Method Article
多能性幹細胞から特殊な網膜細胞の生産は、網膜疾患の幹細胞を用いた治療法の開発のターニング ポイントです。本稿は、並進、基礎および臨床研究のオルガノイドの網膜と網膜色素上皮の効率的な生成の単純な方法をについて説明します。
特殊化した細胞から多能性幹細胞の生産には、再生医療のための新しいアプローチを開発する強力なツールが用意されています。人間誘導された多能性幹細胞 (Ips) の使用は、iPSC 由来網膜細胞モデルが理解し失明を戦う主要な一歩前進をマーク網膜ジストロフィーを含む神経変性疾患研究に特に魅力的です。生成、成熟、および網膜オルガノイドを凍結するシンプルかつスケーラブルなプロトコルについて述べる。媒体を変更するに基づいて、このメソッドの主な利点は複数を避けるために、時間のかかる手順は、Ips の誘導分化で要求される一般的。付着性人間 iPSC 文化に定義されているメディアの継時的変化による網膜の開発の初期の段階を模倣、このプロトコルにより上方構造と網膜色素上皮 (RPE) 細胞を自己形成の同時発生、4 週間で再現性のある、効果的な方法。これらの構造体を含む網膜前駆細胞 (Rpc) は、Rpc の大人の人間の網膜内にある 7 網膜細胞型への分化を有効に浮遊培養条件でさらに成熟簡単に分離できます。また、網膜オルガノイドの凍結保存法と長期保存のための網膜色素上皮細胞について述べる。一緒に組み合わせることで、ここで説明する方法は、銀行の iPSC 由来網膜細胞または基礎・臨床研究のためのティッシュを制作し役に立つでしょう。
網膜は中枢神経系 (CNS) の不可欠な部分で、自発的に次の外傷性の傷害または病気を再生する限られた容量。したがって、糖尿病網膜症、緑内障、網膜色素変性症 (RP) 加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) などの決定的な網膜細胞の損失を引き起こす退行性の病態は、通常、不可逆的な失明に します。変性網膜を救出、破損したまたは失われた細胞を置き換えることを目指して幹細胞ベースの治療が最も有望なアプローチ1,2,3の 1 つで、主要な課題です。ヒト胚性幹細胞 (Esc) 細胞と多能性幹細胞または人間誘導された多能性幹細胞 (Ips) は、文化では、無限に拡張する能力を持っているし、任意のセルの種類を生成する可能性があります。網膜の開発の私達の理解と体外の改善の進歩人間 iPSC 分化がにより網膜 organoids7,8,9の生成のためのプロトコルします。 10、11,12。主要な網膜細胞、網膜神経節細胞 (Rgc)、光受容体、網膜色素上皮 (RPE) 細胞などのすべてが人間 Esc と Ips4,ので5,から正常に分化されている6. 永楽らによって開発された SFEB (胚様体のような骨材の無血清培養) 法に基づく13、網膜オルガノイドの自己形成は、定義された細胞外マトリックス成分7,10,14esc キーまたは iPSC 由来胚様体のような集計から入手できます。しかし、これらのプロトコルは複雑な治療法や創薬スクリーニングのため細胞の大量生産と常に互換性がないステップの多数を必要とします。したがって、人間の網膜の細胞を生成するメソッドの選択が重要とメソッドは、堅牢で拡張性が高く、かつ効率的なする必要があります。
ここでは、当社の以前の文書15に基づいて、我々 はフィーダー、xeno フリー状態で栽培される付着人間 Ips から網膜における自己形成を通じて網膜細胞のシンプルかつ効率的な世代のため各ステップをについて説明します。付着性人間 Ips の日常文化から始まって、このプロトコルは 4 週間で iPS 由来 RPE (hiRPE) 細胞と上方の構造の両方の世代を変更する単純な連続媒体のみを必要があります。手動分離後 hiRPE を展開して網膜の構造は浮動 organoids 網膜前駆細胞が生体内で人間と一貫性のある順番にすべての網膜細胞のタイプに区別することで培養できます。retinogenesis。最後に、研究の進歩や臨床の翻訳は、彼らの表現の特性と機能に影響を与えずに網膜全体 organoids と hiRPE 細胞の長期貯蔵を許可する凍結方法をについて説明します。
このペーパーで説明したプロトコルの Institut de la ビジョンの研究倫理委員会のガイドラインに従います。Institut de la ビジョンは、現在のフランス語の規則に従って人間の標本の操作を許可されています。検体の取り扱い"Comité デ保護デ Personnes (CPP) イル V"の倫理的な承認後にヘルシンキの教義に従って患者データ保護と国民の規則に従います。
1. 文化メディアと料理の準備
2. メンテナンスおよび拡張の人間の Ips
3. 網膜オルガノイドの世代
4. 網膜オルガノイドの成熟
5 世代と増幅人間 iPSC 由来網膜色素上皮 (hiRPE) 細胞
6. 網膜 Organoids と hiRPE 細胞の凍結保存
7. 融解網膜オルガノイドの hiRPE セル
フィーダー無料条件16で培った人間 iPSC の差別化のための最初のステップです (図 1 a) の分化を促進する双方向の媒体を使用して自己複製機械をシャット ダウンします。双方向メディアを補完する D2 での Ips 細胞神経および網膜の系統へのガイドに N2 サプリメントで。この過程は D28 の周りで上方芽の外観につながります (図 1 - 1E)。自己形成の上方の構造は図 1Eに示すように針を使用して分離することができます、ProB27 媒体 (図 1 f) を使用して浮動小数点の培養条件で網膜オルガノイドの成熟を許可する培養皿に転送。成長と神経網膜の開発を支持するには、FGF2 は 1 週間 (図 1 a)、媒体に追加されます。
D28、新興の網膜構造共同 VSX2、RAX、PAX615として重要な転写因子を表現する網膜前駆細胞主に含まれます。これらの前駆細胞は、網膜の発達を一貫性のある進化上保存された生れ順序で培養条件を浮網膜のセルタイプの 7 つの主要なクラスに上昇を与えます。QRT PCR およびライマンらで前述の免疫組織化学に基づく15図 2の広範なカーブは、初期と後期-生まれ網膜細胞世代体外成熟プロセス中の波を示します。したがって、培養時間は細胞の種類、オルガノイドの存在を定義します。
このセルの着色の可視化を可能にするため、色素沈着が知覚の場合のみ、任意のさらなる拡大のための hiRPE 細胞の分離を実行できます。このように、網膜色素上皮細胞15の色素沈着を支持する ProN2 メディアは D28 から D42 に使用されます。
人間 iPSC クローンによって網膜構造の自己形成の前後に色素のパッチは検出できます。ほとんど 1 または 2 週間 ProN2 培地で D28 の使用後 (図 3 a, B)。通過 0 で孤立から拡大した hiRPE 細胞の代表的な明るいフィールド画像は、図 3と3 Dで表示されます。その後、hiRPE 細胞は経過 4、上皮間葉移行 (EMT) なし、RPE の表現型を保持するまで拡張できます。それにもかかわらず、EMT はセル番号通路17の増加を許しても Y-27632 など ROCK 阻害薬の使用によって防ぐことができます。解凍後 hiRPE 細胞の長期培養は、機能的な成熟した上皮15を取得するここで説明した条件で簡単に実行できます。図 3Eに古典的な立方石畳形態で 52 週で成熟した hiRPEp2 細胞の例を示します。
図 1: 生成・付着性人間 Ips から網膜オルガノイドの成熟します。(A) 分化プロトコル網膜オルガノイドの生成を許可します。(B) D0 の人間の Ips。(C) D15 で上方上皮を新興します。(D) D22 で自己形成神経網膜のような構造。(E) ここで、上方の芽は、針を使用して分離されます。(F) D35 で培養条件を浮網膜オルガノイドの代表的なイメージ。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 波 iPSC 由来網膜の細胞生成します。省略: 網膜前駆細胞 (Rpc)、網膜神経節細胞 (Rgc)、水平細胞 (Ho)、アマクリン細胞 (午前)、ミュラー グリア細胞 (MGCs)、双極細胞 (Bp) および光受容体 (PR)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 世代と人間 iPSC 由来 RPE の増幅します。(A) 人間の hiRPE 細胞の生成を許可する分化プロトコルのイラスト。(B) 位相差画像発色表示パッチ週 6 (W6) 付着性人間 Ips の差別化から新興します。(C) hiRPEp0 細胞は、色素のパッチ選択の後 1 週間 (W1) を栽培しました。(D) hiRPEp0 細胞 6 週時 (W6) 色素性パッチ選択の後。A (E) 解凍後、hiRPEp2 細胞の代表的な画像は、52 週間 (W52) ProN2 培地で栽培。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
このプロトコルでは、網膜色素上皮細胞と網膜 Rgc と xeno、フィーダー フリー条件のひと多能性幹細胞から視細胞を含む網膜のオルガノイドを生成する方法について説明します。ここに示すよい製造業練習 (GMP) プロセス、栽培法との互換性により、RPE 細胞、Rgc、幹細胞ベースの治療法や薬の開発のための視細胞と iPSC 由来の網膜細胞の大規模な生産網膜変性疾患の将来の治療発見アプローチ。網膜全体 organoids または hiRPE 細胞の凍結保存は、中間細胞銀行を確立するの主な利点は、幹細胞ベースの治療で将来使用するための重要なステップを提供します。
分化の特定のステージで特定の網膜細胞型の大型株の生産は、今後臨床的翻訳の必要があります。この点で、CD73 正視細胞前駆体の 3ヶ月で世代が移植-互換性のある細胞人口18, と凍結融解の網膜からこれらの未熟な光受容体を生成する可能性として記述organoids15強化治療目的のためのこれらの細胞を使用するために希望します。網膜の色素上皮に関する hiRPE 細胞の体外増殖能力はそれらを銀行に大細胞生産をことができます。重要なは、解凍の人間 iPSC 由来網膜色素上皮細胞保持 RPE 表現型、関数、したがって、栄養因子分泌や視細胞外側セグメント貪食15、同様の戦略をスクリーニングのための使用の容易さを検証します。今後の治療法。
IPSC 由来網膜 organoids7,8,9,10,11,12,の15の異なる世代のプロトコルのさまざまながあります。効率と堅牢性だけでなく、文化のメソッド (胚様体誘導体のような付着性のセル対を集約)。ここで説明する方法は、付着性人間 Ips から始まり、再現性、適応性、および人間の iPSC 行15の広い範囲への適用性を示しています。血清無料メディアの経年的変化に基づく、このプロセスは、分化をガイドするシステムの本質的な手がかりを利用することで網膜の開発の主な手順を繰り返します。このプロトコルの重要な利点は、胚体形成の有無と将来の GMP に準拠した網膜細胞を細胞療法誘導体を生産するためのプロトコルを製造については、マトリックスの追加です。この方法で網膜における生成と成熟の効率の違いが見つかりませんでした異種との異種文化条件細胞治療システム (CTS) のサプリメントを使用してか、組換えのみ配合の間またはヒトのコンポーネント。
網膜の微分法の成功は、人間の iPSC 文化の質によって大きく異なります。リプログラミング法に、8の網膜細胞人間 Ips の分化効率は影響しませんが、その未分化状態が最適なする必要があります。簡潔に、日常的に培われた人間の Ips では、分化の兆候が表示する必要があります。植民地と重ならないようにし、特徴的な円形の形態を表示する必要があります。網膜の分化の効率はクローンに依存したが、cm2あたり 2 つの網膜の構造の最小選択できる D28 で 6 cm の料理は 1 つ 50 60 上方構造に対応します。浮遊培養条件の網膜における成熟、井戸ごとの構造体の数を制限する構造融合と中の過剰消費を回避できます。これらの培養条件で網膜 organoids できますが maturated 広範な時間に遅れて網膜細胞の種類を取得する必要があります。
生成された網膜オルガノイド培養このメソッドによって楽しみ、モデル網膜疾患の強力なツールを構成します。患者固有の iPSC 由来網膜細胞モデルは、その分子・細胞機構の探査によって複雑なまたは遺伝的疾患を理解する使用されます。これらのモデルは特に高スループット スクリーニング、細胞、遺伝子治療、網膜ジストロフィーの革新的な治療法の開発へのアプローチを編集ゲノム、創に適してになります。
サシャ ライヒマン、オリヴィエ ・ Goureau、ホセ ・ アラン ・ サヘルひと多能性幹細胞からの網膜細胞の生成に関連する特許発明に。
著者は、彼らの重要な読書のため、ここで説明する方法と G. ガリアルディ M. Garita の設定時に、入力のための Goureau のチームのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、ANR からの補助金によって支えられた (GPiPS: ANR-2010-RFCS005;SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02)、網膜フランス協会との技術移転会社船型研究 Lutech。それはまた Investissements d'Avenir プログラム (ANR-11-アイデックス-0004-02) 内で ANR 支え LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) のフレームで行われました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
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