Mikrofluidik zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion

Die Thrombozytenfunktion unter Fluss kann beurteilt und eine simulierte hämostatische Wiederbelebung mit einem mikrofluidischen Gerät modelliert werden, das in der Trauma- und Transfusionsmedizin Anwendung findet.

Die Mikrofluidik enthält physiologisch relevante Substrate und Strömungen, die das Gefäßsystem nachahmen und daher ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Aspekten der Thrombose und Blutstillung sind. In Umgebungen mit hoher Scherung, die den arteriellen Fluss simulieren, erleichtert ein mikrofluidischer Assay die Untersuchung der Thrombozytenfunktion, da sich plättchenreiche Thromben in einem lokalisierten stenotischen Bereich eines Flusskanals bilden. Die Verwendung von Geräten, die ein kleines Probenvolumen ermöglichen, kann zusätzlich bei der Bewertung der Thrombozytenfunktion unter Fluss aus volumenbegrenzten Patientenproben oder Tiermodellen helfen. Die Untersuchung von Trauma-Patientenproben oder Proben nach einer Blutplättchenprodukttransfusion kann dazu beitragen, therapeutische Strategien für Patientenpopulationen zu entwickeln, bei denen die Thrombozytenfunktion kritisch ist. Auch die Auswirkungen der Thrombozytenhemmung über pharmakologische Wirkstoffe können in diesem Modell untersucht werden. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine mikrofluidische Plattform zu etablieren, die physiologische Strömungen, biologische Oberflächen und relevante hämostatische Mechanismen zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion umfasst, was Auswirkungen auf die Erforschung der traumainduzierten Koagulopathie und der Transfusionsmedizin hat.

Traumata sind eine der weltweit häufigsten Ursachen für Tod und Behinderung. Schwere Verletzungen werden häufig durch eine einzigartige, endogene Störung der Blutstillung und Thrombose erschwert, die als traumainduzierte Koagulopathie (TIC) bezeichnet ^wird1. Blutplättchen spielen eine entscheidende Rolle bei der TIC und es wurde beschrieben, dass sie sowohl adaptive als auch maladaptive Funktionen haben². Die Mechanismen der Thrombozytendysfunktion nach einer Verletzung sind nach wie vor unklar, und es besteht ein dringender Bedarf, die zelluläre Reaktion besser zu verstehen, um die Entwicklung einer verbesserten Wiederbelebung und Therapie zu steuern. Ein weiteres ärgerliches Problem in Bezug auf die Thrombozytenfunktion nach einer Verletzung ist die Unsicherheit der Zuverlässigkeit der vorliegenden Messwerte der Thrombozytenfunktion beim Traumapatienten.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass selbst leicht verletzte Patienten ohne bekannten klinischen Blutungsphänotyp eine abnormale Thrombozytenfunktion aufweisen, wenn konventionelle Thrombozytenfunktionstests wie die Aggregometrie^{verwendet werden 3,4}. Zu den Einschränkungen in der Aggregometrie zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion in einer Verletzungssituation gehören jedoch das Fehlen einer physiologisch relevanten Verletzungsoberfläche, ein reduktionistischer Ansatz zur Agonistenstimulation, die Probenverdünnung mit Vollblutimpedanzaggregometrie, die Plasmatrennung mit optischer Lichttransmissionsaggregometrie und die stagnierende Probenbeurteilung. Darüber hinaus bleibt unklar, ob diese Empfindlichkeit der Thrombozytenfunktion eine echte zelluläre Dysfunktion oder ein Messartefakt, wie z. B. eine erhöhte elektrische Ausgangsimpedanz, im Rahmen einer Verletzung darstellt². Daher ist die Untersuchung relevanter Thrombozytenfunktionen im Kontext von Traumata entscheidend für das Verständnis von TIC, und es gibt in diesem Bereich erheblichen Raum für Innovationen und Verbesserungen.

Plattformen, die traditionell zur Untersuchung der Thrombozytenfunktion verwendet werden, umfassen nicht die Fluiddynamik und -strömung, was für das Verständnis der Thrombozytendysfunktion im Zusammenhang mit Trauma und traumainduzierter Koagulopathie entscheidend sein kann⁵. Zu den Mechanismen der Hämostase, die vom Fluss abhängen, gehören die Elongation des von-Willebrand-Faktors (VWF) bei hoher Scherung, oberhalb einer kritischen Scherrate, und die Thrombozytenaufnahme über das Glykoprotein ^{1b 6,7,8}, die nicht mit stagnierenden Thrombozytenfunktionsassays erfasst werden. Darüber hinaus binden Blutplättchen je nach Flussregime bevorzugt VWF oder Fibrinogen und lösen bei arteriellen und venösen Thrombosen unterschiedliche Rollen aus ^9,10. Arterielle Thromben bestehen hauptsächlich aus Blutplättchen, während venöse Thromben hauptsächlich aus roten Blutkörperchen bestehen, was zum Teil auf Flussregimen beruht¹¹. Assays, die Flussregime einbeziehen, können bei der Aufklärung von Funktionsstörungen im Zusammenhang mit dem Spektrum der TIC-Phänotypen helfen, von Hypokoagulabilität und Blutungsphänotypen bis hin zu Hyperkoagulabilität und thrombotischen Phänotypen. Schließlich können Einschränkungen bei der Blutvolumenentnahme bei Trauma-Patientenpopulationen traditionelle Thrombozytenfunktionstests zu einer Herausforderung machen. Während Assays wie die Durchflusszytometrie unter diesen Umständen verwendet werden können und sollten, zeigen die Ergebnisse oft eine physikalische Charakterisierung einer Probe und keine hämostatische funktionelle Bewertung.

Während die Mechanismen der Thrombozytendysfunktion bei Traumata möglicherweise nicht vollständig verstanden sind, kann die Modellierung der Thrombozytendysfunktion in vitro, z. B. mit P2Y12-Antagonisten, auch bei der Untersuchung therapeutischer Interventionen helfen. Die hämostatische Wiederbelebung ist bei Traumapatienten von entscheidender Bedeutung, bei denen Blutprodukte in einem ausgewogenen Ansatz transfundiert werden, um Schock, Gerinnungsstörungen und Endothelverletzungen entweder mit Vollblut oder Blutbestandteilen (rote Blutkörperchen, Plasma und Thrombozytenkonzentrate) in einem Einheitsverhältnis von 1:1:1^{zu behandeln} 12,13,14. Bei Traumapatienten ist die frühe Einnahme von Blutprodukten mit einem verbesserten Überleben verbunden ^15,16. Um die Haltbarkeit zu verlängern, wurden zunehmend kalt gelagerte Thrombozytenprodukte untersucht. Die Untersuchung von kalt gelagerten Blutplättchen zeigt eine erhöhte hämostatische Aktivität sowie Sicherheit bei der Transfusion nach einer Verletzung^17,18.

Die Entwicklung der kaltgelagerten Thrombozytenreanimation unterstreicht die Notwendigkeit zusätzlicher Tests, um das wirksamste Thrombozytenprodukt zu verstehen, das bei Traumata verfügbar ist. Herkömmliche Thrombozytenfunktionsassays sind jedoch häufig über- oder unterpotenziert, um Funktionsstörungen zu erkennen, die sowohl bei dem Traumapatienten, der eine therapeutische Thrombozytentransfusion erhält, als auch bei dem transfundierten Produkt selbst auftritt, das bei Thrombozytenlagerungsläsionen auftritt. Die Bestimmung des Ursprungs einer Dysfunktion kann angesichts der Einschränkungen bei den derzeitigen Thrombozytenfunktionsassays, einschließlich der statischen Natur der meisten dieser Tests, eine Herausforderung darstellen. Daher sind bei der Untersuchung der hämostatischen Wiederbelebung in vitro die Plattform und die Nachweismethoden sowohl für die Empfänger- als auch für die Produktthrombozytenpopulation von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung optimaler therapeutischer Interventionen.

Die mikrofluidische Untersuchung bietet Strömungsprofile und biofidele Oberflächen, um einen physiologisch relevanten Assay für die Untersuchung von Blutplättchen zu erstellen. Mikrofluidische Geräte können angepasst werden, um bestimmte Pathophysiologien oder Verletzungsarten zu untersuchen, wie z. B. Gefäßpunktion¹⁹ oder Endothelschädigung²⁰. Diese Geräte bestehen im Allgemeinen aus Polydimethylsiloxan (PDMS), das mit Oberflächenmodifikationen wie Kollagen an einen Glasobjektträger gebunden ist, um Subendothel- und Gewebeverletzungen nachzuahmen. Die Verwendung dieser Art von flussbasierten Geräten kann bei der Erforschung traumabedingter Thrombozytendysfunktion hilfreich sein und bei der Untersuchung optimaler transfusionsmedizinischer Ansätze zur Verbesserung der Thrombozytendysfunktion helfen. Diese Strategien können dazu beitragen, die bestehende Verwirrung über die Relevanz statischer Thrombozytenassays wie der Aggregometrie beim verletzten Patienten zu klären.

Alle Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt. Es wurde die Genehmigung des Human Research Protection Office der University of Pittsburgh eingeholt und die Einverständniserklärung gesunder menschlicher Freiwilliger eingeholt.

1. Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts

1. Um den PDMS-Teil des Geräts herzustellen, bereiten Sie eine Urform aus Messing durch CNC-Mikrobearbeitung (Computer Numerical Control) vor.
   HINWEIS: Abhängig von den Kanalabmessungen können Fotolithographietechniken verwendet werden, um eine Urform zu erstellen. Die in diesem Protokoll verwendete Vorrichtung umfasst acht parallele mikromaschinell bearbeitete Kanäle mit einer Breite von etwa 480 μm, einer Höhe von 140 μm am Einlass und Auslass der Vorrichtung und einer Höhe von 40 μm an der Stenose der Vorrichtung, mit einer Rampenlänge zum/vom stenotischen Bereich von etwa 0,3 mm. Die Kanallängen betragen ca. 6 mm.
2. Gießen Sie mit einer erhaltenen Urform die Silikonelastomerbasis (aus dem Elastomer-Kit) in eine Wiegeschale. Fügen Sie das Silikonhärtungsmittel (aus dem Elastomer-Kit) hinzu, das die Vernetzung der Silikonpolymerketten erleichtert, um das flüssige PDMS in einen haltbaren und flexiblen Feststoff im Verhältnis 10:1 (Basismittel) umzuwandeln, und rühren Sie die Mischung gut um.
3. Lege die Form in eine Petrischale und gieße das nicht ausgehärtete PDMS auf die Form. Stellen Sie die Petrischale für 30 Minuten in einen Vakuumexsikkator, um Blasen zu entfernen.
4. Beenden Sie die Aushärtung des PDMS in der Urform, indem Sie es für 90 min in einen auf 70 °C eingestellten Ofen stellen.
5. Schneiden Sie nach vollständiger PDMS-Aushärtung den mikrofluidischen Abdruck mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell aus. Stanzen Sie Löcher an den Rändern der Kanäle (1,5 mm Durchmesser auf beiden Seiten).
6. Reinigen Sie mit Laborklebeband die Oberfläche eines Objektträgers und die geätzte Seite des mikrofluidischen Abgusses. Verwenden Sie bei Bedarf Druckluft, um verbleibende Ablagerungen zu entfernen.
7. Legen Sie den Objektträger und den mikrofluidischen Abguss mit der geätzten Seite nach oben in einen Plasmareiniger. Starten Sie die Vakuumpumpe, verschließen Sie die Kammer und schalten Sie den Plasmareiniger auf die hohe Stufe ein. Lassen Sie den Objektträger und das PDMS 30 s lang im Plasmareiniger, schalten Sie dann den Plasmareiniger aus und entfernen Sie den Staubsauger.
8. Binden Sie den plasmagereinigten Guss und den Glasobjektträger zusammen, indem Sie die Seiten, die im Plasmareiniger nach oben lagen, vorsichtig zusammendrücken. Stellen Sie dann das mikrofluidische Gerät für 10 Minuten bei 70 °C in einen Ofen/eine Kochplatte.
   HINWEIS: Üben Sie nicht zu viel Druck aus, wenn Sie den Guss und den Glasobjektträger miteinander verbinden, da dies zu einem Verlust der Kanalmorphologie führen kann.
9. Spülen Sie jede Kammer mit 10-30 μl 70%igem Ethanol, um es zu sterilisieren und das mikrofluidische Gerät auf einer 70 °C heißen Platte trocknen zu lassen.
   HINWEIS: Geräte sollten mindestens 24 Stunden im Voraus hergestellt werden, können aber auch Wochen bis Monate im Voraus hergestellt werden. Die Geräte sollten in einem luftdichten Behälter oder einer abgedeckten Petrischale bei Raumtemperatur gelagert werden.
10. Spülen Sie am Tag vor dem Experimentieren mit dem mikrofluidischen Gerät jede Kammer erneut mit 10-30 μl 70%igem Ethanol, um es zu sterilisieren und das mikrofluidische Gerät auf einer 70 °C-Heizplatte trocknen zu lassen.
11. Die Kammer wird mit einem Typ 1 Fibrillärkollagenreagenz (1 mg/ml) bestrichen, das in 0,9 % NaCl in einem volumetrischen Verhältnis von 1:5 durch einen dafür vorgesehenen Auslass zum vorgesehenen Einlass verdünnt wird. Stellen Sie sicher, dass die Richtungsabhängigkeit innerhalb eines Experiments beibehalten wird. Lagern Sie das Gerät in einem warmen, feuchten, geschlossenen Behälter, um eine Verdunstung des beschichteten Kollagens im Kanal zu verhindern.
12. Nach 1 h mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) spülen, um die Kollagenlösung auszuspülen. Bündig in die entgegengesetzte Richtung der Beschichtung. Bewahren Sie das Gerät bei Nichtgebrauch wieder in einem warmen, feuchten, geschlossenen Behälter auf.

2. Vorbereitung der Blutprobe

1. Entnehmen Sie eine Citrat-Vollblutprobe durch Venenpunktion. Inkubieren Sie citriertes Vollblut mit einer FC-Rezeptor-Blockierungslösung (1:600).
   HINWEIS: Blutproben werden vor und während des Experiments bei Raumtemperatur gelagert.
2. Inkubieren Sie citriertes Vollblut mit fluoreszenzkonjugiertem (unter Verwendung eines Fluorophors Ihrer Wahl) CD41-Antikörper (1:600). 30 min lang auf eine Nutenwippe auftragen.
3. Als Positivkontrolle für die Thrombozytenhemmung fügen Sie Ticagrelor hinzu, einen P2Y12-Rezeptorantagonisten, der in einer Lösung von 30 % w/v 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) in PBS rekonstituiert wird.
   HINWEIS: Ticagrelor-Bestände bis zu 6,4 mM sollten hergestellt werden und eine weitere Verdünnung der Ticagrelor-Bestände in HP-β-CD-Lösung (30 % HP-β-CD gelöst in PBS) kann vor dem Versuch erfolgen (empfohlen werden 1.000-fache Stammkonzentrationen).
4. Inkubieren Sie die citrierte Probe 30 Minuten lang mit Ticagrelor (Endkonzentration bis zu 6,4 μM), um die Thrombozytenhemmung zu beobachten.
5. Wenn Sie das Blutprodukt mit der Citratprobe mischen, färben Sie das Blutprodukt mit einer FC-Rezeptorblockierungslösung (1:600) und einem fluoreszenzkonjugierten (unter Verwendung eines separaten und von der Citratprobe getrennten Fluorophors) CD41-Antikörpers (1:600).
   1. Mischen Sie ein volumetrisches Äquivalent der transfundierten Produkteinheiten mit der Citratprobe. Um beispielsweise 2 Einheiten von Thrombozytenprodukten zu simulieren, die in eine blutende Person transfundiert werden (ca. 250 ml pro Produkt in einem Gesamtblutvolumen von 5.000 ml), mischen Sie 100 μl Blutprodukt in 1.000 μl Citratblutprobe.
6. Unmittelbar vor dem Experimentieren filtrieren Sie die Blutprobe durch einen 40-μm-Filter in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.

3. Prüfung der Thrombozytenfunktion unter Durchfluss (Methode 1)

1. Schalten Sie das Mikroskop und die zugehörige Software ein.
2. Stellen Sie die Pumpe einer Entnahmespritze auf eine Höhe mit dem Tisch des Mikroskops ein. Passen Sie die Einstellungen an der Spritzenpumpe an.
   1. Berechnen Sie einen volumetrischen Durchfluss (Q) für eine gewünschte durchschnittliche Wandscherrate (γ) von 3.500 ^s-1 im stenotischen Bereich des Kanals unter Verwendung der Gleichungen (1) und (2)²¹.
      (1)
      (2)
      Dabei ist A die Querschnittsfläche des Kanals, P der benetzte Umfang, λ der Formfaktor, b die kurze Seite des Rechtecks (Höhe) und a die lange Seite des Rechtecks (Breite).
      HINWEIS: Der Wert von 3.500 ^s-1 wurde aufgrund der kritischen VWF-Scherung gewählt und liegt im arteriellen Regime ^7,22,23.
3. Platzieren Sie das mikrofluidische Gerät auf dem Mikroskoptisch. Kleben Sie die Kanten des mikrofluidischen Geräts an den Tisch, um Bewegungen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass der Auslass zur Rückseite des Mikroskops zeigt.
4. Verbinden Sie ein Ende des 1/16" ID-Schlauchs (ca. 30 cm lang) mit einem Winkelanschluss und das andere Ende mit einer 10 mL Spritze mit 1/16" ID Anschluss.
5. Füllen Sie die Spritze mit sterilem PBS und schließen Sie sie an die Spritzenpumpe an.
6. Stecken Sie den Winkelstecker in die Gerätesteckdose.
7. Bereiten Sie ca. 10 cm lange Einlaufleitungen vor, mit dem Winkelverbinder an einem Ende und dem abgewinkelten Schnitt am anderen Ende.
8. Verbinden Sie den Einlass-Winkelstecker mit dem Geräteeinlass.
9. Positionieren Sie die Einlaufleitung in einem Abfall-Mikrozentrifugenröhrchen auf einem abgewinkelten Halter.
10. Verwenden Sie das 10-fach-Objektiv für Kanalabmessungen mit einer Breite von ca. 500 μm und fokussieren Sie sich auf die Kanalkanten des mikrofluidischen Geräts.
11. Grundieren Sie die Leitungen mit PBS und befreien Sie den Kanal von PDMS/Schmutz, indem Sie die Spritzenpumpe manuell vorschieben. Achten Sie darauf, in der Nähe des Kanaleinlasses und -auslasses zu prüfen.
12. Öffnen Sie die gespeicherten Bildaufnahmeeinstellungen oder erstellen Sie ein Bildaufnahmeverfahren für Zeitreihenbilder, die alle 1–2 s mit einem Hellfeldkanal und Fluoreszenzkanälen aufgenommen werden, die den in der Blutprobe verwendeten fluoreszierenden CD41-Antikörpern entsprechen.
13. Entnehmen Sie die gefilterte Citratblutprobe und mischen Sie sie, indem Sie sie kurz vor dem Experiment auf und ab pipettieren. Legen Sie die Probe auf den abgewinkelten Mikrozentrifugenhalter.
14. Positionieren Sie die Einlassleitung in der Probe.
15. Starten Sie die Aufnahme der Bildaufnahme.
16. Ziehen Sie die Spritze langsam heraus, um das Totvolumen im Schlauch zu füllen. Sobald das Blut den Kanal erreicht, drücken Sie sofort auf Play an der Spritzenpumpe, um den Fluss mit der gewünschten Schergeschwindigkeit fortzusetzen.
17. Passen Sie den Fokus bei Bedarf an.
18. Führen Sie das Experiment so lange durch, bis die Blutplättchen den stenotischen Bereich des mikrofluidischen Geräts vollständig verschlossen haben oder bis zu einem experimentellen Endpunkt (d. h. 10 Minuten).
19. Stellen Sie sicher, dass der Einlassschlauch für die Dauer des Experiments in die Blutprobe eingetaucht ist.
20. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, stoppen Sie die Bilderfassung und stoppen Sie die Spritzenpumpe. Speichern Sie die Bildaufnahme.
21. Entfernen Sie den Einlasswinkelverbinder und entleeren Sie den Inhalt des Schlauchs in einen konischen Ablauf. Entleeren Sie den Inhalt der Spritze und der Auslassleitungen ebenfalls in den konischen Abfall.
22. Ersetzen Sie die Einlass- und Auslassanschlüsse sowie die Schläuche bei Bedarf für nachfolgende Proben.

4. Prüfung der Thrombozytenfunktion im Fluss mit Proben mit geringem Volumen (unter 1 ml) (Methode 2)

1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1 bis 1.4 wie oben.
2. Stanzen Sie an den Rändern der Kanäle einen Auslass mit einem Durchmesser von 1,5 mm und einen Einlass mit einem Durchmesser von 3 mm.
3. Wiederholen Sie die Schritte 1.6 bis 3.6 wie oben.
4. Verwenden Sie das 10-fach-Objektiv für Kanalabmessungen mit einer Breite von ca. 500 μm und fokussieren Sie sich auf die Kanalkanten des mikrofluidischen Geräts.
5. Befreien Sie den Kanal von PDMS/Schmutz, indem Sie die Spritzenpumpe manuell vorschieben und die Zugangsflüssigkeit mit einem Labortuch ableiten. Entfernen Sie alle Rückstände mit Laborklebeband auf der Oberseite des mikrofluidischen Geräts.
6. Schieben Sie die Pumpe manuell vor, um den 3-mm-Einlassbehälter mit PBS zu füllen.
7. Öffnen Sie die gespeicherten Bildaufnahmeeinstellungen oder erstellen Sie ein Bildaufnahmeverfahren für Zeitreihenbilder, die alle 1–2 s mit einem Hellfeldkanal und Fluoreszenzkanälen aufgenommen werden, die den in der Blutprobe verwendeten fluoreszierenden CD41-Antikörpern entsprechen.
8. Starten Sie die Entnahme an der Spritzenpumpe (manuell oder mit eingestellter Drehzahl) und unterbrechen Sie die Entnahme an der Pumpe, sobald PBS in den Kanal vordringt und die Füllleitung im Behälter abnimmt.
9. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit einer Pipette aus dem Reservoir.
10. Starten Sie die Bildaufnahme.
11. Pipettieren Sie die Blutprobe in das Reservoir (ca. 40 μl) und starten Sie sofort die Entnahmespritze. Stellen Sie sicher, dass der Ablauf gestartet wird.
    HINWEIS: Wenn der Motor der Spritzenpumpe für die Entnahme in Schritt 4.8 nicht vorbereitet wurde, beginnt der Durchfluss nicht sofort und der Versuch sollte wiederholt werden.
12. Füllen Sie das Blutreservoir für die Dauer des Experiments wieder auf und stellen Sie sicher, dass keine Lufteinschlüsse in den Kanal gelangen.
13. Führen Sie das Experiment so lange durch, bis die Blutplättchen den stenotischen Bereich des mikrofluidischen Geräts vollständig verschlossen haben oder bis zu einem experimentellen Endpunkt (d. h. 10 Minuten).
14. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, stoppen Sie die Bildaufnahme und stoppen Sie die Spritzenpumpe. Speichern Sie die Bildaufnahme.
15. Entfernen Sie überschüssiges Blut aus dem Reservoir durch Pipettieren. Entleeren Sie den Inhalt des Entnahmeschlauchs in ein konisches Abfallrohr.
16. Ersetzen Sie die Anschlüsse und Schläuche bei Bedarf für nachfolgende Proben.

5. Dekontamination

1. Befreien Sie die Ein- und Auslassleitungen von Blut, indem Sie es in eine 10%ige Bleichlösung spülen.
2. Wenn alle Kanäle des mikrofluidischen Geräts verwendet wurden, entsorgen Sie das Gerät im Behälter für biogefährliche Abfälle von Sharps.
   HINWEIS: Alle biologischen Abfälle sollten ordnungsgemäß in biologisch gefährlichen Abfällen entsorgt werden.

6. Bildanalyse

1. Exportieren Sie die Bilder aus kinetischen Experimenten mit Hilfe der Software, indem Sie auf Datei | Exportieren/Importieren | Exportieren.
2. Wählen Sie die folgenden Parameter aus: Dateityp: Tagged Image File Format (TIFF); Kompression: LZW; Aktivieren Sie Originaldaten und Pixel verschieben. Deaktivieren Sie die Option Anzeigekurve und Kanalfarbe anwenden. Aktivieren Sie die Option Teilmenge definieren (Bereich, Rechteckbereich) und wählen Sie den Kanalbereich aus, bei dem die Breiten- und Höhenmessung zwischen den Bedingungen beibehalten wird. Exportieren Sie in den gewünschten Ordner und aktivieren Sie Ordner erstellen.
3. Beachten Sie die folgenden experimentellen Werte in der Software: Starten Sie den Rahmen , wenn Blut in den Kanal eintritt; Bildrate (Info, Zeitreihe).
4. Messen Sie die normierte mittlere Fluoreszenzintensität jedes Frames in einem Experiment unter Verwendung des Matlab-Codes, der als ergänzende Datei 1 bereitgestellt wird, und ändern Sie die folgenden Eingaben für jedes Experiment: Start-Frame/End-Frame basierend auf der Experimentlänge (stellen Sie sicher, dass die Experimentlänge zwischen den Bedingungen erhalten bleibt); Name des Experiments/Ordnername; Zuschneiden der Parameter X, Y, H und W. Führen Sie den Code einmal für den Thrombozyten-Fluoreszenzkanal des Empfängers und einmal für den Thrombozyten-Fluoreszenzkanal des Produkts aus. Melden Sie normalisierte MFI- (Spalte 2) und normalisierte AUC-Werte (normalisiert auf Start-Frame). Subtrahieren Sie den Wert für die Experimentlänge vom normalisierten AUC-Wert.

Mikrofluidische Experimente, die auf diese Methode folgen, sollten eine thrombozytenreiche Thrombenbildung im Bereich der Stenose des Strömungskanals zeigen (Abbildung 1). Abbildung 1A zeigt repräsentative Ergebnisse, bei denen funktionelle Blutplättchen einen Thrombus im stenotischen Bereich des Kanals bildeten, um den Blutfluss durch den Kanal zu blockieren. Mittlere Fluoreszenzintensitätskurven (MFI) von kinetischen Bildern, die während der Dauer des Experiments aufgenommen wurden, veranschaulichen eine Verzögerungs-, Wachstums- und Plateauphase des Thrombozyteneinbaus in den wachsenden Thrombus (Abbildung 2A, C). Eine Erhöhung der Konzentrationen eines P2Y12-Antagonisten, Ticagrelor, verringert die Thrombozyten-MFI sowie die berechnete Fläche unter der Kurve (AUC) der MFI-Kurven (Abbildung 2B,D). Längere Inkubationszeiten sind erforderlich (30 min im Vergleich zu 5 min), um eine ausgeprägte Thrombozytendysfunktion zu beobachten, in Übereinstimmung mit einer ausgeprägteren Dosis-Wirkungs-Beziehung unter Verwendung der Vollblutimpedanzaggregometrie nach einer 30-minütigen Ticagrelor-Inkubation im Vergleich zu einer 5-minütigen Inkubation (Ergänzende Abbildung S1). Unter unterschiedlichen Fahrzeugbedingungen wurden ähnliche zeitabhängige Effekte der P2Y12-Hemmung im mikrofluidischen Modell beobachtet (Ergänzende Abbildung S2).

Die Visualisierung von zwei Thrombozytenpopulationen in der simulierten hämostatischen Wiederbelebungsmethode veranschaulicht den Einbau beider Thrombozytenpopulationen in den Thrombus (Abbildung 3A). Der Einbau beider Thrombozytenpopulationen in ihr entsprechendes Fluoreszenzsignal kann über die Dauer des Experiments über MFI-Messungen kinetisch quantifiziert werden (Abbildung 3B). Steilere Steigungen in der Wachstumsphase sowie erhöhte Endpunkt-MFI-Messungen zeigen eine erhöhte Thrombozytenfunktionalität und ein erhöhtes hämostatisches Potenzial, was sich in der Quantifizierung der Empfängerthrombozyten zeigt, wenn die Blutprobe mit Thrombozytendysfunktion über P2Y12-Hemmung induziert wurde und dann die Wiederbelebung durch Mischen von frischem autologen Vollblut in einem volumetrischen Verhältnis von 1:10 simuliert wurde, das mit einem ausgeprägten Thrombozytenfluorophor gefärbt wurde. Bei der autologen Vollblutmischung wurden mehr Blutplättchen aus dem simulierten transfundierten Produkt eingebaut als bei einem Apherese-Thrombozytenprodukt bei Raumtemperatur am 5. Lagertag, das einen minimalen Produkteinbau in den sich bildenden Thrombus zeigte. Das Mischen des Thrombozytenprodukts bei Raumtemperatur an Tag 5 zeigte im Vergleich zum Mischen mit frischem autologen Vollblut auch einen geringeren Thrombozyteneinbau des Empfängers (Abbildung 3B).

Abbildung 1: Darstellung der Thrombozytenfunktionsprüfung mittels Mikrofluidik. (A) Es wird ein schematischer mikrofluidischer Versuchsaufbau für die Thrombozytenfunktionsprüfung mit Blutproben mit geringem Volumen gezeigt, einschließlich einer Entnahmespritzenpumpe, die Blut durch eine stenotische Flusskammer zieht, was eine Bildaufnahme in Echtzeit ermöglicht. (B) Es wird eine Seitenansicht einer stenotischen Strömungskammer gezeigt, einschließlich einer kollagenbeschichteten Oberfläche, auf der Blutplättchen anhaften, aktivieren und aggregieren, was zu einem wachsenden Thrombus an der stenotischen Region führt. (C) Echtzeit-Bilderfassung einer Citratblutprobe unter Fluss in einem stenotischen mikrofluidischen Kanal (3.500 ^s-1) und eines wachsenden Thrombus, der sich über 300 s gebildet hat. Maßstabsleisten = 200 μm (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Reduzierte Veränderungen der Thrombozyten-MFI-Faltung und Fläche unter der Kurve nach 30 min Inkubation mit dem P2Y12-Antagonisten Ticagrelor. (A) Die Inkubation mit dem P2Y12-Antagonisten für nur 5 min zeigt leicht verlängerte Verzögerungsphasen der MFI-Kurven und (B) eine leichte Abnahme der MFI-AUC. (C) Eine 30-minütige Inkubation mit dem P2Y12-Antagonisten führt zu verlängerten Verzögerungsphasen und reduzierten Endpunkt-MFI-Werten sowie (D) zu einer robusteren Dysfunktion, die über MFI AUC nachgewiesen wird. Einzelne Datenpunkte stellen biologische Replikate dar und es wird eine mittlere ± Standardabweichung angezeigt. Abkürzungen: MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; AUC = Fläche unter der Kurve; HP-β-CD = 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Mischen von Blutprodukten mit koagulopathischer P2Y12-Hemmung in der Empfängerprobe, die eine Thrombozytendysfunktion des Patienten simuliert, in der mikrofluidischen Kammer. (A) Apherese-Thrombozyteneinheit (Plasma, Lagertag 7) (CD41 in Cyan) gemischt im Verhältnis 1:10 mit Citratblut, das 30 min lang mit 0,8 μM Ticagrelor vorinkubiert wurde (CD41 in rot). (B) Repräsentative normierte mittlere Fluoreszenzintensitätskurven der Empfängerblutprobe, die entweder eine Apherese-Thrombozyteneinheit (Lagertag 5) oder autologes frisches Vollblut (Verhältnis 1:10) erhält, zusammen mit der Thrombozytenkinetik des Empfängers im Laufe der Zeit. Das Citratblut des Empfängers wurde 30 Minuten lang mit 0,8 μM Ticagrelor vorinkubiert, bevor es mit Blutprodukten gemischt wurde. (C) Repräsentatives Z-Stapel-Bild eines modifizierten Geräts, das mit einem Deckglas für die konfokale Mikroskopie verbunden ist. Das Apherese-Thrombozytenprodukt wurde mit einer thrombozytopenischen Blutprobe im volumetrischen Verhältnis von 1:5 (Produkt:Blut) zusätzlich zu einem von-Willebrand-Faktor-Antikörper (1:600) gemischt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Matlab-Code für die Bildanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Zeitabhängigkeit der P2Y12-Hemmung der Vollblutimpedanzaggremetrie mit Ticagrelor. Eine Inkubation von 30 Minuten führt zu einer ausgeprägteren Dosis-Wirkungs-Beziehung im Vergleich zu 5 Minuten. Vehikel- und Arzneimittellösungen wurden mit 0,1 % vol verwendet. Einzelne Datenpunkte stellen biologische Replikate dar und es wird eine mittlere ± Standardabweichung angezeigt. Abkürzungen: AUC = Fläche unter der Kurve; HP-β-CD = 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Zeitabhängige P2Y12-Hemmung mit Ticagrelor in einem mikrofluidischen Modell der Thrombozytenfunktion. Repräsentative MFI-Kurven und Flächenwerte unter der Kurve für technische Replikate eines einzelnen gesunden Spenders sind mit Ethanolvehikel (1 % v/v) dargestellt, das für die Löslichkeit des Arzneimittels verwendet wird. Abkürzungen: MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; AUC = Fläche unter der Kurve. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Das obige Protokoll umfasst einige kritische Schritte, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Experimenten zu gewährleisten. Zunächst sollten fluoreszierende Antikörper sorgfältig in Betracht gezogen werden. Die Antikörper, die zum Nachweis von Blutplättchen in der Probe verwendet werden, sollten die Funktion des Glykoprotein-Ib (GPIb)-Thrombozytenrezeptors nicht blockieren. Der Chargenabgleich, wann immer dies zwischen den Experimenten möglich ist, ist ebenfalls entscheidend, um die Reproduzierbarkeit des Fluoreszenzsignals sicherzustellen. Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Verwendung von sterilen Verbrauchsmaterialien und -lösungen sowie gefilterten Proben, wann immer dies möglich ist. Das Filtern von Blutproben unmittelbar vor dem Experiment verhindert, dass Schmutz oder Blutplättchenklumpen, die größer als die Kanalabmessungen sind, den Fluss blockieren, was ein weiterer kritischer Parameter ist, der zwischen den Experimenten konsistent gehalten werden muss. Darüber hinaus sollten Blutproben innerhalb von 4 Stunden nach der Entnahme getestet werden, wie in dem Rundschreiben mit Informationen für die Verwendung von menschlichem Blut und Blutbestandteilen beschrieben, das von AABB, dem Amerikanischen Roten Kreuz, den amerikanischen Blutzentren und dem Armed Services Blood Program erstellt wurde, es sei denn, es wird die Lagerung von Blutprodukten getestet.

In diesem Protokoll können Modifikationen in Betracht gezogen werden, wie z. B. das Verkleben des PDMS mit einem Deckglas für die konfokale Mikroskopie, wie in Abbildung 3C dargestellt. Falls erforderlich, kann vor der Bildgebung eine Fixierlösung durch die Kanäle perfundiert und zur Lagerung vor der Bildgebung mit PBS gewaschen werden. Während reproduzierbare Kanalabmessungen der Schlüssel zur Gewährleistung konservierter Scherraten zwischen den Bedingungen sind, kann die Höhe des stenotischen Bereichs geändert werden, wirkt sich jedoch direkt auf den Zeitpunkt der Thrombusbildung aus, selbst wenn die Scherraten übereinstimmen. Da größere Kanalabmessungen mehr Zeit benötigen, um eine signifikante Thrombusbildung zu erreichen, ist ein größeres Probenvolumen erforderlich. Bei der Fehlerbehebung dieses Protokolls sollte die Beschichtungsstrategie eine wichtige Überlegung sein. Spezifischer Kollagentyp, Zeitpunkt, Verdünnung und Lagerbedingungen sind Faktoren, die die Oberflächenbeschichtung beeinflussen können. Während dieses Protokoll für dieses spezielle Kollagenreagenz validiert wurde (Table of Materials), können Kollagenalternativen, die zuverlässig an der Geräteoberfläche haften können und die Adhäsion durch Immunfluoreszenzfärbung oder andere Maßnahmen validiert wurden, in Betracht gezogen werden und wurden zuvor von anderen Gruppen erfolgreich eingesetzt²⁴.

Eine mögliche Einschränkung dieses Protokolls ist das Fehlen einer direkten endothelialen Antwort. Es können jedoch Beschichtungsstrategien und Modifikationen vorgenommen werden, um Thrombozytenfunktionstests als Reaktion auf Endothelschäden einzubeziehen. Zum Beispiel könnten Entzündungsfaktoren, die Endothelzellen als Reaktion auf eine Verletzung absondern, in der Beschichtungsstrategie dieses Protokolls modifiziert oder exogen zu der getesteten Blutprobe hinzugefügt werden. Die Hinzufügung dieser Faktoren ohne die Komplexität der Zellularisierung würde einen gezielten Ansatz zur Untersuchung der Auswirkungen der Endotheliopathie auf die Thrombozytenfunktion ermöglichen. In ähnlicher Weise kann Patientenplasma aus Krankheits- oder gesunden Kontrollzuständen in das System eingespeist werden, um den Einfluss von plasmalöslichen Mediatoren auf die Thrombozytenfunktion zu testen.

Die Untersuchung der Thrombozytenfunktion unter Fluss nach diesem Protokoll kann die Untersuchung der traumainduzierten Koagulopathie und der transfusionsmedizinischen Ansätze bei Traumata erleichtern. Aktuelle Thrombozytenfunktionstests sind oft über- oder unterpotenziert, um eine dysfunktionale Reaktion bei einem Traumapatienten zu sehen. Diese Methode ermöglicht Flexibilität und Designmodifikationen, um die Thrombozytenfunktion in Proben von Traumapatienten auch bei Volumenbeschränkungen zu beobachten, zusätzlich zur Simulation der Thrombozytendysfunktion zur Beurteilung therapeutischer Interventionen. Über den Traumapatienten hinaus könnte diese Methode für Patienten mit postpartalen Blutungen, Herzoperationen oder Krebspatienten in Betracht gezogen werden, um die Thrombozytenfunktionalität und mögliche therapeutische Interventionen zu beurteilen. Wichtig ist, dass diese Methode die Strömungsdynamik berücksichtigt, die für die Mechanismen der Bildung von Thrombozytenpfropfen und der hämostatischen Funktion von entscheidender Bedeutung ist.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Die Autoren danken allen Blutspendern, die teilgenommen haben, sowie den Phlebotomisten des Trauma and Transfusion Medicine Research Lab und dem UPMC Montefiore Clinical and Translational Research Center für die Unterstützung bei der Sammlung. SMS wird von K25HL161401 unterstützt. MDN wird unterstützt von 1R01HL166944-01A1.