Detección de bacteriófagos en muestras ambientales

Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Alex Wassimi

Los virus son un grupo de entidades biológicas que infectan a los organismos eucariotas y procariotas. Son parásitos obligados que no capacidad metabólica y con el fin de replicar, se basan sobre el metabolismo del huésped para producir piezas virales que uno mismo-montan dentro de las células del huésped.

Los virus son ultramicroscópicos, demasiado pequeños para ser vistos con el microscopio de luz, visible sólo con la mayor resolución del microscopio electrónico. Una partícula viral consiste en un genoma de ácido nucleico, DNA o RNA, rodeado por una cubierta proteica, denominada cápside, compuesta por subunidades proteicas o capsómeros. En algunos virus más complejos, la cápside está rodeada por una envoltura de lípidos adicionales, y algunas tienen apéndices superficiales espiga o cola.

Virus que infectan el tracto intestinal de humanos y animales son conocidos como virus entéricos. Son excretados en las heces y puede ser aislados de las aguas residuales domésticas. Virus que infectan bacterias se denominan bacteriófagos, y los que infectan a las bacterias coliformes se llaman colífagos (figura 1). Los fagos de las bacterias coliformes se encuentran en cualquier lugar se encuentran las bacterias coliformes.

Figura 1. Colifago T2.

Bacteriófagos son estudiados en ciencias ambientales porque son un componente crítico de los sistemas biológicos. Son la entidad biológica más abundante en la tierra y son importantes ya que ayudan a controlar las poblaciones bacterianas, procesos tróficas, ciclos biogeoquímicos, así como mejoran la diversidad procariótica a través transferencia horizontal del gene. También hay evidencia de que los phages son indicadores sustitutos confiables para virus entéricos patógenos también heces-transmitidos pero difícil de ensayo. La disponibilidad de métodos relativamente rápidas y baratas para enumerar los bacteriófagos los hace una herramienta atractiva para la evaluación de contaminación fecal en muestras ambientales.

Se analizan colífagos en agua por la adición de una muestra suave o un agar de recubrimiento junto con una cultura de e. coli en la fase logarítmica de crecimiento. El phage de la una a la célula bacteriana y lisar las bacterias. Las bacterias producen un césped confluente de crecimiento excepto en áreas donde el fago ha crecido y lisis de las bacterias. Estas áreas claras resultantes se conocen como placas. Un recubrimiento de agar suave se utiliza para restringir la difusión física de los virus para que, con lisis de una bacteria, sólo puede propagarse a los vecinos las células bacterianas.

Para obtener la formación de placa óptima es importante que la bacteria del anfitrión es en la etapa de registro de crecimiento. Esto asegura que el fago fije para vivir bacterias y producir progenie. Esto requiere que un cultivo de bacterias de acogida preparada cada día en que se realice un ensayo. Por lo general, una cultura se incuba el día antes de la prueba para que se haga en la fase estacionaria. En el día del ensayo, la cultura se utiliza para inocular un caldo, que se incuba para obtener suficientes bacterias de anfitrión en la fase de registro para el ensayo (esto generalmente requiere 2-3 h de incubación en un baño a 35-37 ° C).

1. Obtener una muestra de aguas residuales o aguas que contienen colifago.
2. Diluir la muestra 1:10 y 1: 100 utilizando tampón Tris. Para ello, transferir 1,0 mL de cultivo a 9 mL de tampón Tris y luego hacer una dilución de 10 veces en segundo lugar.
3. Fundir los tres tubos de agar blando (0,7% de agar nutritivo o agar de soja trypticase por tubo de 3 mL) colocándolos en un baño de vapor o autoclave.
4. Ponga el agar en un baño de agua a 45-48 ° C por 15 min para permitir que la temperatura del agar a 45 ° C.
5. Al primer tubo agregar 1 mL de un cultivo en caldo fase log de e. coli¹ y 1 mL de muestra sin diluir.
6. Retire el tubo del baño de agua y suavemente roca entre las manos para mezclar la suspensión de s de 2-3.
7. Limpie el agua del tubo con una toalla de papel y verter el agar en una placa Petri previamente preparadas que contienen agar base (agar nutritivo regular o agar de soja trypticase).
8. Gire rápidamente la placa para difundir el agar superior. Asegúrese de que el agar cubre toda la superficie.
9. Repita los pasos 5-8 con los otros dos tubos de agar blando, utilizando 1 mL de bacterias y 1 mL de cada dilución de la muestra (figura 2).
10. Después de que se haya solidificado el agar, invertir las cajas Petri e incubar a 37 ° C por 48 h. golpee cualquier humedad de la tapa de la caja Petri. Si cae una gota de humedad en una placa hará que el virus se propague en toda la superficie del agar.
11. Después de la incubación, cuente el número de placas en cada dilución (figura 3) y calcular la concentración de fagos en la muestra original. Anotar las principales diferencias en el tamaño o aspecto de las placas.

Figura 2. Procedimiento para la preparación de un césped bacteriano usando top agar para el recuento de colifago.

Figura 3. Placas de fagos sobre un césped bacteriano.

¹ Cepa de e. coli ATCC 15597 generalmente produce el mayor número de placas de muestras de aguas residuales. Se debe cultivar durante la noche en un erlenmeyer de 250 mL que contenga 100 mL de caldo de nutrientes o tripticasa soya e incubados bajo condiciones de agitación a 35 ° C. 3 h antes del ensayo de fago inocular 1 mL de esta cultura en un fresco frasco que contenga 100 mL de caldo de nutrientes o tripticasa soya y el lugar en un baño a 35-37 ° C. Esto asegurará que las bacterias están en la fase logarítmica de crecimiento.

Dilución de muestras de aguas residuales = 10^-1

Número de placas obtenidas = 9

Por lo tanto, la concentración de fagos en muestra de aguas residuales
= 10 x 9 ÷ 1 mL
= 90 unidades formadoras de placas / mL

Aguas residuales normalmente contienen 10³ – 10⁴ colifago por mL, con una gama de 10² – 10⁸ / mL.

Hay muchas aplicaciones potenciales de colífagos como indicadores ambientales. Estos incluyen su uso como indicadores de contaminación de las aguas residuales, eficiencia de agua y tratamiento de aguas residuales y la supervivencia de virus entéricos y bacterias en el medio ambiente. El uso de bacteriófagos como indicadores de la presencia y comportamiento de las bacterias entéricas y virus animal siempre ha sido atractivo debido a la facilidad de detección y bajo costo relacionados con phage ensayos. Además, puede cuantificarse en muestras ambientales dentro de las 24 h en comparación con días o semanas en busca de virus entéricos.

¹ Cepa de e. coli ATCC 15597 generalmente produce el mayor número de placas de muestras de aguas residuales. Se debe cultivar durante la noche en un erlenmeyer de 250 mL que contenga 100 mL de caldo de nutrientes o tripticasa soya e incubados bajo condiciones de agitación a 35 ° C. 3 h antes del ensayo de fago inocular 1 mL de esta cultura en un fresco frasco que contenga 100 mL de caldo de nutrientes o tripticasa soya y el lugar en un baño a 35-37 ° C. Esto asegurará que las bacterias están en la fase logarítmica de crecimiento.