وظيفة الصفائح الدموية تحت التدفق ويمكن نمذجة محاكاة الإنعاش المرقئ باستخدام جهاز ميكروفلويدي ، والذي له تطبيقات في طب الصدمات ونقل الدم.

Abstract

تشتمل الموائع الدقيقة على ركائز وتدفقات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية تحاكي الأوعية الدموية ، وبالتالي فهي أداة قيمة لدراسة جوانب تجلط الدم والإرقاء. في البيئات عالية القص التي تحاكي التدفق الشرياني ، يسهل اختبار الموائع الدقيقة دراسة وظيفة الصفائح الدموية ، حيث تتشكل الجلطات الغنية بالصفائح الدموية في منطقة تضيقية موضعية لقناة التدفق. يمكن أن يساعد استخدام الأجهزة التي تسمح بحجم عينة صغير أيضا في تقييم وظيفة الصفائح الدموية تحت التدفق من عينات المرضى محدودة الحجم أو النماذج الحيوانية. قد تساعد دراسة عينات أو عينات مرضى الصدمات بعد نقل منتجات الصفائح الدموية في توجيه الاستراتيجيات العلاجية لمجموعات المرضى التي تكون فيها وظيفة الصفائح الدموية أمرا بالغ الأهمية. يمكن أيضا دراسة آثار تثبيط الصفائح الدموية عن طريق العوامل الدوائية في هذا النموذج. الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء منصة موائع دقيقة تتضمن التدفق الفسيولوجي والأسطح البيولوجية والآليات المرقئة ذات الصلة لتقييم وظيفة الصفائح الدموية مع الآثار المترتبة على دراسة اعتلال التخثر الناجم عن الصدمات وطب نقل الدم.

Introduction

الصدمة هي سبب عالمي رئيسي للوفاة والعجز. غالبا ما تكون الإصابة الشديدة معقدة بسبب اضطراب داخلي فريد من الإرقاء والتخثر ، يسمى اعتلال التخثر الناجم عن الصدمة (TIC) 1. تلعب الصفائح الدموية دورا مهما في TIC ، وقد تم وصفها بأنها لها وظائف تكيفية وغير قابلةللتكيف 2. لا تزال آليات الخلل الوظيفي للصفائح الدموية بعد الإصابة غير واضحة ، وهناك حاجة ماسة لفهم الاستجابة الخلوية بشكل أفضل لتوجيه تطوير الإنعاش والعلاج المحسنين. هناك مشكلة مزعجة إضافية فيما يتعلق بوظيفة الصفائح الدموية بعد الإصابة وهي عدم اليقين من موثوقية القراءات الحالية لوظيفة الصفائح الدموية في مريض الصدمة.

أظهرت دراسات متعددة أنه حتى المرضى المصابين بجروح طفيفة ، مع عدم وجود نمط ظاهري معروف للنزيف السريري ، لديهم وظيفة صفائح الدموية غير الطبيعية باستخدام اختبار وظيفة الصفائح الدموية التقليدي مثل قياس التجميع3،4. ومع ذلك ، فإن القيود المفروضة على قياس التجميع لتقييم وظيفة الصفائح الدموية في بيئة الإصابة تشمل نقص سطح الإصابة ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية ، والنهج الاختزالي للتحفيز الناهض ، وتخفيف العينة باستخدام تجميع مقاومة الدم الكامل ، وفصل البلازما مع تجميع انتقال الضوء البصري ، وتقييم العينة الراكدة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت حساسية وظيفة الصفائح الدموية هذه تمثل خللا خلويا حقيقيا أو قطعة قياس ، مثل زيادة المعاوقة الكهربائية الأساسية ، في وضع الإصابة2. وبالتالي ، فإن دراسة وظائف الصفائح الدموية ذات الصلة في سياق الصدمة أمر بالغ الأهمية لفهم TIC ، وهناك مجال كبير للابتكار والتحسين في هذا المجال.

لا تتضمن المنصات المستخدمة تقليديا لدراسة وظيفة الصفائح الدموية ديناميكيات السوائل وتدفقها ، والتي قد تكون حاسمة في فهم الخلل الوظيفي للصفائح الدموية المتعلق بالصدمة واعتلال التخثر الناجم عن الصدمات5. تشمل آليات الإرقاء التي تعتمد على التدفق استطالة عامل فون ويلبراند (VWF) عند القص العالي ، فوق معدل القص الحرج ، والتقاط الصفائح الدموية عبر البروتين السكري 1 ب6،7،8 ، والتي لا يتم التقاطها باستخدام فحوصات وظيفة الصفائح الدموية الراكدة. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط الصفائح الدموية بشكل تفضيلي ب VWF أو الفيبرينوجين اعتمادا على نظام التدفق وتثير أدوارا تفاضلية في التخثر الشرياني مقابل التخثر الوريدي9،10. تتكون الجلطات الشريانية بشكل أساسي من الصفائح الدموية بينما تتكون الجلطات الوريدية بشكل أساسي من خلايا الدم الحمراء ، وتستند جزئيا إلى أنظمة التدفق11. يمكن أن تساعد المقايسات التي تتضمن أنظمة التدفق في توضيح الاختلالات المتعلقة بطيف الأنماط الظاهرية ل TIC ، من نقص التخثر والأنماط الظاهرية للنزيف إلى فرط التخثر والأنماط الظاهرية للتخثر. أخيرا ، قد تجعل قيود أخذ عينات حجم الدم مع مرضى الصدمات اختبار وظائف الصفائح الدموية التقليدي أمرا صعبا. في حين أن المقايسات مثل قياس التدفق الخلوي يمكن ويجب استخدامها في هذه الظروف ، فإن النتائج غالبا ما تصور التوصيف المادي للعينة وليس تقييما وظيفيا مرققا.

في حين أن آليات ضعف الصفائح الدموية قد لا تكون مفهومة تماما في الصدمة ، فإن نمذجة الخلل الوظيفي للصفائح الدموية في المختبر ، مع مضادات P2Y12 على سبيل المثال ، يمكن أن تساعد أيضا في توجيه دراسة التدخلات العلاجية. يعد الإنعاش المرقئ مهما للغاية في مرضى الصدمات حيث يتم نقل منتجات الدم في نهج متوازن لمعالجة الصدمة واعتلال التخثر وإصابة البطانة إما بالدم الكامل أو مكونات الدم (خلايا الدم الحمراء والبلازما ومركزات الصفائح الدموية) بنسبة وحدة 1: 1: 1 12،13،14. في مرضى الصدمات ، يرتبط الاستخدام المبكر لمنتجات الدم بتحسين البقاء على قيدالحياة 15،16. لإطالة العمر الافتراضي ، تمت دراسة منتجات الصفائح الدموية المخزنة على البارد بشكل متزايد. يظهر فحص الصفائح الدموية المخزنة على البارد زيادة في نشاط مرقئ ، بالإضافة إلى السلامة عند نقلها بعد الإصابة17،18.

يؤكد تطور إنعاش الصفائح الدموية المخزنة على البارد على الحاجة إلى اختبارات إضافية لفهم منتج الصفائح الدموية الأكثر فعالية المتاح للصدمات. ومع ذلك ، غالبا ما تكون فحوصات وظائف الصفائح الدموية التقليدية مفرطة أو ناقصة للكشف عن الخلل الوظيفي ، والتي تحدث في كل من مريض الصدمة الذي يتلقى نقل الصفائح الدموية العلاجي وكذلك في المنتج المنقول نفسه الذي يظهر في آفات تخزين الصفائح الدموية. قد يكون تحديد أصل الخلل الوظيفي أمرا صعبا ، نظرا للقيود المفروضة على فحوصات وظائف الصفائح الدموية الحالية ، بما في ذلك الطبيعة الثابتة لمعظم هذه الاختبارات. لذلك ، عند دراسة الإنعاش المرقئ في المختبر ، فإن المنصة وطرق الكشف لكل من مجموعات الصفائح الدموية المتلقية والمنتج لها أهمية حاسمة في تحديد التدخلات العلاجية المثلى.

يوفر اختبار الموائع الدقيقة ملفات تعريف التدفق والأسطح الحيوية لإنشاء اختبار ذي صلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة الصفائح الدموية. يمكن تخصيص أجهزة الموائع الدقيقة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية أو أنواع الإصابات ، مثل ثقب الأوعيةالدموية 19 أو تلف البطانية20. تتكون هذه الأجهزة بشكل عام من بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) المرتبط بشريحة مجهر زجاجي مع تعديلات على السطح ، مثل الكولاجين ، لتقليد البطانة الفرعية وإصابة الأنسجة. يمكن أن يساعد استخدام هذه الأنواع من الأجهزة القائمة على التدفق في توجيه أبحاث الخلل الوظيفي للصفائح الدموية المرتبطة بالصدمات والمساعدة في فحص الأساليب المثلى لطب نقل الدم لتحسين الخلل الوظيفي للصفائح الدموية. قد تساعد هذه الاستراتيجيات في توضيح الارتباك الموجود حول أهمية مقايسات الصفائح الدموية الثابتة مثل قياس التجميع في المريض المصاب.

Protocol

تم إجراء جميع الأبحاث وفقا للإرشادات المؤسسية. تم الحصول على موافقة من مكتب حماية البحوث البشرية بجامعة بيتسبرغ والحصول على موافقة مستنيرة من المتطوعين البشريين الأصحاء.

1. إعداد جهاز الموائع الدقيقة

  1. لتصنيع جزء PDMS من الجهاز ، قم بإعداد قالب رئيسي باستخدام النحاس الأصفر عبر التحكم العددي بالكمبيوتر (CNC) بالآلات الدقيقة.
    ملاحظة: اعتمادا على أبعاد القناة ، يمكن استخدام تقنيات الطباعة الحجرية الضوئية لإنشاء قالب رئيسي. يشتمل الجهاز المستخدم في هذا البروتوكول على ثماني قنوات متوازية ذات تشكيل دقيق يبلغ عرضها حوالي 480 ميكرومتر ، وطولها 140 ميكرومتر عند مدخل ومخرج الجهاز ، وطول 40 ميكرومتر عند تضيق الجهاز ، بطول منحدر من / إلى منطقة التضيق حوالي 0.3 مم. أطوال القنوات حوالي 6 مم.
  2. مع الحصول على قالب رئيسي ، اسكب قاعدة المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكون (التي تم الحصول عليها من مجموعة المطاط الصناعي) في طبق وزن. أضف عامل معالجة السيليكون (الذي تم الحصول عليه من مجموعة المطاط الصناعي) ، مما يسهل الربط المتقاطع لسلاسل بوليمر السيليكون لتحويل PDMS السائل إلى مادة صلبة متينة ومرنة ، بنسبة 10: 1 (عامل أساسي) وتقليب الخليط جيدا.
  3. ضع القالب في طبق بتري واسكب PDMS غير المعالج على القالب. ضع طبق بتري داخل مجفف مفرغ كهربائي لمدة 30 دقيقة لإزالة الفقاعات.
  4. قم بإنهاء معالجة PDMS في القالب الرئيسي عن طريق وضعه في فرن مضبوطة على 70 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  5. بعد المعالجة الكاملة ل PDMS ، قم بقطع قالب الموائع الدقيقة باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط. قم بعمل ثقوب على حواف القنوات (قطرها 1.5 مم على كلا الجانبين).
  6. باستخدام شريط المختبر ، قم بتنظيف سطح الشريحة الزجاجية والجانب المحفور من قالب الموائع الدقيقة. استخدم الهواء المضغوط حسب الحاجة لإزالة الحطام المتبقي.
  7. ضع الشريحة الزجاجية والمصبوب الموائع الدقيقة مع الجانب المحفور لأعلى في منظف البلازما. ابدأ تشغيل مضخة التفريغ ، وأغلق الغرفة ، وقم بتشغيل منظف البلازما إلى الإعداد العالي. اترك الشريحة و PDMS في منظف البلازما لمدة 30 ثانية ، ثم قم بإيقاف تشغيل منظف البلازما وإزالة الفراغ.
  8. اربط الجبيرة والشريحة الزجاجية التي تم تنظيفها بالبلازما معا عن طريق الضغط برفق على الجوانب التي كانت متجهة لأعلى في منظف البلازما. بعد ذلك ، ضع جهاز الموائع الدقيقة في فرن / لوح تسخين على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: لا تضغط كثيرا عند ربط الشريحة المصبيرة والزجاج معا لأن ذلك قد يؤدي إلى فقدان مورفولوجيا القناة.
  9. اشطف كل حجرة ب 10-30 ميكرولتر من 70٪ إيثانول لتعقيمها والسماح لجهاز الموائع الدقيقة بالجفاف على لوح ساخن 70 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب تصنيع الأجهزة قبل 24 ساعة على الأقل ولكن يمكن تصنيعها قبل أسابيع إلى شهور. يجب تخزين الأجهزة في حاوية محكمة الإغلاق أو طبق بتري مغطى في درجة حرارة الغرفة.
  10. في اليوم السابق لتجربة جهاز الموائع الدقيقة ، أعد شطف كل غرفة ب 10-30 ميكرولتر من 70٪ إيثانول لتعقيم والسماح لجهاز الموائع الدقيقة بالجفاف على لوح تسخين 70 درجة مئوية.
  11. قم بتغطية الغرفة بكاشف الكولاجين الليفي للخيول من النوع 1 (1 مجم / مل) ، مخفف بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم بنسبة حجمية 1: 5 من خلال مخرج مخصص للمدخل المحدد. تأكد من الحفاظ على الاتجاه داخل التجربة. قم بتخزين الجهاز في وعاء مغلق دافئ ورطب لمنع تبخر الكولاجين المطلي داخل القناة.
  12. بعد 1 ساعة ، اشطفها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لطرد محلول الكولاجين. اغسل في الاتجاه المعاكس للطلاء. عندما لا يكون قيد الاستخدام ، قم بتخزين الجهاز مرة أخرى في حاوية دافئة ورطب ومغلقة.

2. تحضير عينة الدم

  1. الحصول على عينة دم كامل مسجلة عن طريق بزل الوريد. احتضان الدم الكامل المسيطر بمحلول حجب مستقبلات FC (1: 600).
    ملاحظة: يتم تخزين عينات الدم في درجة حرارة الغرفة قبل وأثناء التجارب.
  2. احتضان الدم الكامل المسيطر مع الجسم المضاد CD41 المترافق الفلوري (باستخدام الفلوروفور المفضل) (1: 600). وصمة عار لمدة 30 دقيقة على الروك الجوزي.
  3. كعنصر تحكم إيجابي في تثبيط الصفائح الدموية ، أضف Ticagrelor ، وهو مضاد لمستقبلات P2Y12 أعيد تشكيله في محلول 30٪ وزن / حجم 2-هيدروكسي بروبيل-β-سيكلودكسترين (HP-β-CD) في PBS.
    ملاحظة: يجب تحضير مخزونات Ticagrelor حتى 6.4 ملي مولار ويمكن إجراء مزيد من التخفيف لمخزونات Ticagrelor في محلول HP-β-CD (30٪ HP-β-CD مذاب في PBS) قبل التجربة (يوصى بتركيزات مخزون 1,000 ضعف).
  4. احتضان العينة المسجلة باستخدام Ticagrelor (التركيز النهائي حتى 6.4 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة لمراقبة تثبيط الصفائح الدموية.
  5. في حالة خلط منتج الدم مع العينة المقذرة ، قم بتلطيخ منتج الدم بمحلول حجب مستقبلات FC (1: 600) ومترافق فلوري (باستخدام فلوروفور منفصل ومتميز للعينة السيترية) CD41 (1: 600).
    1. امزج المكافئ الحجمي لوحدات الإنتاج المنقولة مع العينة المصابة. على سبيل المثال ، لمحاكاة وحدتين من منتجات الصفائح الدموية المنقولة إلى شخص ينزف (حوالي 250 مل لكل منتج في حجم دم إجمالي يبلغ 5,000 مل) ، امزج 100 ميكرولتر من منتج الدم في 1,000 ميكرولتر من عينة الدم الستراترية.
  6. قبل التجربة مباشرة ، قم بتصفية عينة الدم من خلال مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.

3. اختبار وظيفة الصفائح الدموية تحت التدفق (الطريقة 1)

  1. قم بتشغيل المجهر والبرامج المرتبطة به.
  2. اضبط مستوى مضخة حقنة السحب مع مرحلة المجهر. اضبط الإعدادات على مضخة الحقنة.
    1. احسب معدل التدفق الحجمي (Q) لمتوسط معدل قص الجدار المطلوب (γ) البالغ 3,500 s-1 عند المنطقة الضيقة للقناة باستخدام المعادلتين (1) و (2)21.
      figure-protocol-5321(1)
      figure-protocol-5436(2)
      حيث A هي مساحة المقطع العرضي للقناة ، P هو المحيط المبلل ، λ هو عامل الشكل ، b هو الجانب القصير للمستطيل (الارتفاع) ، و a هو الجانب الطويل من المستطيل (العرض).
      ملاحظة: يتم اختيار قيمة 3,500 s-1 بسبب القص الحرج VWF وهي في النظام الشرياني 7,22,23.
  3. ضع جهاز الموائع الدقيقة على مرحلة المجهر. قم بلصق حواف جهاز الموائع الدقيقة على المسرح لتجنب الحركة. تأكد من أن المخرج يواجه الجزء الخلفي من المجهر.
  4. قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب ID 1/16 بوصة (بطول 30 سم تقريبا) بموصل الكوع والطرف الآخر بحقنة سعة 10 مل مع موصل معرف 1/16 بوصة.
  5. املأ المحقنة ب PBS معقم وقم بتوصيله بمضخة المحقنة.
  6. ضع موصل الكوع في مخرج الجهاز.
  7. قم بإعداد خطوط مدخل بطول 10 سم تقريبا مع موصل الكوع على أحد طرفيه والقطع الزاوي على الطرف الآخر.
  8. قم بتوصيل موصل كوع المدخل بمدخل الجهاز.
  9. ضع خط المدخل في أنبوب الطرد المركزي الدقيق للنفايات على حامل بزاوية.
  10. استخدم هدف 10x لأبعاد القناة التي يبلغ عرضها حوالي 500 ميكرومتر وركز على حواف قناة جهاز الموائع الدقيقة.
  11. قم بتجهيز الخطوط باستخدام PBS وقم بمسح القناة من أي PDMS / حطام عن طريق دفع مضخة الحقنة يدويا. تأكد من التحقق بالقرب من مدخل ومخرج القناة.
  12. افتح إعدادات التقاط الصور المحفوظة أو أنشئ إجراء التقاط صورة لصور السلاسل الزمنية التي يتم التقاطها كل 1-2 ثانية باستخدام قناة المجال الساطع وقنوات الفلورسنت المقابلة للأجسام المضادة الفلورية CD41 المستخدمة في عينة الدم.
  13. احصل على عينة الدم السترية المفلترة واخلطها عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل قبل التجربة مباشرة. ضع العينة على حامل الطرد المركزي الدقيق الزاوية.
  14. ضع خط المدخل في العينة.
  15. ابدأ في تسجيل التقاط الصورة.
  16. ببطء ، اسحب المحقنة لملء الحجم الميت في الأنبوب. بمجرد وصول الدم إلى القناة ، اضغط على الفور على تشغيل على مضخة الحقنة لاستئناف التدفق بمعدل القص المطلوب.
  17. اضبط التركيز إذا لزم الأمر.
  18. قم بإجراء التجربة حتى تسد الصفائح الدموية تماما المنطقة المضيقة لجهاز الموائع الدقيقة أو حتى نقطة نهاية تجريبية (أي 10 دقائق).
  19. تأكد من غمر أنبوب المدخل في عينة الدم طوال مدة التجربة.
  20. بمجرد اكتمال التجربة ، أوقف التقاط الصورة وأوقف مضخة الحقنة. احفظ التقاط الصورة.
  21. قم بإزالة موصل كوع المدخل وأفرغ محتويات الأنبوب في شكل مخروطي للنفايات. أفرغ محتويات الحقنة وخطوط المخرج في نفايات مخروطية أيضا.
  22. استبدل موصلات المدخل والمخرج والأنابيب حسب الضرورة للعينات اللاحقة.

4. اختبار وظيفة الصفائح الدموية تحت التدفق مع عينات منخفضة الحجم (أقل من 1 مل) (الطريقة 2)

  1. كرر الخطوات من 1.1 إلى 1.4 على النحو الوارد أعلاه.
  2. قم بثقب مخرج قطره 1.5 مم ومدخل قطره 3 مم عند حواف القنوات.
  3. كرر الخطوات من 1.6 إلى 3.6 على النحو الوارد أعلاه.
  4. استخدم هدف 10x لأبعاد القناة التي يبلغ عرضها حوالي 500 ميكرومتر وركز على حواف قناة جهاز الموائع الدقيقة.
  5. قم بتنظيف القناة من أي نظام PDMS / حطام عن طريق دفع مضخة الحقنة يدويا والتخلص من سائل الوصول بمسحة معملية. قم بإزالة أي حطام بشريط مختبر أعلى جهاز الموائع الدقيقة.
  6. قم بدفع المضخة يدويا لملء خزان المدخل 3 مم ب PBS.
  7. افتح إعدادات التقاط الصور المحفوظة أو أنشئ إجراء التقاط صورة لصور السلاسل الزمنية التي يتم التقاطها كل 1-2 ثانية باستخدام قناة المجال الساطع وقنوات الفلورسنت المقابلة للأجسام المضادة الفلورية CD41 المستخدمة في عينة الدم.
  8. ابدأ السحب على مضخة الحقنة (يدويا أو بسرعة محددة) وبمجرد أن يتقدم PBS إلى القناة وينخفض خط التعبئة في الخزان ، أوقف السحب مؤقتا على المضخة.
  9. قم بإزالة PBS الزائد من الخزان باستخدام ماصة.
  10. ابدأ التقاط الصورة.
  11. قم بسحب عينة الدم في الخزان (حوالي 40 ميكرولتر) وابدأ على الفور في حقنة السحب. تأكد من بدء التدفق.
    ملاحظة: إذا لم يتم تحضير محرك مضخة الحقنة للسحب في الخطوة 4.8 ، فلن يبدأ التدفق على الفور ، ويجب تكرار التجربة.
  12. أعد ملء خزان الدم طوال مدة التجربة ، مع ضمان عدم دخول جيوب هوائية إلى القناة.
  13. قم بإجراء التجربة حتى تسد الصفائح الدموية تماما المنطقة المضيقة لجهاز الموائع الدقيقة أو حتى نقطة نهاية تجريبية (أي 10 دقائق).
  14. بمجرد اكتمال التجربة ، أوقف التقاط الصورة وأوقف مضخة الحقنة. احفظ التقاط الصورة.
  15. قم بإزالة الدم الزائد في الخزان عن طريق سحب العينات. أفرغ محتويات أنبوب السحب في أنبوب مخروطي النفايات.
  16. استبدل الموصلات والأنابيب حسب الضرورة للعينات اللاحقة.

5. إزالة التلوث

  1. قم بتنظيف خطوط الدم الداخلية والمخرجة عن طريق التنظيف في محلول مبيض بنسبة 10٪.
  2. إذا تم استخدام جميع القنوات الموجودة على جهاز الموائع الدقيقة ، فتخلص من الجهاز في حاوية النفايات الخطرة بيولوجيا من Sharps.
    ملاحظة: يجب التخلص من جميع النفايات البيولوجية في النفايات البيولوجية بشكل مناسب.

6. تحليل الصور

  1. تصدير الصور من التجارب الحركية باستخدام البرنامج بالنقر فوق ملف | التصدير / الاستيراد | تصدير.
  2. حدد المعلمات التالية: نوع الملف: تنسيق ملف الصورة الموسومة (TIFF); الضغط: LZW. تحقق من البيانات الأصلية و Shift Pixel ؛ قم بإلغاء تحديد تطبيق منحنى العرض ولون القناة ؛ حدد تحديد مجموعة فرعية (منطقة، منطقة مستطيل، وحدد منطقة القناة مع قياس العرض والارتفاع المحفوظ بين الشروط). قم بالتصدير إلى المجلد المطلوب وتحقق من إنشاء مجلد.
  3. لاحظ القيم التجريبية أدناه على البرنامج: إطار البدء عندما يدخل الدم إلى القناة ؛ معدل الإطارات (المعلومات ، السلاسل الزمنية).
  4. قياس متوسط شدة التألق الطبيعي لكل إطار في تجربة باستخدام كود Matlab المقدم كملف تكميلي 1 ، وتغيير المدخلات التالية لكل تجربة: إطار البداية / إطار النهاية بناء على طول التجربة (تأكد من الحفاظ على طول التجربة بين الظروف) ؛ اسم التجربة/اسم المجلد؛ اقتصاص معلمات X و Y و H و W. قم بتشغيل الكود مرة واحدة لقناة فلورسنت الصفائح الدموية المستلمة ومرة واحدة لقناة فلورسنت الصفائح الدموية للمنتج. أبلغ عن قيم MFI (العمود 2) وAUC المعادية (تمت تسويتها لبدء الإطار). اطرح قيمة طول التجربة من قيمة AUC المعيارية.

النتائج

يجب أن تظهر تجارب الموائع الدقيقة بعد استخدام هذه الطريقة تكوين الجلطة الغنية بالصفائح الدموية في منطقة تضيق قناة التدفق (الشكل 1). يوضح الشكل 1 أ النتائج التمثيلية حيث شكلت الصفائح الدموية الوظيفية جلطة في المنطقة الضيقة من القناة لمنع تدفق الدم عبر القناة. توضح منحنيات متوسط شدة التألق (MFI) للصور الحركية التي تم التقاطها طوال مدة التجربة التأخر والنمو ومرحلة الهضبة لدمج الصفائح الدموية في الجلطة المتزايدة (الشكل 2 أ ، ج). تؤدي زيادة تركيزات مضاد P2Y12 ، Ticagrelor ، إلى تقليل MFI للصفائح الدموية بالإضافة إلى المساحة المحسوبة تحت المنحنى (AUC) لمنحنيات MFI (الشكل 2 ب ، د). هناك حاجة إلى أوقات حضانة أطول (30 دقيقة مقارنة ب 5 دقائق) لملاحظة الخلل الوظيفي الواضح للصفائح الدموية ، وفقا لعلاقة أكثر وضوحا بين الجرعة والاستجابة باستخدام تجميع مقاومة الدم الكامل بعد حضانة Ticagrelor لمدة 30 دقيقة مقارنة ب 5 دقائق من الحضانة (الشكل التكميلي S1). في ظل ظروف السيارة المختلفة ، لوحظت تأثيرات مماثلة تعتمد على الوقت لتثبيط P2Y12 في نموذج الموائع الدقيقة (الشكل التكميلي S2).

يوضح تصور مجموعتين من الصفائح الدموية في طريقة محاكاة الإنعاش المرقئ دمج كل من مجموعات الصفائح الدموية داخل الجلطة (الشكل 3 أ). يمكن قياس دمج كل من الصفائح الدموية في إشارة الفلورسنت المقابلة لها حركيا على مدار مدة التجربة عبر قياسات MFI (الشكل 3 ب). تظهر المنحدرات الأكثر حدة في مرحلة النمو بالإضافة إلى زيادة قياسات MFI النقطية زيادة وظائف الصفائح الدموية وإمكانات مرقئ ، والتي يمكن رؤيتها في القياس الكمي للصفائح الدموية المتلقية عندما تم تحفيز عينة الدم بخلل وظيفي في الصفائح الدموية عن طريق تثبيط P2Y12 ، ثم محاكاة الإنعاش عن طريق خلط الدم الكامل الذاتي الطازج بنسبة حجمية 1:10 ملطخة بفلوروفور صفائح ضفائح دموية مميزة. مع خلط الدم الكامل الذاتي ، تم دمج المزيد من الصفائح الدموية من المنتج المحاكي المنقول مقارنة بمنتج الصفائح الدموية الفصادة في يوم تخزين درجة حرارة الغرفة في اليوم 5 ، والذي أظهر الحد الأدنى من دمج المنتج في الجلطة المكونة. أظهر خلط منتج الصفائح الدموية في درجة حرارة الغرفة في اليوم 5 أيضا انخفاضا أقل في الصفائح الدموية المتلقية مقارنة بالاختلاط مع الدم الكامل الطازج (الشكل 3 ب).

figure-results-2420
الشكل 1: تمثيل اختبار وظائف الصفائح الدموية باستخدام الموائع الدقيقة. (أ) يظهر الإعداد التجريبي التخطيطي للموائع الدقيقة لاختبار وظائف الصفائح الدموية باستخدام عينات دم منخفضة الحجم ، بما في ذلك مضخة حقنة سحب تسحب الدم عبر غرفة تدفق تضيقية ، مما يسمح بالتقاط الصورة في الوقت الفعلي. (ب) يظهر منظر جانبي لغرفة التدفق الضيق ، بما في ذلك سطح مطلي بالكولاجين تلتصق عليه الصفائح الدموية وتنشط وتتجمع ، مما يؤدي إلى نمو الجلطة في المنطقة الضيقة. (ج) التقاط صورة في الوقت الحقيقي لعينة دم مسجلة تحت التدفق في قناة موائع دقيقة تضيقية (3,500 ثانية-1) وتخثر متنامي تشكلت على مدى 300 ثانية. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3457
الشكل 2: انخفاض تغيرات طي الصفائح الدموية MFI والمساحة تحت المنحنى بعد 30 دقيقة من الحضانة باستخدام مضاد P2Y12 Ticagrelor. (أ) يوضح الحضانة مع مضاد P2Y12 لمدة 5 دقائق فقط مراحل تأخر ممتدة قليلا لمنحنيات MFI و (ب) انخفاض طفيف في MFI AUC. (ج) يؤدي الحضانة لمدة 30 دقيقة باستخدام مضاد P2Y12 إلى مراحل تأخير ممتدة وتقليل قيم MFI لنقطة النهاية بالإضافة إلى (د) خلل وظيفي أكثر قوة يتم إظهاره عبر MFI AUC. تمثل نقاط البيانات الفردية التكرارات البيولوجية ويظهر متوسط ± الانحراف المعياري. الاختصارات: MFI = متوسط شدة التألق ؛ AUC = المنطقة تحت المنحنى ؛ HP-β-CD = 2-هيدروكسي بروبيل-β-سيكلودكسترين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4458
الشكل 3: خلط منتجات الدم مع تثبيط P2Y12 التخثري في العينة المتلقية ، مما يحاكي ضعف الصفائح الدموية لدى المريض ، في غرفة الموائع الدقيقة. (أ) وحدة الصفائح الدموية الفصادة (البلازما ، يوم التخزين 7) (CD41 في سماوي) مختلطة بنسبة 1:10 مع الدم القطبي المحتضن مسبقا مع 0.8 ميكرومتر Ticagrelor لمدة 30 دقيقة (CD41 باللون الأحمر). (ب) منحنيات شدة التألق المتوسطة العادية لعينة الدم المتلقية التي تتلقى إما وحدة الصفائح الدموية الفصادة (يوم التخزين 5) أو الدم الكامل الطازج الذاتي (نسبة 1:10) جنبا إلى جنب مع حركية الصفائح الدموية المتلقية بمرور الوقت. تم تحضين الدم المتلقي مسبقا ب 0.8 ميكرومتر تيكاجريلور لمدة 30 دقيقة قبل خلطه بمنتجات الدم. (ج) صورة z-stack تمثيلية من جهاز معدل مرتبط بغطاء للفحص المجهري متحد البؤر. تم خلط منتج الصفائح الدموية الفصادة مع عينة دم قلة الصفيحات بنسبة حجمية 1: 5 (المنتج: الدم) بالإضافة إلى الجسم المضاد لعامل فون ويلبراند (1: 600). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: كود Matlab لتحليل الصور. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S1: الاعتماد الزمني لتجميع مقاومة الدم الكامل لتثبيط P2Y12 مع Ticagrelor. ينتج عن الحضانة لمدة 30 دقيقة علاقة أكثر وضوحا بين الجرعة والاستجابة مقارنة ب 5 دقائق. تم استخدام حلول المركبات والأدوية بنسبة 0.1٪ من الحجم. تمثل نقاط البيانات الفردية التكرارات البيولوجية ويظهر متوسط ± الانحراف المعياري. الاختصارات: AUC = المنطقة تحت المنحنى. HP-β-CD = 2-هيدروكسي بروبيل-β-سيكلودكسترين. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: تثبيط P2Y12 المعتمد على الوقت باستخدام Ticagrelor في نموذج ميكروفلويديك لوظيفة الصفائح الدموية. يتم عرض منحنيات MFI التمثيلية وقيم المساحة تحت المنحنى للتكرارات التقنية من متبرع فردي سليم مع مركبة الإيثانول (1٪ حجم / حجم) المستخدمة للذوبان في الأدوية. الاختصارات: MFI = متوسط شدة التألق ؛ AUC = المنطقة تحت المنحنى. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يحتوي البروتوكول أعلاه على بعض الخطوات الحاسمة لضمان موثوقية التجارب وقابليتها للتكرار. أولا ، يجب النظر بعناية في الأجسام المضادة الفلورية. يجب ألا تمنع الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن الصفائح الدموية في العينة وظيفة مستقبلات الصفائح الدموية للبروتين السكري Ib (GPIb). تعد مطابقة الدفعة ، كلما أمكن ذلك بين التجارب ، أمرا بالغ الأهمية لضمان قابلية تكرار إشارة الفلورسنت. خطوة أخرى حاسمة في هذا البروتوكول هي استخدام المواد الاستهلاكية والمحاليل المعقمة والعينات المفلترة كلما أمكن ذلك. سيؤدي تصفية عينات الدم مباشرة قبل التجربة إلى منع الحطام أو كتل الصفائح الدموية الأكبر من أبعاد القناة من منع التدفق ، وهي معلمة مهمة أخرى للحفاظ على الاتساق بين التجارب. بالإضافة إلى ذلك ، يجب اختبار عينات الدم في غضون 4 ساعات من الجمع كما هو موضح في تعميم المعلومات لاستخدام الدم البشري ومكونات الدم التي أعدتها AABB والصليب الأحمر الأمريكي ومراكز الدم الأمريكية وبرنامج الدم للقوات المسلحة ، باستثناء اختبار آفة تخزين منتجات الدم.

يمكن النظر في التعديلات في هذا البروتوكول ، مثل ربط PDMS بغطاء للفحص المجهري متحد البؤر ، كما هو موضح في الشكل 3C. إذا لزم الأمر ، قبل التصوير ، يمكن نشر محلول مثبت عبر القنوات وغسله باستخدام PBS للتخزين قبل التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن أبعاد القناة القابلة للتكرار هي المفتاح لضمان معدلات القص المحفوظة بين الظروف ، يمكن تعديل ارتفاع المنطقة التضيقية ولكنها ستؤثر بشكل مباشر على توقيت تكوين الجلطة ، حتى لو كانت معدلات القص متطابقة. نظرا لأن أبعاد القناة الأكبر ستتطلب مزيدا من الوقت للوصول إلى تكوين الجلطة الكبيرة ، فسيكون من الضروري زيادة حجم العينة. عند استكشاف أخطاء هذا البروتوكول وإصلاحها ، يجب أن يكون أحد الاعتبارات المهمة هو استراتيجية الطلاء. نوع الكولاجين المحدد والتوقيت والتخفيف وظروف التخزين كلها عوامل قد تؤثر على طبقة السطح. بينما تم التحقق من صحة هذا البروتوكول لكاشف الكولاجين المعين هذا (جدول المواد) ، يمكن النظر في بدائل الكولاجين التي يمكن أن تلتصق بشكل موثوق بسطح الجهاز والالتصاق الذي تم التحقق من صحته عن طريق تلطيخ التألق المناعي أو غيرها من التدابير وقد تم استخدامها مسبقا من قبل مجموعات أخرى بنجاح24.

أحد القيود المحتملة لهذا البروتوكول هو عدم وجود استجابة بطانية مباشرة. ومع ذلك ، يمكن إجراء استراتيجيات وتعديلات الطلاء لتشمل اختبار وظيفة الصفائح الدموية استجابة لتلف البطانة. على سبيل المثال ، يمكن تعديل العوامل الالتهابية التي تفرزها الخلايا البطانية استجابة للإصابة في استراتيجية الطلاء لهذا البروتوكول أو إضافتها خارجيا إلى عينة الدم التي تم اختبارها. إن إضافة هذه العوامل دون تعقيدات الخلية من شأنه أن يسمح باتباع نهج مستهدف لفحص آثار اعتلال البطانة على وظيفة الصفائح الدموية. على نفس المنوال ، يمكن رفع بلازما المريض من المرض أو حالات التحكم الصحية في النظام لاختبار تأثير الوسطاء القابل للذوبان في البلازما على وظيفة الصفائح الدموية.

يمكن أن تسهل دراسة وظيفة الصفائح الدموية تحت التدفق باتباع هذا البروتوكول دراسة مناهج اعتلال التخثر الناجم عن الصدمات وطب نقل الدم في الصدمات. غالبا ما يكون اختبار وظائف الصفائح الدموية الحالي أكثر أو أقل من التحفيز لرؤية استجابة مختلة في مريض الصدمة. تسمح هذه الطريقة بالمرونة وتعديلات التصميم لمراقبة وظيفة الصفائح الدموية في عينات مرضى الصدمات ، حتى مع قيود الحجم ، بالإضافة إلى محاكاة الخلل الوظيفي للصفائح الدموية لتقييم التدخلات العلاجية. بالإضافة إلى مريض الصدمة ، يمكن النظر في هذه الطريقة لمرضى نزيف ما بعد الولادة أو مرضى جراحة القلب أو مرضى السرطان لتقييم وظائف الصفائح الدموية والتدخلات العلاجية المحتملة. الأهم من ذلك ، أن هذه الطريقة تتضمن ديناميكيات التدفق ذات الأهمية الحاسمة لآليات تكوين سدادات الصفائح الدموية ووظيفة مرقئ.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

يقر المؤلفون ويشكرون جميع المتبرعين بالدم الذين شاركوا ، بالإضافة إلى أخصائيي الفصد في مختبر أبحاث طب الصدمات ونقل الدم ومركز UPMC Montefiore للأبحاث السريرية والانتقالية للمساعدة في المجموعات. الرسائل القصيرة مدعومة من قبل K25HL161401. MDN مدعوم بواسطة 1R01HL166944-01A1.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipments
Axio ObserverZeiss491917-0001-000
Bel-Art Space Saver Vacuum DesiccatorsFisher Scientific08-594-15A
Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate StirrerFisher ScientificFB30786161
Nutating MixerFischer Scientific88-861-043
OHAUS Scout Balance ScaleUlineH-5852
OvenFisher Scientific15-103-0520
Plasma cleanerHarrickPDC-32G (115V)
Syringe Pump (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)Harvard Apparatus883015
Zen 3.4ZeissBlue editionSoftware
Material
1/16 inch ID - Barbed Elbow ConnectorsQosina11691
10 mL syringeFischer Scientific14-955-459
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrinCayman Chemicals1616930% Dissolved in Phosphate buffered saline
40-micron filtersFischer ScientificNC1469671
CD41 antibodyNovus Biologicals NB100-26141:600 Ratio in Whole Blood
Chrono-Par Collagen ReagentChrono Log Corporation3851:5 Ratio in 0.9% Saline
Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mmFisher ScientificNC0856599
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-402-25
Essendant 121oz. Clorox Germicidal BleachFischer Scientific50371500
EthanolFisher Scientific07-678-00570%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed GasSupra1381978
Human TruStainBiolegend4223021:600 Ratio in Whole Blood
LevGo smartSpatula Disposable Polypropylene SpatulaFisher Scientific18-001-017
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-A3
Phosphate buffered salineGibco10010-023
Safety ScalpelFisher Scientific22-079-718
SalineMillipore5674420.90%
Sartorius Polystyrene Weighing BoatsFisher Scientific13-735-744
Superslip Cover Slips - Superslip No. 1.5Fisher Scientific12-541-055
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitFisher ScientificNC9285739Polydimethylsiloxane (PDMS)
TicagrelorCayman Chemicals15425
Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft lengthMcMaster-Carr6516T11
Ultra-Machinable 360 Brass BarMcMaster-Carr8954K721For master mold fabrication
VacutainersBD363083
World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mmFisher ScientificNC1215626

References

  1. Moore, E. E., et al. Trauma-induced coagulopathy. Nat Rev Dis Primers. 7 (1), 1-23 (2021).
  2. Vulliamy, P., et al. Alterations in platelet behavior after major trauma: adaptive or maladaptive. Platelets. 32 (3), 295-304 (2021).
  3. Starr, N. E., et al. Identification of injury and shock driven effects on ex vivo platelet aggregometry: A cautionary tale of phenotyping. J Trauma Acute Care Surg. 89 (1), 20-28 (2020).
  4. Kutcher, M. E., et al. Characterization of platelet dysfunction after trauma. J Trauma Acute Care Surg. 73 (1), 13-19 (2012).
  5. Yakusheva, A. A., et al. Traumatic vessel injuries initiating hemostasis generate high shear conditions. Blood Adv. 6 (16), 4834-4846 (2022).
  6. Colace, T. V., Diamond, S. L. Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).
  7. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von Willebrand factor fibers. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (19), 7899-7903 (2007).
  8. Savage, B., Almus-Jacobs, F., Ruggeri, Z. M. Specific synergy of multiple substrate-receptor interactions in platelet thrombus formation under flow. Cell. 94 (5), 657-666 (1998).
  9. Savage, B., Saldívar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84 (2), 289-297 (1996).
  10. Ruggeri, Z. M., Mendolicchio, G. L. Adhesion mechanisms in platelet function. Circ Res. 100 (12), 1673-1685 (2007).
  11. Chernysh, I. N., et al. The distinctive structure and composition of arterial and venous thrombi and pulmonary emboli. Sci Rep. 10 (1), 5112(2020).
  12. Holcomb, J. B., et al. Transfusion of plasma, platelets, and red blood cells in a 1:1:1 vs a 1:1:2 ratio and mortality in patients with severe trauma: The PROPPR randomized clinical trial. JAMA. 313 (5), 471-482 (2015).
  13. Shea, S. M., et al. Doing more with less: low-titer group O whole blood resulted in less total transfusions and an independent association with survival in adults with severe traumatic hemorrhage. J Thromb Haemost. 22 (1), 140-151 (2024).
  14. Cardenas, J. C., et al. Platelet transfusions improve hemostasis and survival in a substudy of the prospective, randomized PROPPR trial. Blood Adv. 2 (14), 1696-1704 (2018).
  15. Sperry, J. L., et al. Prehospital plasma during air medical transport in trauma patients at risk for hemorrhagic shock. N Engl J Med. 379 (4), 315-326 (2018).
  16. Meyer, D. E., et al. Every minute counts: Time to delivery of initial massive transfusion cooler and its impact on mortality. J Trauma Acute Care Surg. 83 (1), 19-24 (2017).
  17. Shea, S. M., et al. Cold-stored platelet hemostatic capacity is maintained for three weeks of storage and associated with taurine metabolism. J Thromb Haemost. 22 (4), 1154-1166 (2024).
  18. Sperry, J. L., et al. Early cold stored platelet transfusion following severe injury: a randomized clinical trial. Ann Surg. 280 (2), 212-221 (2024).
  19. Schoeman, R. M., et al. A microfluidic model of hemostasis sensitive to platelet function and coagulation. Cell Mol Bioeng. 10 (1), 3-15 (2017).
  20. Sakurai, Y., et al. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis. Nat Commun. 9 (1), 509(2018).
  21. Miller, C. Predicting non-Newtonian flow behavior in ducts of unusual cross section. Ind Eng Chem Fundamentals. 11 (4), 524-528 (1972).
  22. Kim, D., Bresette, C., Liu, Z., Ku, D. N. Occlusive thrombosis in arteries. APL Bioeng. 3 (4), 041502(2019).
  23. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
  24. Sorrells, M. G., Neeves, K. B. Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays. Micromachines. 11 (1), 62(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved