Cultivo y enumeración de bacterias a partir de muestras de suelo

Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Autores que demuestran: Bradley Schmitz y Luisa Ikner

Superficie de suelos es una mezcla heterogénea de partículas orgánicas e inorgánicas que se combinan juntos para formar agregados secundarios. Dentro y entre los agregados están vacíos o poros que visualmente contienen aire y agua. Estas condiciones crean un ecosistema ideal para las bacterias, todos los suelos contienen grandes poblaciones de bacterias, generalmente sobre 1 millón por gramo de suelo.

Las bacterias son los más simples de los microorganismos, conocidos como procariotas. Dentro de este grupo de procariota, existen los microbios filamentos conocidos como actinomicetos. Actinomicetos son realmente bacterias, pero con frecuencia se consideran ser un grupo único dentro de la clasificación de las bacterias debido a su estructura filamentosa, que consta de varias celdas ensartados a hifas de forma. Este experimento utiliza glicerol caso medios de comunicación que seleccionen para las colonias actinomycete, durante la dilución y chapado. Típicamente, los actinomicetos son aproximadamente el 10% de la población bacteriana total. Las bacterias y los actinomicetos se encuentran en cada ambiente de la tierra, pero la abundancia y diversidad de estos microbios en el suelo es incomparable. Estos microbios son también esenciales para la vida humana y afectan lo que la gente come, bebe, respira o toca. Además, hay especies bacterianas que pueden infectar a personas y causar enfermedad, y hay bacterias que pueden producir productos naturales capaces de curar personas. Actinomicetos son particularmente importantes para la producción de antibióticos como la estreptomicina. Las bacterias son críticas para el ciclismo, crecimiento vegetal y degradación de contaminantes orgánicos nutrientes.

Las bacterias son muy diversas en cuanto al número de especies que se pueden encontrar en el suelo, en parte porque están fisiológicamente y metabólicamente diversas. Las bacterias pueden ser heterótrofos, lo que significa que utilizan compuestos orgánicos como la glucosa, de alimentos y energía, o autótrofos, lo que significa que utilizan compuestos inorgánicos, como el azufre elemental, de alimentos y energía. También pueden ser aeróbicas, utilizando oxígeno para la respiración, o anaerobia, utilizando combinado formas de oxígeno, tales como nitrato o sulfato, que respira. Algunas bacterias pueden utilizar el oxígeno o combinan formas de oxígeno y se conocen como anaerobios facultativos.

Una forma de enumerar el número de bacterias presentes en una muestra de suelo es utilizar la dilución y la metodología de la galjanoplastia. Esta metodología utiliza agar como medio de crecimiento bacteriano, un proceso denominado "tecnología cultivable". Debido al gran número de bacterias que se encuentran en suelos, una pequeña muestra de suelo en serie se diluye en agua, antes de ser plateado en agar en una placa de Petri. Por lo general, una pequeña cantidad de suelo dentro de 0.1 a 1 mL de la suspensión de suelo diluido es "spread" sobre la superficie de la placa de agar. Las placas contienen agar, que es cuando fundido caliente, pero sólida cuando se enfríe. Además el agar, nutrientes, tales como levadura peptona o un producto comercialmente disponible como R₂A, se añaden al medio para permitir el crecimiento de bacterias heterotróficas.

Dilución y galjanoplastia es una tecnología relativamente simple y barata para la enumeración de bacterias del suelo. Sin embargo, hay varios inconvenientes a la técnica. Algunos errores comunes y supuestos asociados a los análisis de dilución y galjanoplastia son las siguientes: se supone que cada bacteria del suelo solo da lugar a una colonia, pero en realidad una colonia puede surgir de un grupo de células, resultando en una subestimación de la verdadera cuenta cultivable. Durante la dilución seriada del suelo, las partículas del suelo pueden se sedimentan (caída a la parte inferior), por lo que la alícuota real de suelo no se pasa la siguiente dilución. Muchos microbios del suelo son viables pero no cultivables. Bacterias de crecimiento lento pueden resultar no en colonias visibles en un plazo razonable (1-2 semanas).

También, las bacterias anaerobias no crecen en condiciones aerobias y bacterias que crecen son seleccionadas para por los nutrientes añadidos al medio. Por lo tanto R₂A selecciona para bacterias heterotróficas, mientras selecciona a azufre elemental para oxidantes de azufre autótrofos. En general, se estima que sólo el 0,1 a 1% de todas las bacterias del suelo pueden ser cultivado. Por lo tanto, la dilución y chapado de suelo bacterias sólo representa las bacterias cultivables y subestima la población de cierto suelo viable por una o dos órdenes de magnitud. En la figura 1se muestra un ejemplo de colonias de bacterias heterotróficas que resultó de la galjanoplastia y la dilución de suelo. Tenga en cuenta que aproximadamente 1 millón de células bacterianas se necesitan para que una colonia a ser visible a simple vista.

Este experimento demuestra la dilución y la metodología utilizada para enumerar el número de bacterias en una muestra de suelo de la galjanoplastia de la propagación. En concreto, se utilizan dos medios: uno diseñado para todas las bacterias y el otro que selecciona para actinomicetos. Una vez que las colonias bacterianas han crecido en las placas de agar, aislar los cultivos puros de colonias seleccionadas usando una técnica de placa de racha. Tales cultivos puros se pueden más analizados y caracterizados por las funciones y características específicas.

Figura 1. Colonias heterotróficas en un R₂una placa de agar. Surgen una serie de discretas colonias con morfología diversa después de dilución y chapado de suelo. Permiso de uso otorgado por Academic Press.

1. preparación de diluciones de suelo

1. Para comenzar el procedimiento, pesar 10 g de muestra de suelo y añadir a 95 mL de agua desionizada. Agite bien la suspensión y la etiqueta como "A".
2. Antes de que el suelo se instala, extraiga 1 mL de la suspensión con una pipeta estéril y transferir a un espacio en blanco de 9 mL de agua desionizada. Vórtice y la etiqueta "B".
3. Repita este paso de dilución tres veces, cada vez con 1 mL de la suspensión anterior y un 9 mL desionizada en blanco. Etiquetar estos secuencialmente como tubos de C, D y E. Esto se traduce en diluciones seriadas de 10^-1 a través de 10^-5 gramos de suelo por mL

2. hacer el extendido placas para cultivo bacteriano

1. Para hacer crecer colonias de bacterias, tomar tres placas de agar levadura peptona preparados y etiqueta como C, D y E. agitar las muestras C, D y E y pipeta de 0.1 mL en cada placa. Esto aumenta el valor de la dilución más, por un factor de diez (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. A continuación, sumerja un separador de cristal en etanol. Coloque el separador en una llama durante unos segundos para encender y quemar el etanol. Esto esterilizará el separador.
3. Mantenga el separador por encima de la primera placa hasta que la llama se extingue. Abra la placa rápidamente, manteniendo la tapa cerca de. Toque el separador para el agar de inóculo (inóculo = utilizadas para iniciar un cultivo de células) a enfriar y luego la gota de inóculo alrededor de la superficie del agar hasta que desaparezcan los rastros de líquido libre. Vuelva a colocar la tapa de la placa.
4. Volver a la llama el separador y repita el proceso con el próximo funcionamiento de la placa, rápidamente para que no se contamine el agar con organismos aerotransportados
5. Incubar las placas de las bacterias a temperatura ambiente durante 1 semana. Asegúrese de que las placas son invertidas durante la incubación para evitar gotas de humedad de la condensación caigan sobre la superficie del agar.

3. hacer el extendido placas para actinomicetos

1. Para crecer actinomicetos, tomar tres platos preparados glicerol-caseína y etiquetarlos como B, C y D. utilizando las técnicas mostradas anteriormente, coloque la placa 0,1 mL de las suspensiones B, C y D. Las diluciones más bajas se utilizan porque actinomicetos están típicamente presentes como 1/10^th de la población bacteriana (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Incubar las placas de Actinomiceto (invertidas) a temperatura ambiente durante 2 semanas.

4. bacterias y cuentas de Actinomiceto

1. Después de la incubación, examinar todas las placas bacterias cuidadosamente y tenga en cuenta las diferencias en forma y tamaño de la Colonia. Cuando se cultiva en agar, las bacterias producen colonias viscosos desde incoloro a color naranja brillante, amarillo o rosa. Por el contrario, actinomycete colonias son calcáreos, firme, correosa y se romperán bajo presión, donde otras colonias de bacterias se manchan. Esto permite distinguir por el tacto con un asa estéril colonias.
2. Cuente y anote el número de colonias bacterianas, incluyendo cualquier actinomicetos. Sólo contar las placas con 30-200 colonias por placa.

5. aislamiento de cultivos puros

1. Seleccione las colonias bacterianas individuales de cualquiera de las placas. Más colonias se pueden seleccionar si hay especial interés en el suelo. Utilice una placa de alta dilución, ya que tiende a tener colonias puras que se separan bien. Seleccionar sólo las colonias que están muy separadas de colonias vecinas y parecen morfológicamente distintos unos de otros.
2. Esterilice el asa por inmersión en alcohol y flamearlo. Rápidamente Abra la caja Petri de interés y toque el lazo a un lugar pelado en el agar para enfriarlo. Luego, extraer una pequeña cantidad de una colonia de interés en el bucle.
3. Tomar una placa de peptona-levadura fresca, hacer una racha de unos pocos centímetros de un lado. Esterilizar y enfriar otra vez, y hacer una raya que cruza la franja inicial sólo en la primera pasada. Repita este proceso dos veces más de la misma manera. Este talento "dilución" produce en las células en el lazo de ser separados uno del otro. Coloque la placa en un lugar oscuro a incubar a temperatura ambiente durante dos semanas.

Se analiza una muestra de 10 g de suelo con un contenido de humedad del 20% sobre una base de peso seco para bacterias viables cultivables mediante dilución y técnicas de la galjanoplastia. Las diluciones se hicieron como se muestra en la tabla 1. 1 mL de solución E es plateado de vierte en un medio apropiado y resulta en 200 colonias bacterianas.

Pero, para 10 g de suelo húmedo,

Por lo tanto,

Tabla 1: dilución y placas de las muestras.

Hay dos aplicaciones fundamentales de dilución y galjanoplastia de bacterias del suelo. La primera aplicación es la enumeración de bacterias cultivables en un suelo particular. La cuantificación del número de bacterias del suelo da una indicación de la salud del suelo. Por ejemplo, si hay 10⁶ a 10⁸ bacterias cultivables presentes por gramo de suelo, esto se consideraría un número saludable. A menos de 10 del número⁶ por gramo indica pobre salud del suelo, que puede ser debido a la falta de nutrientes que se encuentran en suelos de poca materia orgánica; estrés abiótico impuestas por valores de pH de suelo extremas (pH < 5 o > 8); o toxicidad por contaminantes antropogénicos orgánicos o inorgánicos.

La segunda aplicación importante es la visualización y el aislamiento de cultivos puros de bacterias. Los cultivos puros posteriormente pueden caracterizados y evaluados para características específicas que pueden ser útiles en aplicaciones médicas o ambientales. Ejemplos: producción de antibióticos; biodegradación de compuestos orgánicos tóxicos; o rizobios específicos útiles para la fijación de nitrógeno por los cultivos de leguminosas, como guisantes o judías.