Method Article
הייצור של תאים ברשתית מתמחה מתאי גזע pluripotent היא נקודת מפנה בהתפתחות מבוססי תאי גזע טיפול למחלות רשתית. המאמר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לדור יעיל של organoids ברשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית למחקר בסיסי translational, קליניים.
הייצור של תאים מיוחדים מתאי גזע pluripotent מספק כלי רב עוצמה כדי לפתח גישות חדשות עבור רפואה רגנרטיבית. השימוש בתאי גזע pluripotent הנוצרות על-ידי האדם (iPSCs) הוא אטרקטיבי במיוחד ללימודים מחלות ניווניות, כולל dystrophies ברשתית, נגזר iPSC התא רשתית מודלים כדי לסמן היכן צעד חשוב להבין ולהילחם עיוורון. בנייר זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומדרגי צור, בוגר של cryopreserve organoids ברשתית. מבוסס על שינוי בינוני, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא להימנע מרובים ודרשה זמן רב שלבים בדרך כלל בהבחנה מודרכים של iPSCs. מחקה את השלבים הראשונים של התפתחות הרשתית על ידי שינויים רצופים של מדיה מוגדרים על תרבויות iPSC האדם חסיד, פרוטוקול זה מאפשר הדור בו זמנית של עצמי ויוצרים מבנים neuroretinal, פיגמנט אפיתל (RPE) תאים ברשתית ב באופן יעיל הדירים ב- 4 שבועות. מבנים אלה המכילים ובתאים ברשתית (Rpc) ניתן לבודד בקלות על התבגרות נוספת במצב תרבות צף המאפשר את הבידול של Rpc לתוך סוגי תאים ברשתית שבע נוכח הרשתית האנושית למבוגרים. בנוסף, אנו מתארים שיטות מהירה הקפאה קריוגנית של הרשתית organoids ואת תאי RPE לאחסון לטווח ארוך. יחד בשיטות המתוארות כאן יהיה שימושי כדי לייצר, בנק תאים ברשתית, נגזר iPSC אדם או רקמות לצורך מחקר בסיסי וקליני.
הרשתית היא חלק אינטגרלי של מערכת העצבים המרכזית (CNS) לבין בעל קיבולת מוגבלת להתחדש באופן ספונטני לאחר פציעה טראומטית או מחלות. לכן, פתולוגיות ניוונית גרימת איבוד תאים ברשתית סופית, כגון הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD), רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית, בדרך כלל להוביל לעיוורון בלתי הפיך. הצלת הרשתית מנוונת היא אתגר גדול עבורה טיפולים מבוססי תאי גזע במטרה להחליף את התאים ניזוק או אבד הם אחד של המבטיחים ביותר גישות1,2,3. גזע pluripotent כתאי תאי גזע עובריים (ESCs) או בתאי גזע pluripotent הנוצרות על-ידי האדם (iPSCs) יש את היכולת להיות מורחב ללא הגבלת זמן, תרבות, ויש להם את היכולת לייצר כל סוגי תאים. ההתקדמות ההבנה שלנו של התפתחות הרשתית ושיפור במבחנה פרוטוקולים עבור בידול iPSC אנושי גרמו הדור של הרשתית organoids7,8,9, 10,11,12. כל התאים ברשתית העיקריים, כולל תאי גנגליון (RGCs), photoreceptors של פיגמנט אפיתל (RPE) תאים ברשתית, יש כבר בהצלחה תריז האנושי ESCs ו- iPSCs4,5, 6. מבוסס על שיטת SFEB (ללא סרום תרבות של אגרגטים גוף דמוי embryoid) שפותחה על ידי. של איראקא et al. 13, היווצרות עצמית של הרשתית organoids ניתן להשיג ESC או iPSC-נגזר אגרגטים גוף דמוי embryoid מטריצה חוץ-תאית מוגדר רכיבים7,10,14. אבל פרוטוקולים אלה מורכבות, הדורשות מספר רב של צעדים אינו תמיד תואם עם ייצור גדול של תאים עבור גישות טיפוליות או והתרופות הקרנה. לכן, הבחירה של השיטה כדי לייצר תאים ברשתית האנושי הוא קריטי, השיטה צריכה להיות חזקה, מדרגי ויעיל.
כאן, בהתבסס על הפרסום הקודם שלנו15, נתאר כל שלב לדור פשוטה ויעילה של תאים ברשתית דרך תא צורב ברשתית היווצרות עצמית של חסיד iPSCs האנושי מעובדות במצב מזין ו קסנו-חופשית. החל מתרבויות שגרתית של חסיד iPSCs האנושי, פרוטוקול זה דורש רק מדיום רצופים פשוט שינוי כדי לאפשר את הדור של תאי RPE (hiRPE) שב ס-derived ומבני neuroretinal ב 4 שבועות. לאחר בידוד ידני, hiRPE ניתן להרחיב ותרבותית המבנים ברשתית יכולה להיות צפים organoids איפה הרשתית ובתאים הם מסוגלים להבדיל לתוך כל סוגי תאים ברשתית סדר רציפים בקנה אחד עם האדם אין ויוו retinogenesis. לבסוף, לקידום המחקר או תרגום קליני, נתאר שיטת הקפאה קריוגנית המאפשר אחסון לטווח ארוך של organoids כל רשתית ותאים hiRPE מבלי להשפיע על מאפייני פנוטיפי והפונקציונליות שלהם.
הפרוטוקול המתואר במאמר זה עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה של החזון de la אינסטיטוט מחקר. החזון de la אינסטיטוט אפשרה המניפולציה של הדגימה האנושי על פי התקנון צרפתי הנוכחי. הדגימה טיפול עוקב אחר הגנה על נתונים החולה לפי העיקרים של הלסינקי, ולתקנות הלאומית לאחר אישור מוסרי ה Comité דה הגנה des Personnes (CPP) ile-de-וי.
1. הכנת מנות ומדיה תרבות
2. תחזוקה, הרחבה של זכויות iPSCs
3. הדור של הרשתית Organoids
4. ההבשלה של הרשתית Organoids
5. דור, תאי RPE (hiRPE) נגזר iPSC הגברה של אדם
6. הקפאה קריוגנית של הרשתית Organoids ותאים hiRPE
7. מפשיר של הרשתית Organoids ותאים hiRPE
הצעד הראשון עבור בידול iPSC האדם טיפח מזין ללא תנאים16 הוא לסגור את מכונות התחדשות עצמית באמצעות Bi בינוני לעודד הבחנה ספונטנית (איור 1 א'). לאחר מכן, ב- D2, המדיום Bi הוא השלים עם תוספת N2 להנחות המבדילים iPSCs התאים לכיוון שושלות עצבית ו ברשתית. תהליך זה מוביל המראה של ניצנים neuroretinal-סביב D28 (איור 1C - 1E). מבנים neuroretinal ויוצרים עצמית ניתן לבודד באמצעות מחט כמופיע באיור 1E והועבר ללוחות תרבות כדי לאפשר את התבגרותם של organoids ברשתית בתנאים תרבות צף באמצעות ProB27 בינוני (איור 1F). לטובת צמיחה והתפתחות של הרשתית עצבית, FGF2 מתווסף המדיום במשך שבוע (איור 1 א').
ב D28, המבנים ברשתית המתעוררים מכילים בעיקר ברשתית ובתאים המבטאות במשותף את גורם שעתוק מפתח PAX6 RAX, VSX215. אבות אלה להצמיח המחלקות הגדולות שבעה סוגי התא רשתית בצפה התרבות התנאים בצו לידה אבולוציונית שנשמרת בקנה אחד עם התפתחות הרשתית האנושית. מבוסס על לרביעיית-PCR אימונוהיסטוכימיה שתואר קודם לכן ברייכמן ואח . 15. עקומות רחבה באיור 2 הצג גלים של דורות התא רשתית מוקדם, מאוחר-יליד במהלך תהליך ההבשלה במבחנה . לכן, הזמן תרבות מגדירה את סוגי תאים נוכח organoids.
בידודו של תאים hiRPE נוספות הגברה יכול להתבצע רק כאשר פיגמנטציה הוא מורגש כי זה הגיוון התא מאפשר הדמיה שלהם. בדרך זו, משמש המדיום ProN2 מ D28 כדי D42 את האמונים על הפיגמנטציה של תאי RPE15.
בהתאם, שיבוט אנושי iPSC המדבקות פיגמנט ניתן להבחין לפני או אחרי היווצרות עצמית של מבנים ברשתית; אבל בעיקר 1-2 שבועות לאחר השימוש ProN2 בינוני-D28 (איור 3 א, ב'). תמונת שדה בהיר נציג של תאים hiRPE מורחבת של המדבקות מבודד-המעבר 0 מוצג 3C איור ותלת מימד. לאחר מכן, ניתן להרחיב את התאים hiRPE עד מעבר 4, שמירה על פנוטיפ RPE שלהם ללא מעבר אפיתל-mesenchymal (החובשים). למרות זאת, החובשים ניתנת למניעה על ידי שימוש רוק מעכבי כגון Y-27632, ומאפשר גם גידול של תאים קטעים מספר17. תרבויות ארוכת טווח של תאים hiRPE לאחר מפשיר ניתן לבצע בקלות בתנאים המתוארים כאן כדי להשיג אפיתל בוגרת ופונקציונליים15. דוגמה של תאים בוגרים hiRPEp2 בשבוע 52 עם מורפולוגיה המרוצף cuboidal קלאסית מודגם ב- 3E איור.
איור 1: דור, ההבשלה של הרשתית organoids מן iPSCs האדם חסיד. (א) בידול פרוטוקול המאפשר את הדור של organoids ברשתית. (B) iPSCs האנושי-D0. (ג) המתעוררים neuroretinal אפיתל-D15. (ד) עצמית ויוצרים מבנים דמויי-רשתית עצבית-D22. (E) כאן, ניצן neuroretinal היא מבודדת באמצעות מחט. (F) תמונות נציג של organoids רשתית בצפה מצב התרבות ב- D35. גודל ברים = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: גלים של הרשתית האנושית נגזר iPSC תא דור. קיצורים: רשתית ובתאים (Rpc) רשתית תאי גנגליון (RGCs), תאים אופקיים (Ho), תאי אמקרין (Am), תאי גליה מולר (MGCs), תאים דו-קוטביים (Bp), photoreceptors (PR). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: דור, הגברה של האדם נגזר iPSC RPE- (א) איור של פרוטוקול בידול ומאפשר את הדור של תאים hiRPE האנושית. (B) ניגודיות שלב תמונות מראה פיגמנט תיקונים הבוקע המבדילים iPSCs האדם חסיד-שבוע 6 (W6). (ג) hiRPEp0 תאים טיפח שבוע אחד (W1) לאחר תיקון פיגמנט. (ד) hiRPEp0 תאים בשבוע 6 (W6) לאחר תיקון פיגמנט. (E) A תמונת הנציגה של תאים hiRPEp2 לאחר מפשיר, טיפח במשך 52 שבועות (W52) ב ProN2 בינונית. גודל ברים = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאי RPE, organoids ברשתית, המכילה RGCs ברשתית, photoreceptors, מתאי גזע pluripotent האנושי בתנאים קסנו-חופשית, נטולת מזין. תואם עם תהליך אימון ייצור טוב (GMP), השיטה מעובדות המובאת כאן מאפשר הפקה גדולה של נגזר iPSC תאים ברשתית תאי RPE, RGCs ו photoreceptors לפיתוח טיפולים מבוססי תאי גזע, סמים גילוי גישות לטיפול עתידי של מחלות ניווניות של הרשתית. הקפאה קריוגנית של organoids כל ברשתית או תאים hiRPE מספק גם היתרון העיקרי בהקמת בנקים תא ביניים, צעד חשוב לשימוש עתידי טיפולים מבוססי תאי גזע.
הייצור של מלאי גדול של סוגי תאים ברשתית מסוימים בשלב מסוים של בידול יידרש לתרגום קליניים עתידיים. בהקשר זה, הדור תוך שלושה חודשים של CD73-חיוביות קולט אור מבשרי מתואר של האוכלוסייה התואמים להשתלת תאים18, ועל האפשרות לייצר אלה photoreceptors ילדותי הקרת ההקפאה רשתית organoids15 לחזק את התקווה להשתמש תאים אלה למטרות טיפוליות. בנוגע אפיתל פיגמנט הרשתית, מאפשר היכולת של תאי hiRPE להתרבות במבחנה הפקות תא גדול להפקיד אותם. חשוב, המופשרים תאי RPE אדם נגזר iPSC שומרים על פנוטיפ RPE והתפקוד שלהם, לכן, גורם עם מחלות הפרשת או קולט אור פלח החיצוני phagocytosis15, אימות שלהם נוחות השימוש לסינון אסטרטגיות באותה מידה כמו עבור גישות טיפוליות עתידיות.
יש מגוון של פרוטוקולים לדור של נגזר iPSC organoids ברשתית7,8,9,10,11,12,15 זה להשתנות תרבות שיטות (embryoid גוף דמוי אגרגטים לעומת תאים חסיד) כמו גם יעילות ועמידות. השיטה המתוארת כאן מתחיל מ iPSCs האדם חסיד ומראה היעילות לשחזור, הסתגלות, ישימות למגוון רחב של האדם iPSC שורות15. תהליך זה, המבוסס על השינוי רצופים של סרום ללא מדיה, recapitulates את השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית על ידי ניצול הותאם פנימיים של המערכת כדי להנחות בידול. יתרון חשוב של פרוטוקול זה הוא העדר גוף עובריים היווצרות ותוספת של מטריקס עבור העתיד התא רשתית תואמי GMP בייצור פרוטוקולים לייצר תא טיפול נגזרים. בדרך זו, אין הבדל היעילות של דור תא צורב ברשתית, ההבשלה נמצאו בין תנאי התרבות xenogeneic לא-xenogeneic באמצעות מערכת טיפול תא (CTS) תוספי מזון או לא, מנוסחים באופן בלעדי עם רקומביננטי או רכיבי humanized.
ההצלחה של השיטה בידול ברשתית תלויה, במידה רבה האיכות של התרבויות iPSC אנושי. השיטה התיכנות אינה משפיעה את היעילות בידול של האדם iPSCs תאים ברשתית8, אך מעמדם stemness צריך להיות אופטימלית. בקצרה, מעובדים באופן שגרתי iPSCs האדם לא צריך להראות סימנים של בידול. המושבות צריכה אינם חופפים, עליך להציג מורפולוגיה המעגלית האופיינית שלהם. למרות היעילות של הבידול ברשתית תלויי-שיבוט, מינימום של שני מבנים ברשתית לכל ס מ2 יכולים לבחור בהם ב D28, המתאים למבנים neuroretinal 50-60 על צלחת אחת של 6 ס מ. עבור תא צורב ברשתית התבגרותו בתנאים תרבות צף, הגבלת מספר מבנים לכל טוב מונע מבנה פיוז'ן וצריכת בינוני. בתנאים אלה תרבות ', organoids ברשתית יכולה להיות maturated למשך זמן רב, הנדרשים על מנת לקבל סוגי תאים ברשתית מאוחר.
. מצפה בקוצר רוח, organoids ברשתית שנוצר במבחנה בשיטה זו מהווים כלים רבי-עוצמה למחלות רשתית מודל. מודלים נגזר iPSC תא ברשתית החולה הספציפי ישמש כדי להבין טוב יותר מחלות גנטיות מורכבים על ידי חקר מנגנונים מולקולריים וסלולריות שלהם. מודלים אלה יהיה מתאים במיוחד עבור גילוי תרופות באמצעות הקרנה תפוקה גבוהה, טיפולים התא ואת ג'ין או גנום עריכה גישות, לפתח טיפולים חדשניים dystrophies ברשתית.
סשה רייכמן, אוליבייה Goureau, חוסה-אלן סאהל ממתינים ממציאים על פטנטים הקשורים הדור של תאים ברשתית מתאי גזע pluripotent אנושי.
המחברים רוצה להודות חברי הצוות של Goureau לקבל את התשומה שלהם במהלך הסידור של השיטות המתוארות כאן, ו Gagliardi ג ו מ Garita לקריאה ביקורתית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), האגודה צרפת הרשתית ואת הטכנולוגיה העברת החברה הם העלו יחד Lutech. זה בוצע גם במסגרת LIFESENSES LABEX (ANR-10-LABX-65) נתמכת על-ידי ANR בתוך התוכנית d'Avenir Investissements (ANR-11-IDEX-0004-02).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved