يقدم هذا البروتوكول أداة سريعة ومفيدة لتقييم دور البروتين مع وظيفة غير مطهرة في تنظيم الربط البديل بعد العلاج الكيميائي.

تتضمن معالجة الحمض النووي الريبي خطوات متعددة في وقت واحد لإعداد مرنا للترجمة، مثل 5'capping، إضافة متعددة A والربط. وإلى جانب الربط التأسيسي، يسمح الربط البديل من الحمض النووي الريبي بالتعبير عن البروتينات متعددة الوظائف من جين واحد. كما دراسات interactome عموما التحليل الأول للبروتينات الجديدة أو غير معروفة، وارتباط بروتين الطعم مع عوامل الربط هو مؤشر على أنه يمكن أن تشارك في عملية الربط ميرنا، ولكن لتحديد في أي سياق أو ما هي الجينات التي تنظم هي عملية تجريبية. نقطة انطلاق جيدة لتقييم هذه الوظيفة هو استخدام أداة مينيجين الكلاسيكية. هنا نقدم استخدام مينيجين E1A أدينوفيرالي لتقييم التغييرات الربط البديلة بعد محفزات الإجهاد الخلوية المختلفة. قمنا بتقييم الربط من E1A minigene في HEK293 الإفراط في التعبير عن بروتين Nek4 بعد علاجات الإجهاد المختلفة. ويشمل البروتوكول E1A minigene transfection، والعلاج الخلوي، واستخراج الحمض النووي الريبي وتوليف cDNA، تليها PCR وتحليل هلام وتكميم المتغيرات E1A مقسمة. استخدام هذه الطريقة البسيطة والراسخة جنبا إلى جنب مع علاجات محددة هو نقطة انطلاق موثوقة لتسليط الضوء على العمليات الخلوية أو ما هي الجينات التي يمكن تنظيمها عن طريق الربط ميرنا.

الربط هو من بين أهم الخطوات في معالجة الحمض النووي الريبي eukaryotic الذي يحدث في وقت واحد إلى 5'mRNA توج و3'mRNA polyadenylation، تتألف من إزالة intron تليها تقاطع exon. الاعتراف مواقع الربط (SS) من قبل الربط، وهو مجمع ريبونوكليوبروتين تحتوي على البروتينات الريبونوكليوبروتين الصغيرة (snRNP U1، U2، U4 و U6)، والحمض النووي الريبي الصغيرة (snRNAs) والعديد من البروتينات التنظيمية¹ ضروري للربط.

إلى جانب إزالة intron (الربط التأسيسي) ، في eukaryotes ، يمكن الاحتفاظ introns ويمكن استبعاد exons ، وتكوين عملية تسمى mRNA الربط البديل (AS). توسيع الربط البديل قبل مرنا القدرة على الترميز من الجينوم eukaryotic السماح لإنتاج عدد كبير ومتنوع من البروتينات من عدد قليل نسبيا من الجينات. وتشير التقديرات إلى أن 95-100٪ من mRNAs الإنسان التي تحتوي على أكثر من exon واحد يمكن أن تخضع للصق بديل^2،3. وهذا أمر أساسي للعمليات البيولوجية مثل تطوير الخلايا العصبية، وتنشيط موت الخلايا المبرمج واستجابة الإجهاد الخلوي^4،وتوفير بدائل الكائن الحي لتنظيم عمل الخلية باستخدام نفس ذخيرة الجينات.

الآلات اللازمة للربط البديل هي نفسها المستخدمة في الربط التأسيسي واستخدام SS هو المحدد الرئيسي لحدوث الربط البديل. الربط التأسيسي يرتبط باستخدام مواقع الربط القوية ، والتي عادة ما تكون أكثر تشابها مع الزخارف التوافقية للاعتراف باللصق^5.

وعادة ما يتم التعرف على exons البديلة أقل كفاءة من exons التأسيسية مرة واحدة في رابطة الدول المستقلة- العناصر التنظيمية ، وتسلسل في 5 SS و 3 SS يحيط هذه exons ، وتظهر قدرة ملزمة أدنى إلى الربط. يحتوي مرنا أيضا على مناطق تسمى القدرة أو كواتم الصوت الموجودة في exons (معززات الربط exonic (ESEs) وكاتم الصوت اللصق exonic (ESSs)) و introns (القدرة على الربط intronic (ISEs) وكاتم الصوت الربط intronic (ISSs)) التي تعزز أو قمع استخدام exon، على التوالي⁵. يتم التعرف على هذه التسلسلات من خلال العناصر العابرة للتنظيم، أو عوامل الربط (SF). يتم تمثيل SFs بشكل رئيسي من قبل عائلتين من البروتينات ، وعوامل الربط الغنية بالسرين / الأرجينين (SRSFs) التي ترتبط ب ESEs وعائلة البروتينات الريبونوكليوبروتية النووية غير المتجانسة (hnRNPs) التي ترتبط بتسلسل ESSs^5.

يمكن تعديل الربط البديل عن طريق الفوسفور / إزالة الفوسفور من العوامل العابرة لتعديل شركاء التفاعلات والتوطين الخلوي لعوامل الربط^6و7و8. ويمكن أن يوفر تحديد منظمين جدد لعوامل الربط أدوات جديدة لتنظيم الربط، وبالتالي بعض علاجات السرطان.

أنوفرييفا وآخرون.⁹, في صورة التعبير الجيني ميكروراي مرنا, لاحظت تغييرات متسقة في مستويات المكونات اللصق في 101 خطوط الخلية وبعد ظروف الإجهاد المختلفة (الأدوية القائمة على البلاتين, تشعيع غاما, مثبطات توبويسوميراز, مثبطات كيناز التيروزين والتكسير). العلاقة بين نمط الربط وفعالية العلاج الكيميائي وقد ثبت بالفعل في خلايا سرطان الرئة, التي هي مقاومة للعلاج الكيميائي, تظهر تغييرات في المتغيرات caspase-9 معدل¹⁰. تظهر خلايا HEK293 المعالجة بلوحة العلاج الكيميائي تغييرات في الربط مع زيادة في المتغيرات المؤيدة للبوبتوتيك. ولاحظ غابرييل وآخرون¹¹ تغيرات في ما لا يقل عن 700 حدث من أحداث الربط بعد علاج سيسبلاتين في خطوط الخلايا المختلفة، مشيرا إلى أن مسارات الربط تتأثر سيسبلاتين. وقد أظهرت التشكيلات الربط بالفعل النشاط المضاد للورم، مما يدل على أن الربط مهم للتنمية الورمية، وأساسا، استجابة العلاج الكيميائي¹². وبالتالي ، فإن توصيف البروتينات الجديدة التي تنظم الربط بعد عوامل الإجهاد الخلوية ، مثل العلاج الكيميائي ، مهم جدا لاكتشاف استراتيجيات جديدة للعلاج.

يمكن أن تتطلب أدلة تنظيم الربط البديل من دراسات interactome ، ذات الأهمية الخاصة لتوصيف وظائف البروتينات الجديدة أو غير المكصرة ، نهجا أكثر عمومية وبساطة للتحقق من الدور الحقيقي للبروتين في AS. Minigenes هي أدوات هامة لتحليل الدور العام للبروتين التي تؤثر على تنظيم الربط. أنها تحتوي على أجزاء من جين الفائدة التي تحتوي على مناطق الجينوم مقسمة بدلا من ذلك ويحيط¹³. استخدام أداة minigene يسمح تحليل الربط في الجسم الحي مع العديد من المزايا مثل طول minigene الذي هو طفيف، وبالتالي ليس قيدا على رد فعل تضخيم; يمكن تقييم نفس المينيجين في خطوط الخلايا المختلفة؛ جميع المكونات الخلوية، وأساسا تعديل ما بعد الترجمة تنظيم (الفوسفور والتغيرات في مقصورات الخلية) موجودة ويمكن معالجتها^13،14. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة التغيرات في نمط الربط البديل بعد الإجهاد الخلوي، واستخدام نظام مينيجين، تسمح لتحديد المسار الذي يتم تحويره من قبل محفزات مختلفة.

هناك العديد من أنظمة minigene الموصوفة بالفعل والتي هي محددة لأنواع مختلفة من الأحداث الربط^13،14، ومع ذلك ، كخبار أولي ، فإن minigene E1A¹⁵ هو نظام مراسل الربط البديل الراسخ للغاية لدراسة اختيار 5 SS في الجسم الحي. من جين واحد فقط، E1A، يتم إنتاج خمسة mRNAs بواسطة الربط البديل على أساس اختيار ثلاثة مواقع مختلفة 5' لصق واحد رئيسي أو واحد طفيفة 3' لصق الموقع^16،17،18. التعبير عن المتغيرات E1A يتغير وفقا لفترة العدوى الغدية^19،20.

لقد أظهرنا سابقا أن كلا من isoforms Nek4 تتفاعل مع عوامل الربط مثل SRSF1 وhnRNPA1 وعلى الرغم من isoform 2 التغييرات minigene E1A الربط البديل، isoform 1 ليس له أي تأثير في ذلك²¹. لأن isoform 1 هو isoform الأكثر وفرة ويغير مقاومة العلاج الكيميائي والاستجابة للتلف الحمض النووي، ونحن تقييم ما إذا كان يمكن تغيير الربط البديل E1A minigene في حالة الإجهاد.

الفحص مينيجين هو بسيط، منخفضة التكلفة وطريقة سريعة، لأنه يحتاج فقط استخراج الحمض النووي الريبي، توليف cDNA، تضخيم وجل agarose التحليلات، ويمكن أن يكون أداة مفيدة لتقييم منذ تأثير محتمل على الربط البديل من قبل بروتين المصالح حتى تأثير العلاجات المختلفة على نمط الربط البديل الخلوية.

1. الخلايا الطلاء

ملاحظة: في هذا البروتوكول الموصوف، HEK293 خطوط الخلايا مستقرة، ولدت سابقا للتعبير غير قابل للانستقراء من Nek4 استخدمت^21،ومع ذلك، فإن البروتوكول نفسه هو مناسبة لكثير من خطوط الخلايا الأخرى، مثل HEK293^22،HeLa^{23،24،25،26،}U-2 OS^27،COS7^28،SH-SY5Y²⁹. نمط التعبير عن النظائر E1A minigene تحت ظروف القاعدية يختلف بين هذه الخلايا، وينبغي أن تتميز لكل شرط. لا يقتصر هذا البروتوكول على خطوط الخلايا المستقرة. النهج الأكثر شيوعا في تقييم البروتين المرشح هو عن طريق عابرة المشاركة في زيادة مقداره مع كمية ثابتة من minigene. البروتوكول نفسه مناسب لخلايا خروج المغلوب.

1. خلايا لوحة النظر في السيارة، غير المصابة وGFP الضوابط.
2. ثقافة خلايا HEK293 مع تعبير مستقر عن جين الاهتمام في دولبيكو النسر المعدل المتوسط (DMEM) تكملها مع 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS)، 4.5 غرام / لتر الجلوكوز، 4 م ل-الجلوتامين والحفاظ مع 100 ميكروغرام/مل من hygromycin B، على لوحات الأنسجة المعالجة بزراعة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ والغلاف الجوي المرطب.
3. تقسيم الخلايا باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA. لوحة 3 × 10⁵ خلايا في لوحات 6 آبار واحتضانها لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
   ملاحظة: بالنسبة للإصابة بالعدوى، يجب أن تكون الخلايا التقاء بنسبة 70-80٪ لتقليل موت الخلية بعد العدوى.

2. إصابة الخلية

ملاحظة: تم استخدام 1-2 ميكروغرام من pMTE1A مينيجين بلازميد هنا، ولكن كمية الحمض النووي، فضلا عن وقت التعبير، يجب أن تبقى في الحد الأدنى لتجنب السمية. فعلى سبيل المثال، لوحظ ارتفاع السمية في خلايا هيلا بعد 30 ساعة من العدوى مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي pMTE1A. بالنسبة للإصابة العابرة الموصوفة هنا ، تم استخدام كاشف العدوى القائم على الدهون

1. تحقق من التقاء الخلايا 24 ساعة بعد الطلاء وخلايا HEK293 مستقرة transfect فقط عندما التقاء 70-80٪.
2. إزالة الخلايا ثقافة المتوسطة بعناية مع ماصة، بدلا من استخدام نظام مضخة فراغ. ثم أضف بعناية 2 مل من متوسط DMEM الكامل بدون مضادات حيوية ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة.
3. إعداد أنبوب مع العازلة transfection (200 ميكرولتر / بئر)، إضافة 2 ميكروغرام من الحمض النووي pMTE1A، دوامة ومن ثم إضافة 2 ميكرولتر من كاشف العدوى. دوامة مرة أخرى واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. إزالة لوحات من الحاضنة وإضافة بعناية خليط العدوى دروبيوايز.
5. إلى خلايا HEK293 المستقرة، أضف التتراسيكلين (0.5 ميكروغرام/مل) لحث تعبير Nek4 بعد 6 ح من الإصابة. التغيير المتوسط ليس ضروريا.
   ملاحظة: وحدات التخزين/المبالغ الموضحة في هذا المقطع هي بئر واحد. إعداد الخليط لجميع الآبار المستخدمة في التجربة في نفس الأنبوب.
6. إعداد بئر واحد لtransfect مع EGFP، أو آخر الفلوروفورا التعبير عن البلازميد لتقدير كفاءة العدوى. ويمكن ملاحظة نتائج أفضل مع كفاءة العدوى بنسبة 40٪ على الأقل، ولكن لوحظ سابقا أداء جيد مع انخفاض كفاءة العدوى.
7. عند استخدام العدوى المشتركة (بروتين الفائدة والمينيجين) الحفاظ على بئر مع الخلايا غير المصابة لتجنب الحصول على نتائج من الحمض النووي الريبي الذاتية. في حالة E1A، خلايا HEK293 تعبر بالفعل عن الجين E1A³⁰.

3. إعداد الأدوية

ملاحظة: تم اختيار وقت وتركيز العلاج بناء على نتائج الأدب، والتي تشير إلى التغيرات في الربط البديل لبعض الجينات.

1. قم بإجراء منحنى الجرعة والاستجابة قبل بدء الفحص لتحديد الحد الأدنى من التركيز على تحريض الربط البديل دون أي تأثير في صلاحية الخلية.
2. إعداد محلول الأسهم Paclitaxel في تركيز 5 MM في الإيثانول. التركيز النهائي هو 1 ميكرومتر. استخدام الإيثانول 0.02٪ كتحكم في السيارة.
3. إعداد محلول سيسبلاتين عن طريق تخفيف في 0.9٪ NaCl في حوالي 0.5 ملغ / مل (1.66 mM). حماية من الضوء، دوامة واحتضان في حمام حراري، 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. التركيز النهائي هو 30 ميكرومتر. إعداد الطازجة أو تخزينها في 2-10 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
   ملاحظة: يجب حماية جميع الأدوية من الضوء.

4. علاج الخلايا وجمعها

ملاحظة: تم جمع خلايا مستقرة HEK293 48 ساعة بعد العدوى، ولهذا عولجت 24 ساعة بعد transfection لأن يتم تحقيق أعلى مستوى التعبير Nek4 في غضون 48 ساعة. ومع ذلك، لوحظت مستويات عالية من التعبير isoform 13S (حتى 90٪) في هذا الوقت. لتقليل نسبة متساوي الشكل 13S، حاول علاج وجمع الخلايا 30 ساعة بعد الحد الأقصى للإصابة.

1. استخدام RNA / DNase نصائح مجانية والأنابيب. إجراء استخراج الحمض النووي الريبي الكلي مع كاشف الفينول الكلوروفورم بعد توصية الشركة المصنعة.
2. 24 ساعة بعد العدوى، تحقق من مورفولوجيا الخلايا وكفاءة العدوى باستخدام المجهر الفلوري.
3. إزالة الخلية ثقافة المتوسطة، وذلك باستخدام تفضيلي ماصة بدلا من نظام مضخة فراغ. ثم أضف خلية الثقافة المتوسطة مع العلاج الكيميائي في التركيز النهائي الموصوفة سابقا.
4. حضانة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ لمدة 18 - 24 ساعة.
5. جمع الحمض النووي الريبي عن طريق التخلص من الخلايا ثقافة المتوسطة في حاوية وإضافة 0.5 - 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة إلى البئر. إذا كانت الآبار التقاء جدا، استخدم 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي لتحسين جودة الحمض النووي الريبي.
6. تجانس مع ماصة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. عند هذه النقطة، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عن طريق تخزين العينات عند -80 درجة مئوية أو الانتقال فورا إلى استخراج الحمض النووي الريبي.
   تحذير: كاشف استخراج الحمض النووي الريبي القائم على الفينول سام ويجب إجراء جميع الإجراءات في غطاء الدخان الكيميائي والتخلص من المخلفات بشكل صحيح.

5. استخراج الحمض النووي الريبي وتوليف cDNA

1. في غطاء الدخان إذابة العينات واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 0.1 -0.2 مل من الكلوروفورم والهياج بقوة.
2. حضانة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × ز و 4 °C.
4. جمع المرحلة المائية العليا ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد 1.5 مل. جمع حوالي 60٪ من إجمالي الحجم. ومع ذلك، لا تجمع الحمض النووي أو المرحلة العضوية (السفلية).
5. إضافة 0.25 - 0.5 مل من الأيزوبروبانول والتحريض عن طريق عكس 4 مرات. حضانة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. جهاز الطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 10 دقيقة، في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
7. غسل بيليه الحمض النووي الريبي مرتين مع الإيثانول (75٪ في المياه المعالجة ديثيليبيروكربونات (DEPC). جهاز الطرد المركزي في 7500 x ز لمدة 5 دقائق والتخلص من الإيثانول.
8. إزالة الإيثانول الزائد عن طريق عكس الأنبوب على ورقة منشفة ومن ثم ترك أنبوب مفتوح داخل غطاء محرك السيارة الدخان لتجفيف جزئيا بيليه لمدة 5-10 دقيقة.
9. Resuspend بيليه الجيش الملكي النيبالي في 15 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC.
10. قياس إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام الامتصاص في 230 نانومتر، 260 نانومتر، و 280 نانومتر للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي.
11. للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي الكلي، قم بتشغيل جل الآغاروز 1٪ المعالج مسبقا بنسبة 1.2٪ (v/v) من محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2.5٪ لمدة 30 دقيقة^31.
12. إجراء توليفة cDNA باستخدام 1-2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي.
    1. ماصة الحمض النووي الريبي، 1 ميكرولتر من أوليغو دي تي (50 ميكرومتر)، 1 ميكرولتر من dNTP (10 mM) وتصنع الحجم إلى 12 ميكرولتر مع ماء خال من النيوكليز. احتضان في thermocycler لمدة 5 دقائق في 65 درجة مئوية.
    2. إزالة عينات من thermocycler لتهدئة وإعداد خليط التفاعل: 4 ميكرولتر من العازلة النسخ العكسي، 2 ميكرولتر من dithiothreitol (DTT)، و 1 ميكرولتر من مثبط ريبونوكليز. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من النسخ العكسي الحرارية مستقرة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة وتعطيل الانزيم في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
       ملاحظة: يمكن تخزين cDNA عند -20 درجة مئوية لعدة أسابيع. إجراء مراقبة غير عكسية للنسخ (NRT) للتلوث الجينومي من التمييز المفترض لأحداث الاحتفاظ بالانترون.

6. pMTE1A مينيجين PCR

1. أداء PCR مع تكوين رد الفعل (1.5 mM من MgCl₂، 0.3 mM من مزيج dNTP ، 0.5 ميكرومتر من كل التمهيدي ، 2.5 U من Taq Polymerase الساخنة و 150 نانوغرام من cDNA) مع الشروط التالية:
   94 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 29 دورة من: 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. تحميل 20-25 ميكرولتر من المنتج PCR في هلام agarose 3٪ تحتوي على وصمة عار حمض النيوكليك وتشغيلها في 100 V لحوالي 1 ساعة.

7. تحليل هلام باستخدام معالجة الصور وتحليل البرمجيات³²

1. بعد التشغيل ، صور الجل (باستخدام نظام اكتساب التصوير الهلامي) وتجنب أي تشبع النطاق وتحديد النطاقات باستخدام برنامج معالجة الصور.
2. للقياس الكمي النظر في العصابات في ~ 631 نقطة أساس ، ~ 493 نقطة أساس ، و ~ 156 نقطة أساس لتتوافق مع 13S ، 12S و 9S isoforms ، على التوالي.
3. من قائمة ملف البرنامج، افتح ملف الصورة الذي تم الحصول عليه من نظام الحصول على التصوير. قم بالتحويل إلى تدرج رمادي، وضبط السطوع والتباين، وإزالة الضوضاء المتطرفة إذا لزم الأمر.
4. رسم مستطيل حول الممر الأول باستخدام أداة تحديد المستطيل وحدده من خلال تحليل | | الهلام حدد الأمر "المسار الأول"، أو بالضغط على اختصار لوحة المفاتيح له.
5. استخدام الماوس للنقر وعقد في منتصف المستطيل على حارة الأولى وسحبه إلى حارة المقبل. انتقل إلى تحليل | | الهلام حدد التالي حارة، أو اضغط على الاختصار المتوفر. كرر هذه الخطوة إلى جميع الممرات المتبقية.
6. بعد تمييز جميع الممرات ورقمها، انتقل إلى تحليل | | الهلام مؤامرة الممرات لرسم مؤامرة الملف الشخصي لكل حارة.
7. باستخدام أداة التحديد على الخط المستقيم، ارسم خطا عبر قاعدة كل قمة مقابلة لكل نطاق، مع استبعاد ضوضاء الخلفية. بعد أن تم إغلاق جميع القمم ، من كل حارة ، حدد أداة Wand وانقر داخل كل قمة. لكل الذروة التي تم تمييزها، يجب أن تظهر القياسات في إطار النتائج الذي يظهر.
8. جمع كثافة من جميع العصابات 3 لكل عينة وحساب النسبة المئوية لكل isoform بالنسبة إلى المجموع.
9. رسم النسب المئوية لكل isoform أو الاختلافات في النسبة المئوية بالنسبة للعينات غير المعالجة.
   ملاحظة: تأكد من أن مجموع المتغيرات E1A الثلاثة يجب أن يساوي 100٪.

تم إجراء فحص مواقع الربط 5 'باستخدام E1A minigene لتقييم التغيرات في ملف تعريف الربط في الخلايا بعد معرض العلاج الكيميائي. تم تقييم دور Nek4 - isoform 1 في تنظيم AS في خلايا HEK293 المستقرة بعد علاج باكليتاكسيل أو سيسبلاتين.

11- تعتبر منطقة أدينوفيرالي E1A مسؤولة عن إنتاج ثلاثة من الرناس الرئيسي من سلفة واحدة من السلائف الرناية بسبب استخدام مختلف الجهات المانحة للربط. أنها تشترك المشتركة 5 'و 3' termini ولكن تختلف في حجم introns المقتطعة. يتم تسمية الرناس الأدينوفيرالي E1A وفقا لمعاملات الترسيب الخاصة بهم، 13S و 12S و 9S. خلال المرحلة المبكرة من عدوى الفيروس الغدي (حوالي 7 ساعة) ، يتم إنتاج البروتينات الهامة لإعداد الخلية المصابة لتكرار الحمض النووي الفيروسي (13S - 723 aa و 12S - 586 aa) ، وفي المرحلة المتأخرة (حوالي 18 ساعة) إلى جانب تلك ، يتم إنتاج بروتين صغير (9S -249 aa)^20. باستخدام البلازميد الذي يحتوي على مينيجين من E1A ، يمكن ملاحظة التأثير على الربط البديل في الخلايا بعد العدوى تقييم نسبة مرنا من كل isoform المنتجة : 13S : 631 نقطة أساس ، 12S : 493 bp و 9S 156 bp (الشكل 1A و B).

التعبير القاعدي للمتغيرات ISOFORMS E1A يعتمد على خط الخلية والوقت للتعبير E1A. ولوحظ أن خط الخلية المستقر HEK293 (HEK293-Flag) أو HEK293 recombinase الذي يحتوي على موقع (HEK293-FRT - خط الخلية الأصلي) يظهر تعبيرا أعلى من 13S بالمقارنة مع خلايا HeLa (HeLa-PLKO) التي تظهر مستويات مماثلة من 13S و 12S isoforms بعد 48 ساعة من التعبير E1A (الشكل 1C و D).

انخفاض كبير في مستوى التعبير 13S لوحظ في خلايا مستقرة HEK293 تحت أقصر الأوقات من التعبير E1A (حوالي 30 ساعة). نسبة (٪) من 13S:12S:9S في 30 ساعة و 48 ساعة هي 60:33:7 و 80:15:5، على التوالي (البيانات غير الممثلة). لهذا السبب، من المهم توصيف التشكيل الجانبي للربط الخلوي القاعدي E1A قبل بدء التجارب.

وأظهرت الخلايا المعرضة ل سيسبلاتين تحولا في اختيار الربط 5 SS لصالح التعبير 12S (زيادة حوالي 15٪ مقارنة مع الخلايا غير المعالجة). وقد لوحظ هذا التأثير في HEK293 التعبير عن ستابلي العلم ناقلات فارغة وكذلك isoform 1 من Nek4. عندما يتم ملاحظة تغييرات رئيسية في النسبة المئوية للتعبير، تمثل المؤامرة ذات النسب المئوية النتائج بوضوح(الشكل 2).

عند مقارنة شرطين (العلم وNek4 التعبير المفرط) الاستجابة للعلاج، وعادة ما تكون أفضل طريقة لتمثيل البيانات هو رسم الاختلافات على الرسم البياني، لأن المستوى القاعدي للتعبير يمكن أن تكون مختلفة، والنسب المئوية لن تعكس التأثير الحقيقي للعلاج. ويمكن ملاحظة ذلك في الشكل 3. كانت التغييرات في AS بعد علاج باكليتاكسيل منفصلة للغاية ، ولكن اتجاهات التغييرات كانت عكس ذلك في Flag و Nek4 التي تعبر عن الخلايا.

على الرغم من التغيرات الطفيفة بعد العلاج ، كانت النتائج متسقة ، مما يشير إلى أن علاج باكليتاكسيل يؤدي إلى انخفاض في 13S isoform ، مع زيادة في 12S و 9S في الخلايا المعبرة عن العلم ، في حين أنه من ناحية أخرى ، في Nek4 التعبير عن الخلايا ، لوحظ التأثير المعاكس.

الشكل 1: Minigene E1A نمط الربط يعتمد على خط الخلية. أ) تمثيل تخطيطي لمواقع الربط E1A مصغرة. تشير الأسهم إلى منطقة تمييع التمهيدي لتضخيم الأشكال المتساوية E1A minigene. ب) Isoforms المتولدة من الربط البديل من E1A minigene. ج)HEK293 التعبير بثبات العلم ناقلات فارغة (HEK293 -العلم)، هيلا المصابة مع ناقلات PLKO (هيلا - PLKO) أو، HEK293 المواقع التي تحتوي على إعادة دمج (من ما HEK293 التعبير طعن العلم أو Nek4.1 تم إنشاؤها - HEK293-FRT) تم تحويلها مع pMTE1A plasmid. 48h بعد عزل مجموع RNA transfection وفصل ISOFORMS E1A في هلام الآغاروز(D). رسم بياني يقارن النسبة المئوية لخلايا 13S و 12S و 9S في خلايا HEK293-Flag و HeLa-PLKO في ظل ظروف أساسية. بيانات من ثلاث تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تأثير العلاج سيسبلاتين في نمط الربط E1A minigene. HEK293 التعبير عن ستابل العلم ناقلات فارغة (العلم) أو Nek4.1 علامة العلم تنصهر، تم نقل المصابة مع pMTE1A البلازميد. بعد ست ساعات من إضافة التتراسيكلين عبر العدوى إلى تحريض تعبير البروتينات. 24 ساعة إلى 48 ساعة، تم استبدال وسيطة ثقافة الخلية لوسط يحتوي على 30 ميكرومتر من سيسبلاتين. بعد 24 ساعة من الحضانة، تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي وتم فصل منتجات PCR في هلام الآغاروز 3٪. أ)يصور النظائر المصغرة السائدة E1A. تمثل الرسوم البيانية B-D ٪ لكل متساوي الشكل بالنسبة إلى مجموع ثلاثة متغيرات (13S و 12S و 9S). في E، يتم عرض الفرق في النسبة المئوية للتعبير لكل isoform بالنسبة للتحكم في السيارة (المتوسط). يتم تقديم الرسوم البيانية على أنها متوسط و SEM لثلاث تجارب مستقلة. * ع < 0.05 ، ** ع <0.01 في اختبار ر غير مدفوعة الأجر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تأثير العلاج باكليتاكسيل في نمط الربط E1A minigene. HEK293 التعبير بثبات العلم ناقلات فارغة (العلم) أو Nek4.1 العلم تنصهر، تم تحويلها مع pMTE1A البلازميد. بعد ست ساعات من إضافة التتراسيكلين عبر العدوى إلى تحريض تعبير البروتينات. 24 ساعة إلى 48 ساعة، تم استبدال وسيطة ثقافة الخلية بوسط يحتوي على 1 ميكرومتر من باكليتاكسيل أو الإيثانول (0.02٪) المستخدمة كتحكم في السيارة. بعد 24 ساعة من الحضانة، تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي وتم فصل منتجات PCR في هلام الآغاروز 3٪. أ)يتم تصوير الأشكال isoforms السائدة. تمثل الرسوم البيانية B-D ٪ لكل متساوي الشكل بالنسبة إلى مجموع ثلاثة متغيرات (13S و 12S و 9S). في E، يتم تقديم الفرق في النسبة المئوية للتعبير لكل isoform بالنسبة للتحكم في المركبة (الإيثانول). يتم تقديم الرسوم البيانية على أنها متوسط و SEM لثلاث تجارب مستقلة. * ع < 0.05 في اختبار ر غير مدفوعة الأجر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Minigenes هي أدوات هامة لتحديد الآثار في الربط البديل العالمي في الجسم الحي. وقد استخدمت adenoviral minigene E1A بنجاح لعقود لتقييم دور البروتينات عن طريق^{زيادة كمية}هذه في الخلية 13^,14. هنا، نقترح استخدام E1A minigene لتقييم الربط البديل بعد التعرض للعلاج الكيميائي. تم استخدام خط خلية مستقر يعبر عن Nek4 isoform 1 ، وتجنب القطع الأثرية من التعبير المفرط الناجم عن العدوى العابرة. لم يظهر isoform 1 من Nek4 تأثيرا في الربط البديل E1A minigene في الحالات القاعدية²¹، ولكن لديه العديد من المتفاعلات ذات الصلة بالربط ، لذلك ، مما يسمح لنا بتقييم التأثير المحدد للعلاج الكيميائي في الربط البديل E1A في هذه الخلايا.

على الرغم من الحساسية المنخفضة ، مقارنة بشكل رئيسي بالنهج المشعة ، فإن الطريقة الموصوفة هنا بسيطة ولا تتطلب كاشفات خاصة أو ظروف مختبرية. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن E1A minigene هو مراسل عالمي من التحديدات SS 5، على الرغم من أن اختيار 3 SS يمكن تقييمها مع هذا البروتوكول يجب استخدام مراسل minigene^{محددة 14،33،34}. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتأثر النتائج بخط الخلية وينبغي تقييمها بعناية لتجنب سوء التفسير بسبب ملف الربط البديل القاعدي.

عادة، لوحظ اختلافات كبيرة في نمط الربط E1A minigene فقط عند تغيير التعبير عن عوامل الربط. تغييرات أخرى أقل وضوحا بسبب العدد الكبير من البروتينات تحوير نشاط هذه العوامل. لهذا السبب، عند بدء الدراسات لمرشح غير مباشر، ينبغي تفضيل النهج الكلاسيكي، على أساس كميات متزايدة من هذا البروتين المرشح. عندما يلاحظ بعض التأثير ، يمكن إجراء العلاجات لاستكشاف ما إذا كان التنظيم يمكن أن يكون محددا لتحفيز خلوي معين.

بعد نتيجة إيجابية أولية ، يمكن إجراء توحيد الوقت وتركيز الدواء لتحسين التجربة.

هذا البروتوكول البسيط هو الفحص الأولي ، وهي نقطة بداية يمكن أن تجيب على ما إذا كان البروتين المثير للاهتمام يظهر تأثيرا في الربط البديل ، وكذلك ، عندما يكون هناك بعض التأثير في تنظيم الربط البديل معروف بالفعل ، يمكن توجيه الدراسات إلى المسار الأكثر اتساقا حيث يلعب البروتين دورا في تنظيم الربط البديل في الاستجابة للعلاج الكيميائي.

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

نشكر فونداساو دي أمبارو بيسكيسا دو استادو دي ساو باولو (FAPESP، من خلال غرانت تيماتيكو 2017/03489-1 إلى JK وزمالة إلى FLB 2018/05350-3) وConselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) لتمويل هذا البحث. نود أن نشكر الدكتور أدريان كراينر على توفير البلازميد pMTE1A وZerler وزملاؤه لعملهم في الاستنساخ E1A. كما نشكر البروفيسورة باتريسيا موريل، والأستاذة الدكتورة واندا بيريرا ألميدا، والبروفيسور الدكتور مارسيلو لانسيلوتي، والبروفيسورة الدكتورة كارينا كوغو كوغو مولر للسماح لنا باستخدام مساحة ومعدات مختبرهم.