Detecção de Bacteriófagos em Amostras Ambientais

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Alex Wassimi

Os vírus são um grupo único de entidades biológicas que infectam organismos eucarióticos e procarióticos. São parasitas obrigatórios que não têm capacidade metabólica, e para se replicarem, dependem do metabolismo hospedeiro para produzir partes virais que se auto-montam dentro das células hospedeiras.

Os vírus são ultramicroscópicos — pequenos demais para serem vistos com o microscópio de luz, visível apenas com a maior resolução do microscópio eletrônico. Uma partícula viral consiste em um genoma ácido nucleico, seja DNA ou RNA, cercado por uma camada de proteína, conhecida como capsid, composta de subunidades proteicas ou capsomers. Em alguns vírus mais complexos, o capsídeo é cercado por um envelope lipídedo adicional, e alguns têm apêndices de superfície ou caudas.

Vírus que infectam o trato intestinal de humanos e animais são conhecidos como vírus entéricos. Eles são excretados em fezes e podem ser isolados de águas residuais domésticas. Os vírus que infectam bactérias são conhecidos como bacteriófagos, e aqueles que infectam bactérias coliformes são chamados de colifagos (Figura 1). Os phages de bactérias coliformes são encontrados em qualquer lugar que as bactérias coliformes são encontradas.

Figura 1. Coliphage T2.

Bacteriófagos são estudados em ciências ambientais por serem um componente crítico dos sistemas biológicos. Eles são a entidade biológica mais abundante do mundo e são importantes porque ajudam a controlar populações bacterianas, processos alimentares, ciclos biogeoquímicos, bem como melhorar a diversidade procariótica através da transferência horizontal de genes. Há também evidências de que os phages são indicadores substitutos confiáveis para vírus entéricos causadores de doenças que também são transmitidos fecalmente, mas difíceis de avaliar. A disponibilidade de métodos relativamente rápidos e baratos para enumerar bacteriófagos torna-os uma ferramenta atraente para a avaliação da contaminação fecal em amostras ambientais.

Colifagos na água são avaliados pela adição de uma amostra para ágar macio ou sobreposto, juntamente com uma cultura de E. coli na fase de tronco do crescimento. O phage se liga à célula bacteriana e lise as bactérias. As bactérias produzem um gramado confluente de crescimento, exceto para áreas onde a praga cresceu e liseu as bactérias. Essas áreas claras resultantes são conhecidas como placas. Uma sobreposição de ágar macio é usada para restringir a difusão física dos vírus para que, ao sair de uma bactéria, eles só possam se espalhar para células bacterianas vizinhas.

Para obter a formação ideal da placa é importante que a bactéria hospedeira esteja em fase de registro de crescimento. Isso garante que toda a praga se conecte a bactérias vivas e produza progênere. Isso exige que uma cultura de bactérias hospedeiras seja preparada a cada dia que um ensaio seja realizado. Normalmente, uma cultura é incubada um dia antes do ensaio para que ela esteja na fase estacionária. No dia do ensaio, a cultura é usada para inocular um caldo, que é incubado para obter bactérias hospedeiras suficientes na fase de tronco para o ensaio (isso geralmente requer 2-3h de incubação em um banho de água tremendo a 35-37 °C).

1. Obtenha uma amostra de esgoto ou água contendo colifago.
2. Diluir a amostra 1:10 e 1:100 usando tampão Tris. Faça isso transferindo 1,0 mL de cultura para 9 mL de buffer Tris, e depois fazendo uma segunda diluição de 10 vezes.
3. Derreta três tubos de ágar macio (0,7% de ágar nutriente ou ágar de soja de tripática por tubo de 3 mL) colocando-os em um banho de vapor ou autoclave.
4. Coloque o ágar em um banho de água a 45-48 °C por 15 minutos para permitir que a temperatura do ágar se ajuste a 45 °C.
5. Ao primeiro tubo, adicione 1 mL de uma cultura de caldo de fase de tronco de E. coli¹ e 1 mL de amostra não diluída.
6. Retire o tubo do banho de água e balance suavemente entre as mãos para misturar a suspensão por 2-3 s.
7. Limpe a água do tubo com uma toalha de papel e despeje o ágar sobre uma placa de Petri previamente preparada contendo ágar inferior (ágar de nutrientes regular ou ágar de soja de tripática).
8. Gire rapidamente a placa para espalhar o ágar superior. Certifique-se de que o ágar cubra toda a superfície.
9. Repita as etapas 5-8 com os outros dois tubos de ágar macio, utilizando 1 mL de bactérias e 1 mL de cada diluição amostral(Figura 2).
10. Depois que o ágar se solidificar, inverta as placas de Petri e incubar a 37 °C por 48 h. Tire qualquer umidade da tampa da placa de Petri. Se uma gota de umidade cair sobre uma placa, fará com que o vírus se espalhe pela superfície do ágar.
11. Após a incubação, conte o número de placas em cada diluição(Figura 3) e calcule a concentração de phage na amostra original. Regisso regissário de diferenças no tamanho ou aparência das placas.

Figura 2. Procedimento para a preparação de um gramado bacteriano utilizando ágar superior para enumeração colifa.

Figura 3. Placas de phage em um gramado bacteriano.

¹E. coli strain ATCC 15597 geralmente produzirá o maior número de placas a partir de amostras de esgoto. Deve ser cultivado durante a noite em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de nutrientes ou caldo de soja de trippticase e incubado em condições de agitação a 35 °C. 3 h antes do ensaio de phage inocular um mL desta cultura em um frasco fresco contendo 100 mL de nutrientes ou caldo de soja tripática e colocar em um banho de água tremendo a 35-37 °C. Isso garantirá que as bactérias estejam na fase de registro do crescimento.

Diluição da amostra de esgoto = 10^-1

Número de placas obtidas = 9

Portanto, concentração de phage na amostra de esgoto
= 10 x 9 ÷ 1 mL
= 90 unidades formadoras de placas / mL

O esgoto bruto normalmente contém 10³ – 10⁴ colifagos por mL, com um intervalo de 10² – 10⁸ por mL.

Existem muitas aplicações potenciais de colifagos como indicadores ambientais. Estes incluem seu uso como indicadores de contaminação de esgoto, eficiência do tratamento de água e esgoto, e sobrevivência de vírus e bactérias entéricas no meio ambiente. O uso de bacteriófagos como indicadores da presença e comportamento de bactérias entéricas e vírus animais sempre foi atrativo devido à facilidade de detecção e baixo custo associado aos ensaios de phage. Além disso, podem ser quantificados em amostras ambientais dentro de 24h em comparação com dias ou semanas para vírus entéricos.

¹E. coli strain ATCC 15597 geralmente produzirá o maior número de placas a partir de amostras de esgoto. Deve ser cultivado durante a noite em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de nutrientes ou caldo de soja de trippticase e incubado em condições de agitação a 35 °C. 3 h antes do ensaio de phage inocular um mL desta cultura em um frasco fresco contendo 100 mL de nutrientes ou caldo de soja tripática e colocar em um banho de água tremendo a 35-37 °C. Isso garantirá que as bactérias estejam na fase de registro do crescimento.