Method Article
Производство специализированных клеток сетчатки от плюрипотентных стволовых клеток является поворотным моментом в развитии на основе стволовых клеток лечение заболеваний сетчатки. В настоящем документе описывается простой метод для эффективного поколения сетчатки organoids и пигментированной эпителия сетчатки для основных, поступательные и клинических исследований.
Производство специализированных клеток от плюрипотентных стволовых клеток предоставляет мощный инструмент для разработки новых подходов для регенеративной медицины. Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) является особенно привлекательным для нейродегенеративные болезни исследований, в том числе дистрофий сетчатки, где iPSC производные сетчатки клетки модели Марк крупный шаг вперед для понимания и бороться слепоты. В этой статье мы опишем простой и масштабируемый протокол для создания, Зрелые и криоконсервировать сетчатки organoids. На основании среднего изменения, основным преимуществом этого метода является избежание несколько и времени шаги обычно требуются в управляемое дифференциации iPSCs. Подражая на ранних этапах развития сетчатки последовательных изменений определенных СМИ на адэрентных человека iPSC культур, этот протокол позволяет одновременное поколения самостоятельного формирования структур neuroretinal и сетчатки пигментные клетки эпителия (ПЭС) в воспроизводимость и эффективным образом в 4 недели. Эти структуры, содержащие сетчатки прогениторных клеток (RPC) может быть легко изолированы для дальнейшего созревания в состоянии плавающей культуры, обеспечивая дифференцирование RPC в семи типы клеток сетчатки, присутствующих в взрослого человека сетчатки. Кроме того мы описываем, быстрые методы криоконсервирования сетчатки organoids и ПЭС клетки для длительного хранения. Сложенные вместе, методы, описанные здесь будет полезным для производства и банк человека iPSC производные сетчатки клетки или ткани для фундаментальных и клинических исследований.
Сетчатка является неотъемлемой частью центральной нервной системы (ЦНС) и имеет ограниченные возможности для самопроизвольно восстанавливаться после травмы или заболеваний. Таким образом дегенеративных патологий, вызывая потери окончательного клеток сетчатки, например возрастной макулярной дегенерации (AMD) и пигментный ретинит (RP), глаукома, диабетическая ретинопатия, обычно приводит к необратимой слепоте. Спасая выродились сетчатки является одной из основных задач, для которых на основе стволовых клеток лечение, направленный для замены поврежденного или утраченного клетки являются одним из наиболее перспективных подходов1,2,3. Плюрипотентных стволовых клеток как клетки человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) имеют способность расширяться бесконечно в культуре, и они имеют потенциал для производства любых типов клеток. Достижения в наше понимание сетчатки развития и совершенствования в vitro протоколы для человека iPSC дифференциация привели к поколения сетчатки organoids7,8,9, 10,,1112. Все крупные сетчатки клеток, включая клетки сетчатки ганглии (РГК) и фоторецепторов сетчатки пигментные клетки эпителия (ПЭС) были успешно дифференцированы от человеческих ЭСК и iPSCs4,5, 6. основанный на SFEB (сыворотка свободной культуры embryoid тела, как агрегатов) метод, разработанный Eiraku и др. 13, самостоятельное формирование сетчатки organoids могут быть получены ESC или iPSC, полученных embryoid тела, как агрегатов в определенных внеклеточный матрикс компонентов7,10,14. Но эти протоколы являются сложные, требующие большое количество шагов, не всегда совместимы с большим производства клеток для терапевтических подходов или наркотиков скрининг. Таким образом выбор метода для получения человеческих клеток сетчатки имеет решающее значение и метод должен быть надежным, масштабируемым и эффективным.
Здесь основываясь на нашей предыдущей публикации15, опишем каждый шаг для простой и эффективной поколения клетки сетчатки через сетчатки органоид самостоятельного формирования от адэрентных человеческого iPSCs, культивируемый в фидер свободных и без Зенона состояние. Начиная от рутинных культур адэрентных человеческого iPSCs, этот протокол требует лишь простой последовательных среднего разрешена поколения клетки iPS производные ПЭС (hiRPE) и neuroretinal структур в течение 4 недель. После ручной изоляции hiRPE может быть расширена и сетчатки структуры можно культивировали как плавающие organoids где клетки сетчатки прародитель способны дифференцироваться в все типы клеток сетчатки в последовательном порядке в соответствии с человека в естественных условиях retinogenesis. Наконец для исследований или клинический перевод, мы описываем криоконсервирования метод, позволяющий длительного хранения всей сетчатки organoids и hiRPE клеток не затрагивая их фенотипические характеристики и функциональность.
Протокол, описанные в настоящем документе соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований Institut de la Vision. Institut de la видение позволило манипуляции человека образца согласно текущей французский. Образец обработки следует защиты данных пациента в соответствии с принципами Хельсинки и национальных правил после этические утверждения «Comité de защиты des Personnes (CPP) Иль-де-V».
1. Подготовка культуры средств массовой информации и блюда
2. поддержание и расширение прав человека iPSCs
3. поколение сетчатки Organoids
4. созревания сетчатки Organoids
5. генерации и усиления прав человека iPSC производный клетки ПЭС (hiRPE)
6. криоконсервирования Organoids сетчатки и hiRPE клеток
7. размораживание Organoids сетчатки и hiRPE клеток
Первым шагом для человека iPSC дифференциации, культивируемые фидер свободных условий16 — закрыть самообновлению механизм, с помощью среды Bi поощрять спонтанное дифференциации (рис. 1A). Затем, в D2, дополняется среды Bi с N2 дополнение для дифференциации iPSCs клетки к линий нервных и сетчатки. Этот процесс приводит к появлению neuroretinal почки в окрестностях D28 (рис. 1 c - 1E). Самостоятельного формирования neuroretinal структуры могут быть изолированы с помощью иглы, как показано на рисунке 1E и переданы культуры пластины позволяют созревания сетчатки organoids в плавающей культуры условиях с использованием ProB27 среднего (Рисунок 1F). В пользу роста и развития нейронных сетчатки, FGF2 добавляется к средству за 1 неделю (рис. 1A).
В D28 возникающих сетчатки структуры содержат главным образом сетчатки прогениторных клеток, которые совместно Экспресс ключевых транскрипционный фактор как PAX6, Ракс и VSX215. Эти предшественники порождают семи основных классов типов клеток сетчатки в плавающей культуры условия в порядке эволюционно сохранены рождения согласуется с развитием человека сетчатки. На основе qRT-PCR и иммуногистохимии, ранее описанных в Райхман и др. 15, широкий кривых на рисунке 2 шоу волны раннего и позднего родился поколений сетчатки клетки во время процесса созревания в пробирке . Таким образом время культуры определяет типы клеток в organoids.
Изоляция hiRPE клеток для дальнейшего усиления может быть выполнена только при пигментации ощутимый, потому что это окрашивание клеток позволяет их визуализации. Таким образом средний ProN2 используется от D28 D42 в пользу пигментация ПЭС клетки15.
В зависимости от человека iPSC клон пигментные пятна могут быть обнаружены до или после самостоятельного формирования сетчатки структур; но главным образом 1 или 2 недели после использования ProN2 среды в D28 (рис. 3а, B). Образ представителя яркие поля hiRPE клеток из изолированных патчи на проход 0 показано на рисунке 3 c и 3D. Затем hiRPE клетки могут быть расширены до прохождения 4, сохраняя их НПП фенотип без эпителия мезенхимальных перехода (EMT). Тем не менее EMT можно предотвратить с помощью рок ингибиторы, такие как Y-27632, позволяя также увеличение ячейку число проходов17. Долгосрочные культуры клеток после оттаивания могут легко выполняться в условиях, описанных здесь, для получения зрелой и функциональных эпителия15hiRPE. Зрелые hiRPEp2 клеток на 52 недели с классической шестигранника булыжником морфология примером в рисунке 3E.
Рисунок 1: формирования и созревания сетчатки organoids с приверженцами человеческого iPSCs. (A) дифференциация протокол, позволяющий поколения сетчатки organoids. (B) человека iPSCs в D0. (C) новые neuroretinal эпителия в D15. (D) самостоятельного формирования нейронных структур сетчатки как на D22. (E) здесь, neuroretinal бутон изолирован с помощью иглы. (F) представитель образы сетчатки organoids в плавающей состояния культуры в D35. Масштаб баров = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: волны человека iPSC производные сетчатки клетки поколения. Сокращения: Клетки-предшественники сетчатки (RPC), сетчатки клетки ганглии (РГК), горизонтальные клетки (Ho), Амакриновые клетки (Am), Мюллер глиальные клетки (MGC), Биполярные клетки (Bp) и фоторецепторов (PR). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: генерации и усиления человека iPSC производные ПЭС. (A) Иллюстрация дифференциация протокола, позволяя генерации клеток человеческого hiRPE. (B) фазово контрастной фото показаны пигментированные патчи, переживших дифференциации адэрентных человека iPSCs в неделю 6 (Рейсы W6). (C) hiRPEp0 клетки культивировали одна неделя (W1) после выбора пигментированной патч. (D) hiRPEp0 клетки в неделю 6 (Рейсы W6) после выбора пигментированной патч. (E) A представитель изображение hiRPEp2 клеток после оттаивания, выращивают для 52 недель (W52) в ProN2 среде. Масштаб баров = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Этот протокол описывает, как производить НПП клетки и сетчатки organoids, содержащий сетчатки РГК и фоторецепторов, от человеческих плюрипотентных стволовых клеток в условиях xeno свободных и без подачи. Совместим с процесс надлежащей производственной практики (GMP), метод выращивают здесь представлены позволяет большое производство iPSC производные клеток сетчатки клетки ПЭС, РГК и фоторецепторных клеток для развития на основе стволовых клеток лечение и наркотиков Открытие подходы для будущего лечения дегенеративных заболеваний сетчатки. Криоконсервация целом сетчатки organoids или hiRPE клетки также предоставляет основным преимуществом в создании банков промежуточных клеток, важным шагом для будущего использования в терапии на основе стволовых клеток.
Производство больших запасов типов конкретных клеток сетчатки на определенной стадии дифференцировки потребуются для будущих клинических перевода. В этой связи поколения в три месяца CD73-позитивных фоторецепторных прекурсоров описал как трансплантация совместимых клеток населения18и возможность генерировать эти незрелые фоторецепторы от замораживания размораживания сетчатки organoids15 укрепить надежду для использования этих клеток в терапевтических целях. Относительно пигментированной сетчатки эпителия hiRPE клеток способность размножаться в vitro позволяет крупноклеточный производств в банк их. Главное талой iPSC производные НПП клетки человека сохраняют свои НПП фенотип и функции, поэтому, как трофического фактора секреции или фоторецепторных наружный сегмент фагоцитоза15, проверка их простоту использования для отбора стратегий, а также как для будущие терапевтические подходы.
Существует множество протоколов для поколения iPSC производные сетчатки organoids7,8,9,10,11,12,15 , различаются в Культура методы (embryoid тело, как агрегатов против адэрентных клеток), а также эффективность и надежность. Метод, описанный здесь начинается с приверженцами человеческого iPSCs и показывает воспроизводимый эффективность, приспособляемость и применимости к широкому спектру человеческой iPSC линии15. Этот процесс, основанный на последовательных изменений сыворотки свободных СМИ, резюмирует основные этапы развития сетчатки, используя встроенные подсказки системы для дифференциации. Важным преимуществом этого протокола является отсутствие эмбриональных тела формирования и Добавление матрицы для будущих GMP-совместимый сетчатки клетки, протоколы для получения производных терапии клеток для производства. Таким образом, никакой разницы в эффективности сетчатки органоид поколения и созревания были найдены между культивированная и без культивированная культуры условий с помощью системы терапии клеток (CTS) добавки или нет, сформулированы исключительно с рекомбинантной или гуманизированные компонентов.
Успех метода сетчатки дифференциация во многом зависит от качества человека iPSC культур. Перепрограммирования метод не влияет на эффективность дифференциация человеческого iPSCs клетки сетчатки8, но их статус stemness нужно быть оптимальным. Кратко регулярно обрабатываемых человека iPSCs не должна иметь каких-либо признаков дифференциации. Колонии не должны перекрываться и должны отображать их характерных циклические морфологии. Хотя эффективность сетчатки дифференциация зависит от клонов, как минимум двух сетчатки структур за см2 можно выбрали на D28, соответствующий 50-60 neuroretinal структур для одного 6-см блюдо. Для созревания сетчатки органоид условиях плавающего культуры ограничивая количество структур за хорошо избегает структуры fusion и средних чрезмерное. В этих условиях культуры сетчатки organoids можно вызревшие обширные время, необходимые для получения конце типы клеток сетчатки.
Заглядывая вперед, сетчатки organoids генерируется в vitro этим методом представляют собой мощные инструменты для модели заболевания сетчатки. Пациент конкретных iPSC производные сетчатки клетки модели будет использоваться лучше понять сложные или генетических заболеваний по исследованию их молекулярных и клеточных механизмов. Эти модели будут особенно подходит для обнаружения наркотиков через высокопроизводительного скрининга, клеточной и генной терапии или геном редактирования подходы, разрабатывать новаторские методы лечения дистрофий сетчатки.
Райхман SACHA, Оливье Goureau и Хосе-Ален Сахеля ожидающих изобретателей на патентов, связанных с поколения клетки сетчатки от человеческих плюрипотентных стволовых клеток.
Авторы хотели бы поблагодарить членов группы Goureau за их вклад во время настройки методов, описанных здесь и G. Гальярди и м. Garita за их критического чтения. Эта работа была поддержана от грантов от НРУ (GPiPS: АНР-2010-RFCS005; SightREPAIR: АНР-16-CE17-008-02), Ассоциация Франции сетчатки и передачи технологии компании SATT Lutech. Она также была проведена в рамках LABEX LIFESENSES (АНР-10-LABX-65) поддерживается НРУ в рамках программы будущее Investissements (АНР-11-IDEX-0004-02).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены