Erkennung von Bakteriophagen in Umweltproben

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Alex Wassimi

Viren sind eine einzigartige Gruppe von biologischen Einheiten, die eukaryotische und prokaryotische Organismen zu infizieren. Sie sind obligate Parasiten, die keine metabolische Kapazität, und um zu replizieren, setzen auf Host-Stoffwechsel, virale Drehteile in Wirtszellen selbst zusammensetzen.

Viren sind ultramikroskopischer – zu klein, um mit dem Lichtmikroskop nur mit größerer Auflösung des Elektronenmikroskops sichtbar angezeigt werden. Ein Viruspartikel besteht aus einer Nukleinsäure-Genom, entweder DNA oder RNA, umgeben von einem Protein-Mantel, bekannt als ein Kapsid, bestehend aus Protein-Untereinheiten oder Capsomers. In einigen komplexeren Viren das Kapsid wird von einer zusätzlichen Lipid Hülle umgeben, und einige haben Spike-ähnliche Oberfläche Anhängsel oder Schwänzen.

Enterischen Viren sind Viren, die den Darm-Trakt von Menschen und Tieren anstecken genannt. Sie werden im Kot ausgeschieden und von häuslichem Abwasser isoliert werden können. Viren, die Bakterien infizieren werden Bakteriophagen genannt, und die coliforme Bakterien infizieren, werden genannt Coliphages (Abbildung 1). Die Phagen coliforme Bakterien sind überall gefunden, dass coliforme Bakterien gefunden werden.

Abbildung 1. Coliphage T2.

Bakteriophagen werden in Umweltwissenschaften studiert, denn sie sind ein wichtiger Bestandteil der biologischen Systeme. Sie sind die am häufigsten vorkommende biologisches Wesen auf der Erde und sind wichtig, weil sie helfen Kontrolle Bakterienpopulationen, Nahrungsnetz Prozesse, Stoffkreisläufe, sowie verbessern prokaryotische Vielfalt durch horizontalen Gentransfer. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass die Phagen zuverlässige Surrogat Indikatoren für die krankheitsverursachenden enterischen Viren sind, die auch fecally übertragen werden-aber schwer zu bestimmen. Die Verfügbarkeit von relativ schnelle und kostengünstige Methoden zum Auflisten von Bakteriophagen macht ihnen ein attraktives Instrument für die Beurteilung der fäkale Verunreinigungen in Umweltproben.

Coliphages im Wasser werden durch Zugabe eines Musters zu weich oder Overlay-Agar zusammen mit einer Kultur von E. Coli in der Log-Phase des Wachstums untersucht. Die Phagen der Bakterienzelle beimessen und lyse der Bakterien. Die Bakterien produzieren einen konfluierende Rasen des Wachstums mit Ausnahme der Bereiche, wo die Phagen gewachsen ist und die Bakterien lysiert. Diese resultierende klare Bereiche werden als Plaques bezeichnet. Eine weiche Agar-Overlay wird verwendet, um die körperliche Verbreitung von Viren einzuschränken, sodass nach Lyse aus einem Bakterium, sie nur zu den benachbarten Bakterienzellen verbreiten können.

Um optimale Plaque-Bildung zu erhalten ist es wichtig, dass die Host Bakterien in der Log-Phase des Wachstums. Dies sorgt dafür, dass die Phagen befestigen, um lebende Bakterien und Nachkommen zu produzieren. Dies erfordert, dass eine Kultur der Host Bakterien jeden Tag bereit sein, die ein Test durchgeführt wird. Eine Kultur wird in der Regel am Vortag der Assay inkubiert, so dass es in der stationären Phase. Am Tag des Tests, die Kultur wird verwendet, um eine Brühe, impfen die ausgebrütet wird, um genügend Host-Bakterien in der Log-Phase zum Test zu erhalten (Dies erfordert in der Regel 2-3 h Inkubation in einem schütteln Wasserbad auf 35-37 ° C).

1. Erhalten Sie eine Stichprobe von Abwasser oder wasserhaltigen Coliphage.
2. Verdünnen Sie die Probe 01:10 und 1: 100 mit Tris-Puffer. Zu diesem Zweck 1,0 mL der Kultur auf 9 mL Tris-Puffer übertragen und dann eine zweite 10-divisibel Verdünnung.
3. Schmelzen Sie drei Röhren des weichen Agar (0,7 % Nähragar oder Trypticase-Soja-Agar pro 3 mL-Tube), indem man sie in einem Dampfbad oder Autoklaven.
4. Legen Sie die Agar in einem Wasserbad bei 45-48 ° C für 15 min damit die Temperatur des Nährbodens zur Anpassung an 45 ° C.
5. Die erste Röhre zugeben Sie 1 mL eine Log-Phase Bouillonkultur von E. Coli¹ und 1 mL der unverdünnten Probe.
6. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Wasserbad und sanft Felsen zwischen den Händen, die Aufhängung für 2-3 s zu mischen.
7. Das Wasser aus dem Rohr mit einem Papiertuch abwischen und eine vorbereitete Petrischale mit Bottom-Agar (regelmäßige Nähragar oder Trypticase-Soja-Agar) Agar übergießen.
8. Drehen Sie schnell die Platte, um die obere Agar zu verbreiten. Achten Sie darauf, dass der Agar deckt die gesamte Fläche.
9. Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 8 mit den anderen beiden Rohren weichen Agar, mit 1 mL Bakterien und 1 mL pro Probenverdünnung (Abbildung 2).
10. Nachdem der Agar erstarrt ist, kehren die Petrischalen und Inkubation bei 37 ° C für 48 h. klopfen keine Feuchtigkeit aus dem Deckel der Petrischale. Fällt ein Tropfen Feuchtigkeit auf einer Plakette verursacht das Virus über die Agar-Oberfläche verteilt.
11. Nach der Inkubation die Anzahl der Plaketten auf jeder Verdünnung (Abbildung 3) und die Konzentration von Phagen in der ursprünglichen Probe zu berechnen. Größere Unterschiede in der Größe oder Aussehen der Plaques aufnehmen.

Abbildung 2. Verfahren zur Herstellung von einer bakteriellen Rasen mit obere Agar für die Coliphage-Enumeration.

Abbildung 3. Phagen-Plaketten auf einem bakteriellen Rasen.

¹ E. Coli -Stamm ATCC 15597 in der Regel wird die größte Anzahl von Plaques von Abwasserproben produzieren. Es sollten über Nacht in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben mit 100 mL des Nährstoffs oder Trypticase-Soja-Bouillon und unter Schütteln Bedingungen bei 35 ° c inkubierten angebaut werden 3 h vor der Phagen-Assay impfen 1 mL dieser Kultur in eine frische Flasche enthält 100 mL Nährstoff oder Trypticase-Soja-Bouillon und Ort in einem schütteln Wasserbad auf 35-37 ° C. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bakterien in der Log-Phase des Wachstums.

Verdünnung der Probe Abwasser = 10^-1

Anzahl der Plaketten erhalten = 9

Daher Phagen Konzentration im Abwasser Probe
10 x 9 ÷ = 1 mL
= 90 Plaque-bildenden Einheiten / mL

Rohabwasser enthält in der Regel 10³ – 10⁴ Coliphage pro mL, mit einer Reichweite von 10² – 10⁸ pro mL.

Es gibt viele Einsatzmöglichkeiten der Coliphages als Umweltindikatoren. Dazu gehören ihre Verwendung als Indikatoren für Abwasser Kontamination, Effizienz der Wasser- und Abwasserbehandlung sowie enterischen Viren und Bakterien in der Umwelt überleben. Die Verwendung von Bakteriophagen als Indikatoren für das Vorhandensein und das Verhalten der magensaftresistenten Bakterien und tierischen Viren seit jeher attraktiv wegen der Leichtigkeit, der Erkennung und low-cost Phagen-Assays zugeordnet. Darüber hinaus können sie in Umweltproben innerhalb von 24 h im Vergleich zu Tagen oder Wochen auf enterischen Viren quantifiziert werden.

¹ E. Coli -Stamm ATCC 15597 in der Regel wird die größte Anzahl von Plaques von Abwasserproben produzieren. Es sollten über Nacht in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben mit 100 mL des Nährstoffs oder Trypticase-Soja-Bouillon und unter Schütteln Bedingungen bei 35 ° c inkubierten angebaut werden 3 h vor der Phagen-Assay impfen 1 mL dieser Kultur in eine frische Flasche enthält 100 mL Nährstoff oder Trypticase-Soja-Bouillon und Ort in einem schütteln Wasserbad auf 35-37 ° C. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bakterien in der Log-Phase des Wachstums.