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フロー下での血小板機能を評価し、マイクロ流体デバイスを使用してシミュレートされた止血蘇生法をモデル化でき、これは外傷および輸血医療に応用できます。
マイクロ流体工学は、血管系を模倣する生理学的に関連性のある基質と流れを組み込んでいるため、血栓症と止血の側面を研究するための貴重なツールです。動脈の流れをシミュレートする高せん断環境では、マイクロ流体アッセイにより、流路の局所狭窄領域に多血小板血栓が形成されるため、血小板機能の研究が容易になります。少量のサンプルを許容するデバイスを利用することで、量が限られている患者サンプルや動物モデルからの流れ下での血小板機能の評価にも役立ちます。外傷患者のサンプルまたは血小板製品輸血後のサンプルを研究することは、血小板機能が重要な患者集団の治療戦略を指示するのに役立つ可能性があります。薬理学的薬剤による血小板阻害の効果も、このモデルで研究できます。このプロトコルの目的は、生理学的流れ、生物学的表面、および関連する止血メカニズムを組み込んだマイクロ流体プラットフォームを確立することです 外傷誘発性凝固障害と輸血医学の研究に影響を与える血小板機能を評価します。
トラウマは、世界の主要な死因と障害の原因です。重傷は、外傷誘発性凝固障害(TIC)1と呼ばれる、止血と血栓症の独特な内因性障害によってしばしば複雑になります。血小板はTICにおいて重要な役割を果たしており、適応機能と不適応機能の両方を持っていると説明されています2。損傷後の血小板機能障害のメカニズムは依然として不明であり、改善された蘇生と治療の開発を導くために、細胞応答をよりよく理解することが非常に重要です。損傷後の血小板機能に関する追加の厄介な問題は、外傷患者の血小板機能の現在の測定値の信頼性の不確実性です。
複数の研究により、臨床的出血表現型が知られていない軽傷の患者でさえ、凝集法などの従来の血小板機能検査を使用して異常な血小板機能を持っていることが示されています3,4。ただし、損傷環境で血小板機能を評価するための凝集法には、生理学的に関連する損傷表面の欠如、アゴニスト刺激への還元主義的アプローチ、全血インピーダンス凝集法によるサンプル希釈、光透過凝集法による血漿分離、およびサンプル評価の停滞が含まれます。さらに、この血小板機能の感度が真の細胞機能障害を表しているのか、それとも損傷の状況におけるベースラインの電気インピーダンスの増加などの測定アーティファクトを表しているのかは不明のままです2。したがって、トラウマの文脈で関連する血小板機能を研究することは、TICを理解するために重要であり、この分野には革新と改善の余地がかなりあります。
血小板機能の研究に伝統的に使用されてきたプラットフォームには、外傷や外傷誘発性凝固障害5に関連する血小板機能障害を理解するために重要な流体力学や流れは含まれていません。流れに依存する止血のメカニズムには、臨界せん断速度を超える高せん断でのフォン・ヴィレブランド因子(VWF)の伸長、および糖タンパク質1b 6,7,8を介した血小板捕捉が含まれますが、これらは停滞した血小板機能アッセイでは捕捉されません。さらに、血小板は、血流レジームに応じてVWFまたはフィブリノーゲンに優先的に結合し、動脈血栓症と静脈血栓症において異なる役割を引き出します9,10。動脈血栓は主に血小板で構成され、静脈血栓は主に赤血球で構成されており、一部はフローレジームに基づいています11。フローレジームを組み込んだアッセイは、凝固低下や出血表現型から凝固亢進性や血栓性表現型まで、TIC表現型のスペクトルに関連する機能障害の解明に役立ちます。最後に、外傷患者集団の血液量サンプリングの制約により、従来の血小板機能検査が困難になる可能性があります。このような状況では、フローサイトメトリーなどのアッセイを利用することができ、また利用すべきですが、多くの場合、結果はサンプルの物理的特性評価を示しており、止血機能評価ではありません。
外傷では血小板機能障害のメカニズムが完全に理解されていない場合がありますが、P2Y12拮抗薬など、in vitroでの血小板機能障害のモデリングも、治療介入の研究を導くのに役立ちます。止血蘇生法は、全血または血液成分(赤血球、血漿、血小板濃縮物)のいずれかを使用してショック、凝固障害、および内皮損傷に対処するためにバランスの取れたアプローチで血液製剤が輸血される外傷患者にとって非常に重要です12,13,14。外傷患者では、血液製剤の早期使用は生存率の向上と関連しています15,16。貯蔵寿命を延ばすために、冷蔵保存された血小板製品がますます研究されています。冷蔵保存された血小板の検査では、止血活性の増加と、損傷後に輸血した場合の安全性が示されています17,18。
冷蔵保存血小板蘇生法の進化は、外傷に対して利用可能な最も効果的な血小板製品を理解するための追加の検査の必要性を強調しています。しかし、従来の血小板機能アッセイは、機能障害を検出するために過剰または過小に増強されることが多く、治療用血小板輸血を受けている外傷患者と、血小板貯留病変に見られる輸血製品自体の両方で発生します。機能障害の原因を特定することは、現在の血小板機能アッセイの限界(これらのテストのほとんどに静的な性質が含まれている)を考えると、困難な場合があります。したがって、 in vitroで止血蘇生法を研究する場合、レシピエントと製品血小板集団の両方のプラットフォームと検出方法は、最適な治療介入を決定する上で非常に重要です。
マイクロ流体試験は、血小板を研究するための生理学的に適切なアッセイを作成するためのフロープロファイルとバイオフィデリック表面を提供します。マイクロ流体デバイスは、血管穿刺19 または内皮損傷20のような特定の病態生理学または損傷タイプを研究するためにカスタマイズすることができる。これらのデバイスは、一般に、ポリジメチルシロキサン(PDMS)をガラス顕微鏡スライドに結合し、コラーゲンなどの表面改質を施して、内皮下や組織の損傷を模倣することで構成されています。これらのタイプのフローベースのデバイスを利用することで、外傷関連の血小板機能障害の研究を導き、血小板機能障害を改善するための最適な輸血医学アプローチを検討するのに役立ちます。これらの戦略は、負傷した患者における凝集法などの静的血小板アッセイの関連性に関する既存の混乱を明らかにするのに役立つ可能性があります。
すべての研究は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。ピッツバーグ大学ヒト研究保護オフィスからの承認が得られ、健康な人間のボランティアからのインフォームドコンセントが得られました。
1. マイクロ流体デバイスの調製
2.血液サンプルの準備
3. フロー下での血小板機能検査(方法1)
4. 少量サンプル(1mL未満)を用いたフロー下での血小板機能検査(方法2)
5. 除染
6. 画像解析
この方法を使用した後のマイクロ流体実験では、流路の狭窄領域に多血小板血栓が形成されることが示されています(図1)。 図1A は、機能性血小板がチャネルの狭窄領域に血栓を形成してチャネルを通る血流を遮断する代表的な結果を示しています。実験期間中に撮影されたカイネティック画像の平均蛍光強度(MFI)曲線は、成長する血栓における血小板の取り込みの遅延、成長、およびプラトー期を示しています(図2A、C)。P2Y12 アンタゴニストであるチカグレロルの濃度を上げると、血小板 MFI と MFI 曲線の計算下曲線下面積 (AUC) が減少します (図 2B、D)。顕著な血小板機能障害を観察するには、より長いインキュベーション時間(5分に対して30分)が必要であり、5分間のインキュベーションと比較して30分のチカグレロールインキュベーション後の全血インピーダンス凝集法を利用したより顕著な用量反応関係に従っています(補足図S1)。異なる車両条件下では、P2Y12阻害の同様の時間依存性の影響がマイクロ流体モデルで観察されました(補足図S2)。
シミュレートされた止血蘇生法における2つの血小板集団の視覚化は、血栓内に両方の血小板集団が組み込まれていることを示しています(図3A)。両方の血小板集団の対応する蛍光シグナルへの取り込みは、MFI測定を介して実験期間中の速度論的に定量化できます(図3B)。成長期の傾斜が急になり、エンドポイントのMFI測定値が増加すると、血小板機能と止血電位が増加することが示され、これは、P2Y12阻害を介して血液サンプルが血小板機能障害を誘発された場合のレシピエント血小板の定量化、およびその後、新鮮な自家全血を1:10の容量比で混合して蘇生をシミュレートし、明確な血小板蛍光色素で染色することで蘇生に見られます。自家全血混合では、室温保存5日目のアフェレーシス血小板製品と比較して、模擬輸血産物からより多くの血小板が組み込まれ、形成血栓への製品の取り込みが最小限であることが示されました。5日目の室温血小板製品の混合も、新鮮な自家全血との混合と比較して、レシピエント血小板の取り込みが低いことを示しました(図3B)。
図1:マイクロ流体工学を使用した血小板機能検査の表現。 (A)狭窄フローチャンバーから血液を吸引する抜取シリンジポンプなど、少量の血液サンプルを用いた血小板機能検査のためのマイクロ流体実験装置の概略図を示し、リアルタイムでの画像取得を可能にしました。(B)血小板が付着し、活性化し、凝集し、狭窄領域で血栓が成長するコラーゲン被覆表面を含む、狭窄フローチャンバーの側面図が示されています。(C)狭窄性マイクロ流体チャネル(3,500 s-1)および300 s以上で形成された成長血栓に流れているクエン酸血液サンプルのリアルタイム画像キャプチャ。スケールバー = 200 μm (C)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:P2Y12拮抗薬Ticagrelorとのインキュベーション30分後の血小板MFI倍率変化と曲線下面積の減少 (A)P2Y12拮抗薬とのわずか5分間のインキュベーションは、MFI曲線のわずかに延長された遅延フェーズを示し、(B)MFI AUCのわずかな減少を示しています。(C)P2Y12拮抗薬と30分間インキュベートすると、遅延フェーズが延長され、エンドポイントMFI値が低下するだけでなく、(D)MFI AUCを介してより堅牢な機能障害が示されます。個々のデータポイントは生物学的反復を表し、平均±標準偏差が表示されます。略語:MFI =平均蛍光強度。AUC = 曲線下面積HP-β-CD = 2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:レシピエントサンプルで凝固障害性P2Y12阻害と混合された血液製剤、マイクロ流体チャンバー内の患者の血小板機能障害をシミュレート 。(A)アフェレーシス血小板ユニット(血漿、保存7日目)(シアン中のCD41)を1:10の比率で混合し、クエン酸血液と0.8μMチカグレロルで30分間プレインキュベートしました(CD41は赤)。(B)アフェレーシス血小板ユニット(保存日5)または自家新鮮全血(1:10の比率)のいずれかを投与されたレシピエント血液サンプルの代表的な正規化平均蛍光強度曲線と、レシピエントの血小板動態を経時的に。レシピエントのクエン酸血液を0.8 μMチカグレロルと30分間事前にインキュベートしてから、血液製剤と混合しました。(C)共焦点顕微鏡用のカバースリップに接着された改変されたデバイスからの代表的なzスタック画像。アフェレーシス血小板製剤は、フォン・ヴィレブランド因子抗体(1:600)に加えて、血小板減少性血液サンプル(製品:血液)と1:5の容量比で混合しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:画像解析用のMatlabコード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S1:全血インピーダンス凝集法、TicagrelorによるP2Y12阻害の時間依存性。 30分間のインキュベーションは、5分間と比較してより顕著な用量反応関係をもたらします。ビヒクルおよび薬物溶液は 0.1% v/v で利用されました。個々のデータポイントは生物学的反復を表し、平均±標準偏差が表示されます。略語:AUC =曲線下の面積。HP-β-CD = 2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:血小板機能のマイクロ流体モデルにおけるチカグレロルによる時間依存性P2Y12阻害。 個々の健康なドナーからの技術的複製の代表的な MFI 曲線と曲線下面積の値を、薬物溶解性に利用されるエタノールビヒクル (1% v/v) で示しています。略語:MFI =平均蛍光強度。AUC = 曲線下面積。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
上記のプロトコルには、実験の信頼性と再現性を確保するためのいくつかの重要なステップがあります。まず、蛍光抗体を慎重に検討する必要があります。サンプル中の血小板を検出するために使用される抗体は、糖タンパク質Ib(GPIb)血小板受容体の機能を阻害してはなりません。実験間で可能な限りロットマッチングを行うことも、蛍光シグナルの再現性を確保するために重要です。このプロトコルのもう一つの重要なステップは、可能な限り滅菌済みの消耗品と溶液、およびろ過されたサンプルを使用することです。実験の直前に血液サンプルをろ過することで、チャネルの寸法よりも大きな破片や血小板の塊が流れを妨げるのを防ぐことができます。これは、実験間で一貫性を保つためのもう1つの重要なパラメーターです。さらに、血液サンプルは、AABB、米国赤十字社、米国血液センター、および軍用血液プログラムによって準備されたヒトの血液および血液成分の使用に関する情報の回覧に記載されているように、収集から4時間以内に検査する必要があります。
このプロトコルでは、 図3Cに示すように、PDMSを共焦点顕微鏡用のカバースリップに接着するなどの変更を検討することができます。必要に応じて、イメージングの前に、固定溶液をチャネルを介して灌流し、イメージング前にPBSで洗浄して保存することができます。さらに、再現性のあるチャネル寸法は、条件間のせん断速度の保存を確保するための鍵となりますが、狭窄領域の高さは変更できますが、せん断速度が一致していても、血栓形成のタイミングに直接影響します。チャネルの寸法が大きいほど、十分な血栓形成に到達するのに時間がかかるため、より多くのサンプル量が必要になります。このプロトコルのトラブルシューティングを行う際には、コーティング戦略を重要視する必要があります。特定のコラーゲンの種類、タイミング、希釈、および保存条件はすべて、表面コーティングに影響を与える可能性のある要因です。このプロトコルは、この特定のコラーゲン試薬(材料表)に対して検証されていますが、デバイス表面に確実に接着でき、免疫蛍光染色またはその他の手段によって検証された接着が可能なコラーゲンの代替品を検討することができ、以前に他のグループによって成功裏に使用されていました24。
このプロトコルの潜在的な制限は、直接的な内皮反応の欠如です。ただし、コーティング戦略と変更を加えて、内皮損傷に応じた血小板機能試験を含めることができます。例えば、内皮細胞が損傷に応答して分泌する炎症性因子は、このプロトコルのコーティング戦略において変更されるか、または試験された血液サンプルに外因的に追加され得る。細胞化の複雑さなしにこれらの因子を追加することで、内皮症が血小板機能に及ぼす影響を調べるための的を絞ったアプローチが可能になります。同様に、疾患または健康な制御状態からの患者の血漿をシステムにスパイクして、血漿可溶性メディエーターが血小板機能に与える影響を試験できます。
このプロトコルに従った血小板流下での血小板機能の研究は、外傷誘発性凝固障害および外傷における輸血医学アプローチの研究を容易にすることができます。現在の血小板機能検査は、外傷患者の機能不全の反応を見るために、しばしば増強過剰または過少に増強されています。この方法では、治療介入を評価するための血小板機能障害のシミュレーションに加えて、体積に制約がある場合でも、外傷患者サンプルの血小板機能を観察するための柔軟性と設計変更が可能になります。外傷患者以外にも、この方法は、分娩後出血患者、心臓手術患者、または癌患者が血小板の機能と潜在的な治療介入を評価するために検討できます。重要なことに、この方法には、血小板プラグ形成と止血機能のメカニズムにとって非常に重要なフローダイナミクスが組み込まれています。
著者は、宣言する利益相反を持っていません。
著者らは、参加したすべての献血者、およびTrauma and Transfusion Medicine Research Labの瀉血専門医、およびコレクションの支援を提供してくれたUPMCモンテフィオーレ臨床およびトランスレーショナルリサーチセンターに感謝の意を表します。SMS は K25HL161401 でサポートされています。MDN は 1R01HL166944-01A1 でサポートされています。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipments | |||
Axio Observer | Zeiss | 491917-0001-000 | |
Bel-Art Space Saver Vacuum Desiccators | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate Stirrer | Fisher Scientific | FB30786161 | |
Nutating Mixer | Fischer Scientific | 88-861-043 | |
OHAUS Scout Balance Scale | Uline | H-5852 | |
Oven | Fisher Scientific | 15-103-0520 | |
Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G (115V) | |
Syringe Pump (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE) | Harvard Apparatus | 883015 | |
Zen 3.4 | Zeiss | Blue edition | Software |
Material | |||
1/16 inch ID - Barbed Elbow Connectors | Qosina | 11691 | |
10 mL syringe | Fischer Scientific | 14-955-459 | |
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin | Cayman Chemicals | 16169 | 30% Dissolved in Phosphate buffered saline |
40-micron filters | Fischer Scientific | NC1469671 | |
CD41 antibody | Novus Biologicals | NB100-2614 | 1:600 Ratio in Whole Blood |
Chrono-Par Collagen Reagent | Chrono Log Corporation | 385 | 1:5 Ratio in 0.9% Saline |
Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mm | Fisher Scientific | NC0856599 | |
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
Essendant 121oz. Clorox Germicidal Bleach | Fischer Scientific | 50371500 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | 70% |
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed Gas | Supra | 1381978 | |
Human TruStain | Biolegend | 422302 | 1:600 Ratio in Whole Blood |
LevGo smartSpatula Disposable Polypropylene Spatula | Fisher Scientific | 18-001-017 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 10010-023 | |
Safety Scalpel | Fisher Scientific | 22-079-718 | |
Saline | Millipore | 567442 | 0.90% |
Sartorius Polystyrene Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-744 | |
Superslip Cover Slips - Superslip No. 1.5 | Fisher Scientific | 12-541-055 | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9285739 | Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ticagrelor | Cayman Chemicals | 15425 | |
Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft length | McMaster-Carr | 6516T11 | |
Ultra-Machinable 360 Brass Bar | McMaster-Carr | 8954K721 | For master mold fabrication |
Vacutainers | BD | 363083 | |
World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mm | Fisher Scientific | NC1215626 |
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