Este protocolo apresenta uma ferramenta rápida e útil para avaliar o papel de uma proteína com função não caracterizada na regulação alternativa de emenda após o tratamento quimioterápico.

O processamento de mRNA envolve múltiplas etapas simultâneas para preparar o mRNA para tradução, como 5'capping, adição poli-A e emenda. Além do emendamento constitutivo, o emendamento alternativo de mRNA permite a expressão de proteínas multifuncionais de um gene. Como os estudos interactome são geralmente a primeira análise para proteínas novas ou desconhecidas, a associação da proteína isca com fatores de emenda é uma indicação de que ela pode participar do processo de emenda mRNA, mas determinar em que contexto ou quais genes são regulados é um processo empírico. Um bom ponto de partida para avaliar esta função é usar a ferramenta minigene clássica. Aqui apresentamos o uso de minigene Adenoviral E1A para avaliar as mudanças alternativas de emenda após diferentes estímulos de estresse celular. Avaliamos o splicing de minigene E1A em HEK293 exprimidamente superexpressando proteína Nek4 após diferentes tratamentos de estresse. O protocolo inclui transfecção de minigene E1A, tratamento celular, extração de RNA e síntese de CDNA, seguido de análise de PCR e gel e quantificação das variantes emendadas E1A. O uso deste método simples e bem estabelecido combinado com tratamentos específicos é um ponto de partida confiável para lançar luz sobre processos celulares ou quais genes podem ser regulados por emendas mRNA.

O splicing está entre os passos mais importantes no processamento de mRNA eucariótico que ocorre simultaneamente ao capping de 5'mRNA e à poliadenilação de 3'mRNA, compreendendo a remoção de intron seguido de junção exon. O reconhecimento dos locais de emenda (SS) pelo emendatório, um complexo ribonucleoproteíno contendo pequenas ribonucleoproteínas (snRNP U1, U2, U4 e U6), pequenas RNAs (snRNAs) e várias proteínas regulatórias¹ é necessário para emendas.

Além da remoção intron (emendas constitutivas), em eucariotes, os introns podem ser retidos e os exons podem ser excluídos, configurando o processo chamado emenda alternativa mRNA (AS). A emenda pré-mRNA alternativa expande a capacidade de codificação de genomas eucarióticos permitindo a produção de um grande e diversificado número de proteínas de um número relativamente pequeno de genes. Estima-se que 95-100% dos mRNAs humanos que contêm mais de um exon podem passar por emendas alternativas^2,3. Isso é fundamental para processos biológicos como desenvolvimento neuronal, ativação da apoptose e resposta ao estresse celular^4,fornecendo ao organismo alternativas para regular o funcionamento celular usando o mesmo repertório de genes.

O maquinário necessário para emendas alternativas é o mesmo utilizado para emendas constitutivas e o uso da SS é o principal determinante para a ocorrência alternativa de emendas. O splicing constitutivo está relacionado ao uso de locais de emenda forte, que geralmente são mais semelhantes aos motivos de consenso para o reconhecimento de^{emendas 5}.

Exons alternativos são tipicamente reconhecidos de forma menos eficiente do que os exons constitutivos uma vez que seus elementos cis-regulatórios,as sequências em 5'SS e 3'SS flanqueando esses exons, mostram uma capacidade de ligação inferior ao emendatório. O mRNA também contém regiões denominadas enhancers ou silenciadores localizados em exons (aprimoramentos de emendas exônicas (ESEs) e silenciadores de emenda exônica (ESSs)) e introns (aprimoramentos de emendas intrônicas (ISEs) e silenciadores de emenda intrônica (ISSs)) que melhoram ou reprimem o uso de exon,^{respectivamente 5}. Essas sequências são reconhecidas por elementos trans-regulatórios, ou fatores de emenda (SF). As SFs são representadas principalmente por duas famílias de proteínas, os fatores de emenda rico em serina/arginina (SRSFs) que se ligam aos ESEs e à família de ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas (hnRNPs) que se ligam às sequências de ESSs⁵.

O splicing alternativo pode ser modulado por fosforilação/desfosforilação de trans-fatores que modificam os parceiros de interações e localização celular dos fatores de emenda^6,7,8. Identificar novos reguladores de fatores de emenda podem fornecer novas ferramentas para regular o splicing e, consequentemente, alguns tratamentos contra o câncer.

Anufrieva et al.⁹, em um perfil de expressão genética de microarray mRNA, observaram mudanças consistentes nos níveis de componentes spliceossômicos em 101 linhas celulares e após diferentes condições de estresse (drogas à base de platina, irradiação gama, inibidores de topoisomerase, inibidores de quinase tyrosina e impostos). A relação entre padrão de emenda e eficácia da quimioterapia já foi demonstrada em células cancerígenas de pulmão, que são resistentes à quimioterapia, mostrando alterações na taxa de variantes caspase-9¹⁰. As células HEK293 tratadas com o painel de quimioterapia mostram mudanças no splicing com um aumento nas variantes pró-apoptóticas. Gabriel et al.¹¹ observaram alterações em pelo menos 700 eventos de emenda após o tratamento de cisplatina em diferentes linhas celulares, apontando que as vias de emenda são afetadas pela cisplatina. Moduladores de emenda já demonstraram atividade anti-tumoral, mostrando que o splicing é importante para o desenvolvimento tumoral e, principalmente, a resposta à quimioterapia¹². Por isso, caracterizar novas proteínas que regulam o splicing após agentes estressores celulares, como a quimioterapia, é muito importante para descobrir novas estratégias de tratamento.

As pistas de regulação alternativa de emendas a partir de estudos interactome, particularmente importantes para caracterizar funções de proteínas novas ou não caracterizadas, podem exigir uma abordagem mais geral e simples para verificar o real papel da proteína em AS. Minigenes são ferramentas importantes para a análise do papel geral de uma proteína que afeta a regulação do splicing. Eles contêm segmentos de um gene de interesse contendo regiões genômicas emendadas e flanqueadas¹³. O uso de uma ferramenta minigene permite a análise do splicing in vivo com diversas vantagens, como o comprimento do minigene que é menor e, portanto, não é uma limitação à reação de amplificação; o mesmo minigene pode ser avaliado em diferentes linhas celulares; todos os componentes celulares, principalmente sua regulação da modificação pós-translacional (fosforilação e alterações nos compartimentos celulares) estão presentes e podem ser abordados^13,14. Além disso, mudanças no padrão alternativo de emenda podem ser observadas após o estresse celular e, o uso de um sistema minigene, permitem identificar a via que está sendo modulada por diferentes estímulos.

Existem vários sistemas de minigene já descritos que são específicos para diferentes tipos de eventos de emenda^13,14, no entanto, como um ensaio preliminar, o minigene E1A¹⁵ é um sistema de repórteres alternativo muito bem estabelecido para o estudo da seleção de 5 SS in vivo. De apenas um gene, E1A, cinco mRNAs são produzidos por emenda alternativa com base na seleção de três diferentes locais de emenda de 5′ e de um local de emenda maior ou um menor de 3′^16,17,18. A expressão das variantes E1A muda de acordo com o período de infecção adenoviral^19,20.

Já mostramos anteriormente que tanto os isoformes nek4 interagem com fatores de emenda como SRSF1 e hnRNPA1 e, embora a isoforme 2 mude o emendamento alternativo minigene E1A, o isoforme 1 não tem efeito nesse²¹. Como o isoforme 1 é a isóforme mais abundante e altera a resistência à quimioterapia e a resposta a danos no DNA, avaliamos se ele poderia mudar a emenda alternativa minigene E1A em uma condição de estresse.

O ensaio minigene é um método simples, de baixo custo e rápido, uma vez que só precisa de extração de RNA, síntese de CDNA, amplificação e análises de gel de agarose, e pode ser uma ferramenta útil para avaliar, uma vez que um possível efeito sobre a emenda alternativa por uma proteína de interesses até o efeito de diferentes tratamentos no padrão de emenda alternativa celular.

1. Células de chapeamento

NOTA: Neste protocolo descrito, foram utilizadas linhas de células estáveis HEK293, anteriormente geradas para expressão indutível estável de Nek4²¹, porém, o mesmo protocolo é adequado para muitas outras linhas celulares, tais como HEK293²², HeLa^23,24,25,26, U-2 OS²⁷, COS7²⁸, SH-SY5Y²⁹. O padrão de expressão dos isoformes minigene E1A em condições basais varia entre essas células e deve ser caracterizado para cada condição. Este protocolo não se limita a linhas de células estáveis. A abordagem mais comum na avaliação da proteína candidata é pela co-transfecção transitória de aumentar sua quantidade com quantidade fixa do minigene. O mesmo protocolo é adequado para células eliminatórias.

1. Células de placa considerando controles de veículos, não transtraídos e GFP.
2. Cultura HEK293 células com expressão estável do gene de interesse no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 4,5 g/L de glicose, 4 mM L-Glutamina e manter com 100 μg/mL de higimicincina B, em placas tratadas com cultura tecidual a 37 °C em 5% DE CO₂ e atmosfera umidificada.
3. Células divididas usando 0,25% de trippsina-EDTA. Placa 3 x 10⁵ células em placas de 6 poços e incuba-las por 24 h a 37 °C em 5% DE CO₂.
   NOTA: Para a transfecção, as células devem ser 70-80% confluentes para diminuir a morte celular após a transfecção.

2. Transfecção celular

NOTA: 1-2 μg de pMTE1A minigene plasmid foi usado aqui, porém a quantidade de DNA, bem como o tempo de expressão, deve ser mantida no mínimo para evitar a toxicidade. Por exemplo, alta toxicidade foi observada em células HeLa após 30h de transfecção com 1 μg de DNA pMTE1A. Para a transfecção aqui descrita, foi usado um reagente de transfecção à base de lipídio

1. Verifique a confluência celular 24 h após o revestimento e transfecte células estáveis HEK293 somente quando 70-80% confluentes.
2. Remova o meio de cultura celular cuidadosamente com uma pipeta, em vez de usar um sistema de bomba de vácuo. Em seguida, adicione cuidadosamente 2 mL de meio DMEM completo sem antibióticos e coloque a placa de volta na incubadora.
3. Prepare um tubo com o tampão de transfecção (200 μL/well), adicione 2 μg de DNA pMTE1A, vórtice e adicione 2 μL de reagente de transfecção. Vórtice novamente e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
4. Retire as placas da incubadora e adicione cuidadosamente a mistura de transfecção dropwise.
5. Às células estáveis HEK293, adicione tetraciclina (0,5 μg/mL) para indução de expressão de Nek4 6 h após a transfecção. Mudanças médias não são necessárias.
   NOTA: Os volumes/quantidades descritos nesta seção são para um bem. Prepare a mistura para todos os poços utilizados no experimento no mesmo tubo.
6. Prepare um poço para transfectar com eGFP, ou outro fluorforeiro expressando plasmídeo para estimar a eficiência de transfecção. Melhores resultados podem ser observados com eficiência de transfecção de pelo menos 40%, mas foram observados bons desempenhos com menor eficiência de transfecção.
7. Ao usar a co-transfecção (proteína de interesse e minigene) mantenha um poço com células não transfectadas para evitar obter resultados de mRNA endógeno. No caso do E1A, as células HEK293 já expressam o gene E1A³⁰.

3. Preparando as drogas

NOTA: O tempo e a concentração do tratamento foram escolhidos com base nos resultados da literatura, que apontam mudanças no splicing alternativo para alguns genes.

1. Realize uma curva dose-resposta antes de iniciar o ensaio para determinar a concentração mínima para indução alternativa de emenda sem efeito na viabilidade celular.
2. Prepare uma solução de estoque paclitaxel a 5 mM de concentração de etanol. A concentração final é de 1 μM. Mantenha-se a -20 °C. Use 0,02% de etanol como controle de veículos.
3. Prepare uma solução de cisplatina diluindo em 0,9% NaCl em torno de 0,5 mg/mL (1,66 mM). Proteja contra luz, vórtice e incubar em um banho térmico, 37 °C por 30 min. A concentração final é de 30 μM. Prepare fresco ou armazene a 2-10 °C por até um mês.
   NOTA: Todas as drogas devem ser protegidas da luz.

4. Tratamento e coleta celular

NOTA: As células estáveis HEK293 foram coletadas 48 h após a transfecção e para isso foram tratadas 24h após a transfecção porque o maior nível de expressão nek4 é alcançado dentro de 48 h. No entanto, foram observados níveis elevados de expressão isoforme 13S (até 90%) neste momento. Para diminuir a proporção de isoforme 13S, tente tratar e coletar células 30 h após o máximo de transfecção.

1. Use dicas e tubos gratuitos RNA/DNase. Realize a extração total de RNA com reagente fenol-clorofórmio seguindo a recomendação do fabricante.
2. 24 h após a transfecção, verifique a morfologia celular e a eficiência da transfecção usando um microscópio fluorescente.
3. Remova o meio de cultura celular, usando preferencialmente uma pipeta em vez de um sistema de bomba de vácuo. Em seguida, adicione o meio de cultura celular com a quimioterápico na concentração final descrita anteriormente.
4. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ para 18 - 24 h.
5. Colete RNA descartando o meio de cultura celular em um recipiente e adicionando 0,5 - 1 mL de reagente de extração de RNA diretamente ao poço. Se os poços forem muito confluentes, use 1 mL de reagente de extração de RNA para melhorar a qualidade do RNA.
6. Homogeneize-se com a pipeta e transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado armazenando amostras a -80 °C ou prosseguir imediatamente para a extração de RNA.
   ATENÇÃO: O reagente de extração de RNA à base de fenol é tóxico e todos os procedimentos devem ser realizados em uma capa de fumaça química e os resíduos descartados corretamente.

5. Extração de RNA e síntese de CDNA

1. Em um capô de fumaça descongele as amostras e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Adicione 0,1 -0,2 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente.
2. Incubar por 3 minutos em temperatura ambiente.
3. Centrifugar por 15 min a 12.000 x g e 4 °C.
4. Colete a fase aquosa superior e transfira para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL. Coletar cerca de 60% do volume total; no entanto, não coletar o DNA ou a fase orgânica (inferior).
5. Adicione 0,25 - 0,5 mL de isopropanol e agitar pela inversão 4 vezes. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
6. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min, a 4 °C e descartar o supernaspe.
7. Lave a pelota de RNA duas vezes com etanol (75% em água tratada com dietilpirato (DEPC). Centrifugar a 7.500 x g por 5 min e descartar o etanol.
8. Remova o excesso de etanol invertendo o tubo em um papel toalha e deixe o tubo aberto dentro de um capô de fumaça para secar parcialmente a pelota por 5 - 10 min.
9. Resuspend a pelota de RNA em 15 μL de água tratada com DEPC.
10. Quantifique o RNA total usando absorvância em 230 nm, 260 nm e 280 nm para verificar a qualidade do RNA.
11. Para verificar a qualidade total do RNA, execute um gel de 1% de agarose pré-tratado com 1,2% (v/v) de uma solução de hipoclorito de sódio de 2,5% por 30 min³¹.
12. Realize a síntese de CDNA usando 1-2 μg de RNA total.
    1. Pipeta RNA, 1 μL de oligo-dT (50 μM), 1 μL de dNTP (10 mM) e compõem o volume a 12 μL com água livre de nuclease. Incubar no termociclador por 5 min a 65 °C.
    2. Remova amostras do termocicl para esfriar e prepare a mistura de reação: 4 μL de tampão de transcriptase reversa, 2 μL de dithiothreitol (DTT) e 1 μL de inibidor de ribonuclease. Incubar a 37 °C por 2 min.
    3. Adicione 1 μL de transcriptase reversa termoestabilidade. Incubar a 37 °C por 50 min e inativar a enzima a 70 °C por 15 min.
       NOTA: O cDNA pode ser armazenado a -20 °C por várias semanas. Realize um controle de transcriptase não reversa (NRT) para contaminação genômica por discriminação de eventos putativos de retenção de intron.

6. pMTE1A minigene PCR

1. Execute o PCR com a composição de reação (1,5 mM de MgCl₂, 0,3 mM de mix dNTP, 0,5 μM de cada primer, 2,5 U de uma polimerase Taq de partida quente e 150 ng de cDNA) com as seguintes condições:
   94 °C por 2 min, 29 ciclos de: 94 °C para 1 min, 50 °C para 2 min, 72 °C para 2 min, 72 °C para 10 min.
2. Carregar 20-25 μL do produto PCR em um gel de 3% de agarose contendo mancha de ácido nucleico e funcionar a 100 V por aproximadamente 1 h.

7. Análise do gel utilizando um software de processamento e análise de imagem³²

1. Após a execução, fotografe o gel (usando um sistema de aquisição de imagens de gel) evitando qualquer saturação de banda e quantifique as bandas usando um software de processamento de imagem.
2. Para quantificação considere as bandas em ~631 bp, ~493 bp, e ~156 bp para corresponder aos isoforms 13S, 12S e 9S, respectivamente.
3. No menu Arquivo do software, abra o arquivo de imagem obtido do sistema de aquisição de imagens. Converta-se em escala de cinza, ajuste o brilho e o contraste e remova o ruído mais estranho, se necessário.
4. Desenhe um retângulo ao redor da primeira faixa com a ferramenta Seleção de Retângulo e selecione-o através da | Géis | Selecione o comando First Lane ou pressionando o atalho do teclado para ele.
5. Use o mouse para clicar e segurar no meio do retângulo na primeira pista e arrastá-lo para a próxima pista. Vá para Analisar | Géis | Selecione Next Laneou pressione o atalho disponível. Repita este passo para todas as faixas restantes.
6. Depois de todas as faixas serem destacadas e numeradas, vá para Analisar | Géis | Plot Lanes para desenhar um enredo de perfil de cada pista.
7. Com a ferramenta de seleção de linha reta, desenhe uma linha através da base de cada pico correspondente a cada banda, deixando de fora o ruído de fundo. Depois de todos os picos, de todas as pistas, foi fechado, selecione a ferramenta Varinha e clique dentro de cada pico. Para cada pico que destacou, as medidas devem aparecer na janela Resultados que aparece.
8. Soma a intensidade de todas as 3 bandas para cada amostra e calcule a porcentagem de cada isoforme em relação ao total.
9. Plote as porcentagens de cada isoforme ou as diferenças na porcentagem em relação às amostras não tratadas.
   NOTA: Certifique-se de que a soma das três variantes E1A deve ser igual a 100%.

Um ensaio de 5' locais de emenda utilizando minigene E1A foi realizado para avaliar mudanças no perfil de emenda nas células após a exposição da quimioterapia. O papel de Nek4 - isoform 1 na regulação AS em células estáveis HEK293 após o tratamento paclitaxel ou cisplatina foi avaliado.

A região Adenoviral E1A é responsável pela produção de três mRNAs principais de um precursor de RNA devido ao uso de diferentes doadores de emendas. Eles compartilham termini comuns de 5' e 3', mas diferem no tamanho de seus introns excisados. Os MRNAs Adenoviral E1A são nomeados de acordo com seus coeficientes de sedimentação, 13S, 12S e 9S. Durante a fase inicial da infecção pelo adenovírus (em torno de 7 h), são produzidas proteínas importantes para preparar a célula infectada para a replicação do DNA viral (13S - 723 aa e 12S - 586 aa) e, na fase final (cerca de 18 h) além delas, uma pequena proteína (9S -249 aa) é produzida²⁰. Utilizando um plasmídeo contendo o minigene de E1A, o efeito sobre o splicing alternativo pode ser observado nas células após a transfecção avaliando a proporção de mRNA de cada isoforme produzido: 13S: 631 bp, 12S: 493 bp e 9S 156 bp(Figura 1A e B).

A expressão basal das variantes isoformas E1A depende da linha celular e do tempo de expressão E1A. Observou-se que a linha celular hek293-estável (HEK293-Flag) ou hek293 recombinase contendo o local (HEK293-FRT - a linha celular original) mostra uma expressão mais elevada de 13S em comparação com as células HeLa (HeLa-PLKO) que mostram níveis semelhantes de isoforms 13S e 12S após 48 h de expressão E1A (Figura 1C e D).

O alto nível de expressão 13S observado em células estáveis HEK293 é consideravelmente diminuído em tempos mais curtos de expressão E1A (cerca de 30 h). A proporção (%) de 13S:12S:9S às 30h e 48h é 60:33:7 e 80:15:5, respectivamente (dados não apresentados). Por essa razão, é importante caracterizar o perfil de emenda do minigene celular basal E1A antes de iniciar os experimentos.

As células expostas à cisplatina apresentaram uma mudança na seleção de emendas SS 5 favorecendo a expressão 12S (um aumento de cerca de 15% em comparação com células não tratadas). Este efeito foi observado em HEK293 expressando o vetor vazio da Bandeira, bem como isoforme 1 de Nek4. Quando observam grandes mudanças no percentual de expressão, um parcela com percentuais representa claramente os resultados (Figura 2).

Ao comparar duas condições (bandeira e nek4 sobreexpressão) respondendo a um tratamento, geralmente a melhor maneira de representar os dados é traçando as diferenças em um gráfico, porque o nível basal de expressão pode ser diferente, e os percentuais não refletirão o efeito real do tratamento. Isso pode ser observado na Figura 3. As mudanças no AS após o tratamento paclitaxel foram muito discretas, mas as direções das mudanças foram as opostas nas células expressas Flag e Nek4.

Apesar das pequenas alterações após o tratamento, os resultados foram consistentes, indicando que o tratamento paclitaxel leva a uma diminuição na isoforme 13S, com aumento em células expressas de bandeira 12S e 9S, enquanto, por outro lado, nas células expressas nek4, observa-se o efeito oposto.

Figura 1: O padrão de emenda minigene E1A depende da linha celular. A) Representação esquemática dos sítios de emenda minigene E1A. As setas indicam a região de ressaramento do primer para amplificação de isoformes minigene E1A. B) Isoforms gerados a partir de emendas alternativas de minigene E1A. C) HEK293 expressando compunção o vetor vazio da Bandeira (HEK293 -Flag), HeLa transfectado com vetor PLKO (HeLa - PLKO) ou, HEK293 recombinase-contendo sites (a partir do que HEK293 expressando bandeira ou Nek4.1 foram gerados - HEK293-FRT) foram transfectados com plasmídeo pMTE1A. 48h após a transfecção total RNA foi isolado e isoforms E1A foram separados em gel de agarose(D). Gráfico comparando a porcentagem de isoformes 13S, 12S e 9S em células HEK293-Flag e HeLa-PLKO em condições basais. Dados de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Efeito do tratamento de cisplatina no padrão de emenda minigene E1A. HEK293 expressando o vetor vazio bandeira (Flag) ou a tag Bandeira Nek4.1 fundida, foram transfectados com plasmídeo pMTE1A. Seis horas após a tetraciclina de transfecção foi adicionada à indução da expressão proteica. 24 h a 48 h, o meio de cultura celular foi substituído por meio contendo 30 μM de Cisplatina. Após 24 h de incubação, o RNA total foi extraído e os produtos de PCR foram separados em 3% de gel de agarose. A) São retratados isoforms predominantes minigene E1A. Os gráficos B-D representam a % de cada isoforme em relação à soma de três variantes (13S, 12S e 9S). Em E,a diferença no percentual de expressão para cada isoforme é apresentada em relação ao controle do veículo (médio). Os gráficos são apresentados como a média e o SEM de três experimentos independentes. * p< 0,05, ** p<0.01 em teste t não pago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Efeito do tratamento paclitaxel no padrão de emenda minigene E1A. HEK293 expressando o vetor vazio bandeira (Flag) ou Nek4.1 Flag fundido, foram transfectados com plasmídeo pMTE1A. Seis horas após a tetraciclina de transfecção foi adicionada à indução da expressão proteica. 24h a 48h, o meio de cultura celular foi substituído por meio contendo 1 μM de Paclitaxel ou etanol (0,02%) utilizado como controle veicular. Após 24 h de incubação, o RNA total foi extraído e os produtos de PCR foram separados em 3% de gel de agarose. A) Isoforms predominantes são retratados. Os gráficos B-D representam a % de cada isoforme em relação à soma de três variantes (13S, 12S e 9S). Em E,a diferença no percentual de expressão para cada isoforme é apresentada em relação ao controle do veículo (etanol). Os gráficos são apresentados como a média e o SEM de três experimentos independentes. * p< 0,05 em teste t não pago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Minigenes são ferramentas importantes para determinar os efeitos no splicing alternativo global in vivo. O minigene adenoviral E1A tem sido usado com sucesso há décadas para avaliar o papel das proteínas, aumentando a quantidade delas na célula^13,14. Aqui, propomos o uso de minigene E1A para avaliar emendas alternativas após exposição quimioterápica. Uma linha de célula estável expressando isoforme Nek4 1 foi usada, evitando os artefatos de superexpressão causados pela transfecção transitória. A isóforma 1 do Nek4 não mostrou efeito no minigene E1A alternativo em condições basais²¹, mas tem muitos interagidores relacionados a emendas, permitindo- nos avaliar o efeito específico do tratamento quimioterápico em emenda alternativa E1A nessas células.

Apesar de sua baixa sensibilidade, principalmente em comparação com abordagens radioativas, o método descrito aqui é simples e não requer reagentes especiais ou condições laboratoriais. No entanto, é importante notar que o minigene E1A é um repórter global das seleções 5 SS, embora a seleção de 3 SS possa ser avaliada com este protocolo o repórter minigene específico deve ser usado^14,33,34. Além disso, os resultados podem ser influenciados pela linha celular e devem ser cuidadosamente avaliados para evitar interpretações erradas devido ao perfil de emenda alternativa basal.

Geralmente, grandes diferenças no padrão de emenda minigene E1A são observadas apenas ao alterar a expressão de fatores de emenda. Outras mudanças são menos óbvias devido ao grande número de proteínas que modulam a atividade desses fatores. Por essa razão, ao iniciar os estudos para um candidato indireto, a abordagem clássica, baseada no aumento das quantidades dessa proteína candidata deve ser preferida. Quando algum efeito é observado, os tratamentos podem ser realizados para explorar se a regulação pode ser específica para um estímulo celular específico.

Após um resultado positivo preliminar, a padronização do tempo e da concentração de medicamentos pode ser realizada para otimizar o experimento.

Este protocolo simples é um ensaio preliminar, um ponto de partida que pode responder se a proteína de interesse mostra um efeito no emenda alternativo e também, quando algum efeito na regulação alternativa de emenda já é conhecido, pode direcionar os estudos para o caminho mais consistente onde a proteína desempenha um papel regulando a emenda alternativa na resposta à quimioterapia.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), por meio do Grant Temático 2017/03489-1 ao JK e à bolsa da FLB 2018/05350-3) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) para financiar essa pesquisa. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Adrian Krainer por fornecer o plasmídeo pMTE1A e Zerler e colegas por seu trabalho na clonagem E1A. Agradecemos também ao Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti e Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller para permitir que usem seu espaço de laboratório e equipamentos.