本协议提供了一个快速和有用的工具，用于评估化疗后在替代拼接调节中具有非同寻常功能的蛋白质的作用。

mRNA 处理涉及多个同时步骤，为翻译准备 mRNA，例如 5'封顶、多 A 添加和拼接。除了构成拼接外，替代mRNA拼接还允许从一个基因中表达多功能蛋白质。由于相互作用研究通常是对新蛋白质或未知蛋白质的第一次分析，诱饵蛋白与拼接因子的关联表明它可以参与mRNA拼接过程，但确定在什么情况下或在什么情况下调节基因是一个经验过程。评估此功能的良好起点是使用经典的迷你基因工具。在这里，我们介绍腺卵巢E1A微型基因的用法，用于评估不同细胞应激刺激后的替代拼接变化。我们评估了E1A微基因在 HEK293 中拼接，经过不同的应力处理后，稳定过度表达 Nek4 蛋白质。该协议包括E1A微基因转染、细胞治疗、RNA提取和cDNA合成，然后是PCR和凝胶分析和E1A拼接变种的量化。使用这种简单和成熟的方法与特定的治疗相结合是一个可靠的起点，可以揭示细胞过程或哪些基因可以通过mRNA拼接调节。

拼接是真核 mRNA 处理中最重要的步骤之一，同时发生到 5mRNA 封顶和 3mRNA 聚腺化，包括内电拆除，然后是外向结。拼接点 （SS） 的识别由拼接体， 核糖核蛋白复合物包含小核糖核蛋白 （snRNP U1， U2， U4 和 U6）， 小RNA （snRNA） 和几个调节蛋白¹ 是拼接的必要条件。

除了内电拆卸（构成拼接），在真核生物中，可以保留内子，可以排除外在，配置称为 mRNA 替代拼接 （AS） 的过程。替代的mRNA前拼接扩展了真核基因组的编码能力，允许从相对较少的基因中产生大量和多样化的蛋白质。据估计，95-100%的含有多个外在物的人类mRNA可以进行替代拼接^2，3。这是神经元发育、凋亡活化和细胞应激反应⁴等生物过程的基础，为生物体提供了利用相同的基因来调节细胞功能的替代方案。

替代拼接所需的机械与构成拼接所用的机械相同，SS 的使用是替代拼接发生的主要决定因素。构成拼接与使用强拼接点有关，通常更类似于拼接体识别⁵的共识主题。

替代外显子通常比构成外显子识别效率低，一旦其 cis-监管元素，在 5 的 SS 和 3 的 SS 的序列侧翼这些外显子，显示对拼接体的低级绑定能力。mRNA 还包含位于外显子（外显电拼接增强剂 （ESEs） 和外显拼接消音器 （ESS） 和 introns（内电拼接增强器 （ISEs） 和内生拼接消音器 （ISS） 中的指定增强器或消音器的区域^{，分别增强}或抑制外显子的使用。这些序列由跨监管元素或拼接因子 （SF） 识别。SF主要由两种蛋白质家族表示，血清/精氨酸丰富的拼接因子（SRSF）与ESE结合，异质核核核蛋白（hnRNPs）家族与ESS序列⁵结合。

替代拼接可以通过磷酸化/脱磷的跨因子改变相互作用伙伴和细胞定位拼接因子^6，7，8调节。识别拼接因子的新调节器可以提供新的工具来调节拼接，从而提供一些癌症治疗。

Anufrieva等人在mRNA微阵列基因表达特征中观察到101个细胞系中拼接体成分水平和不同应激条件（铂基药物、伽马辐照、托波索酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和分类酶）后的一致变化。拼接模式与化疗疗效的关系已经在肺癌细胞中得到证明，肺癌细胞具有抗化疗作用，显示 caspase-9 变异率¹⁰的变化。HEK293细胞用化疗面板治疗显示，随着亲凋零变种的增加，拼接的变化。Gabriel 等人¹¹观察了不同细胞系中经酸铂处理后至少 700 个拼接事件的变化，指出拼接通路受顺铂影响。拼接调制剂已经显示出抗肿瘤活性，表明拼接对肿瘤发育很重要，主要是化疗反应^12。因此，描述细胞压力剂剂（如化疗）后调节拼接的新蛋白质对于发现新的治疗策略非常重要。

相互作用研究中替代拼接调节的线索，特别是对描述新蛋白质或非特异性蛋白质的功能非常重要，可能需要一种更通用、更简单的方法来验证蛋白质在AS中的实际作用。微基因是分析影响拼接调节的蛋白质的一般作用的重要工具。它们包含来自兴趣基因的片段，其中包含其他拼接和侧翼基因组区域^13。使用微型工具可以分析体内拼接，具有若干优点，例如微小的微基因长度，因此不会限制放大反应:同一微基因可以在不同的细胞系中进行评估;所有细胞组件，主要是其调节后转化修改（磷化和细胞隔间的变化）都存在，可以解决^13，14。此外，在细胞应激之后，可以观察到替代拼接模式的变化，并且，使用微型系统，可以识别由不同刺激调节的路径。

有几个迷你基因系统已经描述，这是针对不同类型的拼接事件^13，14，然而，作为初步的测定，迷你基因E1A¹⁵是一个非常成熟的替代拼接记者系统，用于研究5的SS选择在体内。仅从一个基因，E1A，五个mRNA是由替代拼接的基础上，选择三个不同的5+拼接点和一个主要或一个小的3+拼接站点16，17，18。E1A变异的表达方式根据腺病毒感染期^19、20而变化。

我们以前已经表明，Nek4等离子体与拼接因子（如 SRSF1 和 hnRNPA1）相互作用，虽然等形 2 改变了迷你基因 E1A 替代拼接，但等离子体 1 在这²¹中没有影响。由于等离子体1是最丰富的等形体，并改变化疗阻力和DNA损伤反应，我们评估它是否可以改变微基因E1A替代拼接在应力条件下。

Minigene 检测是一种简单、低成本和快速的方法，因为它只需要 RNA 提取、cDNA 合成、放大和阿加罗斯凝胶分析，并且可以成为一个有用的工具来评估，因为兴趣蛋白质对替代拼接的可能影响，直到不同处理对细胞替代拼接模式的影响。

1. 电镀细胞

注:在此描述的协议中，HEK293稳定细胞系，以前生成的稳定诱导表达Nek4被使用^21，但是，相同的协议是适合许多其他细胞系，如HK293^22，HeLa23，24，25，26，U-2OS^{27，COS728，SH-SY5Y29。}在基础条件下，微基因E1A等形体的表达模式在这些细胞之间各不相同，应针对每个条件进行特征。此协议不限于稳定的单元格线。在候选蛋白质的评价中，最常见的方法是通过瞬态共变，增加其数量与小基因的固定量。相同的协议适用于淘汰单元格。

1. 考虑车辆、未传输和 GFP 控制的板细胞。
2. 培养 HEK293 细胞，稳定表达对杜尔贝科改良鹰介质 （DMEM） 感兴趣的基因，辅以 10% 的胎儿牛血清 （FBS）， 4.5 克/升葡萄糖， 4 mM L-Glutamine，在组织培养处理板上保持100微克/mL的催眠素B，在5%CO2和潮湿大气中保持37°C。
3. 使用 0.25% 试用蛋白-EDTA 分裂细胞。板 3 x 10⁵ 细胞在 6 井板和孵育他们 24 小时在 37 °C 在 5% CO₂. 。
   注:对于转染，细胞必须是70-80%的汇合，以减少转染后的细胞死亡。

2. 细胞转染

注:这里使用了1-2微克pMTE1A微基因质粒，但DNA量以及表达时间必须保持在最低限度，以避免毒性。例如，在 30 小时的转染后，用 1 微克 pMTE1A DNA 在 HeLa 细胞中观察到高毒性。对于此处描述的转染，使用了脂质转染试剂

1. 只有在 70-80% 的汇合时，才检查电池在电镀后 24 小时汇合并转染 HEK293 稳定细胞。
2. 用移液器小心地去除细胞培养介质，而不是使用真空泵系统。然后小心地加入2兆L的完全DMEM介质，没有抗生素，并把板放回孵化器。
3. 准备一个带透射缓冲器（200 μL/井）的管子，加入2微克pMTE1A DNA，旋涡，然后加入2微升的转染试剂。再次漩涡，在室温下孵育10分钟。
4. 从孵化器中取出板，并小心地将转染混合物滴入。
5. 对于 HEK293 稳定细胞，在转染后 6 h 为 Nek4 表达感应添加四环素（0.5 μg/mL）。不需要中等变化。
   注:本节中描述的卷/金额为一口井。在同一管子中为实验中使用的所有油井准备混合物。
6. 准备一口井与EGFP发生透射，或另一个氟表达质粒，以估计转染效率。更好的结果可以观察到，转染效率至少为40%，但之前观察到的转染效率较低的良好性能。
7. 使用共转染（兴趣蛋白和微基因）时，与未受感染的细胞保持良好状态，以避免从内源性mRNA获得结果。在E1A的情况下，HEK293细胞已经表达E1A基因^30。

3. 准备药物

注:根据文献结果选择治疗的时间和浓度，这些结果指出了某些基因替代拼接的变化。

1. 在开始检测之前执行剂量响应曲线，以确定对替代拼接感应的最小浓度，而对细胞生存能力没有影响。
2. 在乙醇浓度为 5 mM 时准备 Paclitaxel 库存溶液。最终浓度为 1 μM。 保持在 -20 °C。 使用 0.02% 乙醇作为车辆控制。
3. 以约 0.5 毫克/mL （1.66 mM） 的 0.9% NaCl 稀释，准备顺铂溶液。在热水浴中防止光线、漩涡和孵化，37 °C 30 分钟。最终浓度为 30 μM. 准备新鲜或储存在 2-10 °C，直到一个月。
   注:所有药物都必须受到保护，免受光线的照射。

4. 细胞治疗和收集

注:HEK293 稳定细胞在转染后 48 小时采集，因此在转染后 24 小时进行治疗，因为最高 Nek4 表达水平在 48 小时内实现。然而，此时观察到13S等形表达（直到90%）的高水平。要降低 13S 等形的比例，请尝试在最大转染后 30 h 处理和收集细胞。

1. 使用RNA/DNase免费提示和管子。根据制造商的建议，用苯酚-氯仿试剂进行总RNA提取。
2. 转染后24小时，使用荧光显微镜验证细胞形态和转染效率。
3. 去除细胞培养介质，优先使用移液器而不是真空泵系统。然后在先前描述的最终浓度中加入细胞培养介质与化疗。
4. 在 37 °C 下孵育，5% CO₂ 为 18 - 24 小时。
5. 将细胞培养介质丢弃在容器中，并将 0.5 - 1 mL 的 RNA 提取试剂直接添加到井中，从而收集 RNA。如果油井非常汇流，请使用 1 mL 的 RNA 提取试剂来提高 RNA 质量。
6. 与移液器同质化，并转移到 1.5 mL 离心机管。此时，可以通过在 -80 °C 下存储样品或立即进行 RNA 提取来暂停协议。
   警告:基于酚的RNA提取试剂是有毒的，所有程序应在化学烟气罩中执行，残留物应妥善处理。

5. RNA提取和cDNA合成

1. 在烟雾罩解冻样品，并在室温下孵育5分钟。加入 0.1 -0.2 mL 的氯仿，大力搅拌。
2. 在室温下孵育3分钟。
3. 离心机 15 分钟，12，000 x g 和 4 °C。
4. 收集上水相并转移到一个新的 1.5 mL 离心机管。收集约60%的总数量:但是，不要收集DNA或有机（下）阶段。
5. 加入 0.25 - 0.5 mL 的等丙醇，通过反转搅拌 4 次。在室温下孵育10分钟。
6. 离心机在 12，000 x g 10 分钟，在 4 °C 下，并丢弃超高。
7. 用乙醇（75%在二乙基碳酸酯（DEPC）处理过的水中清洗RNA颗粒两次）。离心机在7，500 x g 5分钟，并丢弃乙醇。
8. 将多余的乙醇倒置在毛巾纸上，然后将管子放在烟气罩内，将颗粒部分干燥 5 - 10 分钟。
9. 将RNA颗粒重新用于15微升的DEPC处理水。
10. 使用 230 nm、260 nm 和 280 nm 的吸收量对总RNA进行量化，以验证 RNA 质量。
11. 为了验证RNA总质量，运行1%的玫瑰凝胶预处理与1.2%（v/v）的2.5%的次氯酸钠溶液30分^31。
12. 使用总RNA的 1-2 μg 执行 cDNA 合成。
    1. 皮佩特RNA，1微升寡头-dT（50微米），1微升dNTP（10mM），用无核酸水将体积增加到12微升。在 65 °C 的热循环器中孵育 5 分钟。
    2. 从热循环器中取出样品冷却并准备反应混合物:4 μL 反向转录酶缓冲器、2微升二甲醇（DTT）和1微升核素酶抑制剂。在 37 °C 下孵育 2 分钟。
    3. 添加 1 μL 的热稳定倒转录酶。在 37 °C 下孵育 50 分钟，在 70 °C 下灭活酶 15 分钟。
       注:cDNA 可在 -20 °C 下存储数周。对因假定内存事件歧视而造成的基因组污染进行非反向转录酶 （NRT） 控制。

6. pMTE1A 微型 PCR

1. 执行PCR与反应组成（1.5 mM的MgCl2，0.3 mM的dNTP混合，0.5μM每个引物，2.5U的热启动Taq聚合酶和150 ng的cDNA）与以下条件:
   94 °C 代表 2 分钟，29 个周期为:94 °C 代表 1 分钟，50 °C 代表 2 分钟，72 °C 代表 2 分钟，72 °C 代表 10 分钟。
2. 将 PCR 产品的 20-25 μL 装载在含有核酸污渍的 3% 阿加罗斯凝胶中，并在 100 V 下运行约 1 小时。

7. 使用图像处理和分析软件分析凝胶³²

1. 运行后，拍摄凝胶（使用凝胶成像采集系统）避免任何带饱和，并使用图像处理软件量化频段。
2. 对于量化，请考虑频段的频段分别为 631 bp、+493 bp 和 +156 bp，以对应于 13S、12S 和 9S 等形。
3. 从软件 的文件 菜单，打开从图像采集系统获得的图像文件。转换为灰度，调整亮度和对比度，并在必要时消除离群值噪声。
4. 使用 矩形选择 工具在第一条车道周围绘制矩形，并通过 分析|进行选择凝胶|选择第一巷 命令，或按下键盘快捷方式。
5. 使用鼠标单击并按住第一车道上的矩形中间，然后将其拖至下一条车道。去 分析|凝胶|选择下一条车道，或按可用的快捷方式。将此步骤重复到所有剩余车道。
6. 在所有车道都突出显示和编号后，请前往 分析|凝胶|绘制车道 以绘制每个车道的轮廓图。
7. 使用 直线选择 工具，在每个峰值的基座上绘制一条线，以对应每个频段，排除背景噪声。在所有的山峰，从每一条车道，已被关闭后，选择 魔杖 工具，并点击每个峰值内。对于显示的每个峰值，应在显示 的结果 窗口中弹出测量结果。
8. 汇总每个样本的所有 3 波段的强度，并计算每个等形相对于总数的百分比。
9. 绘制每个等形的百分比或相对于未经处理的样品的百分比差异。
   注:确保三个 E1A 变种的总和必须等于 100%。

使用E1A迷你基因进行了5'拼接位点检测，以评估化疗后细胞拼接轮廓的变化。在评估了 Paclitaxel 或顺铂治疗后，Nek4 - 等形 1 在 HEK293 稳定细胞中的 AS 调节中的作用。

腺体E1A地区负责从一个RNA前体生产三个主要的mRNA，因为使用不同的拼接捐赠者。它们共享共同的 5' 和 3' 术语，但其消费税的大小不同。腺素 E1A mRNA 是根据沉积系数、13S、12S 和 9S 命名的。在腺病毒感染的早期阶段（约7小时），产生重要的蛋白质，为病毒DNA复制准备受感染细胞（13S - 723 aa和12S - 586 aa），并在后期（约18小时）除了这些，一个小蛋白质（9S-249 aa）产生^20。使用含有E1A微基因的质粒，在转染后可观察到对替代拼接的影响，评估从每个同位素中产生的mRNA的比例:13S:631 bp，12S:493 bp和9S 156 bp（图1A和B）。

E1A 等形变异的基底表达取决于 E1A 表达的细胞线和时间。观察到，HEK293 稳定细胞系 （HEK293-Flag） 或包含站点的 HEK293 重组 （HEK293-FRT - 原始细胞线） 显示较高的 13S 表达，而 HeLa 细胞 （HeLa-PLKO） 显示 48 小时 E1A 表达 （图 1C 和 D）后的类似水平为 13S 和 12S 等形。

在 HEK293 稳定细胞中观察到的高 13S 表达水平在 E1A 表达的较短时间（约 30 小时）下显著降低。30 小时和 48 小时 13S:12S:9S 的比例分别为 60:33:7 和 80:15:5（未代表数据）。因此，在开始实验之前，对基底细胞微基因 E1A 拼接型图进行特征化非常重要。

暴露于顺铂的细胞显示，5'SS拼接选择的改变有利于12S表达（与未经处理的细胞相比增加了约15%）。这种效果在 HEK293 中观察到稳定地表示旗空矢量以及 Nek4 的等形 1。当观察到表达百分比的重大变化时，带有百分比的情节清楚地表示结果（图2）。

在比较对治疗的反应的两种条件（Flag 和 Nek4 过度表达）时，通常表示数据的最佳方式是绘制图表上的差异，因为表达的基底水平可能不同，并且百分比无法反映治疗的实际效果。这可以在 图3中观察到。在帕利塔塞尔治疗后，AS的变化是非常离散的，但变化的方向在旗和Nek4表达细胞相反。

尽管治疗后变化不大，但结果是一致的，表明 paclitaxel 治疗导致 13S 同位素的减少，Flag 表达细胞的 12S 和 9S 增加，而另一方面，在 Nek4 表达细胞中，观察到相反的效果。

图1:微型E1A拼接模式取决于细胞线。A） 微型 E1A 拼接站点的示意图表示。箭头表示微型 E1A 等形放大的引物退火区域。 B） 由微基因 E1A 的替代拼接产生的等形。 C） HEK293 稳定地表示旗空向量 （HEK293 - Flag），HeLa 与 PLKO 矢量 （HeLa - PLKO） 或 HEK293 包含重组的站点（从 HEK293 稳定表达的旗子或 Nek4.1 生成 - HEK293-FRT）被 pMTE1A 质粒转染。48小时后，转染总RNA被分离，E1A等离子体在阿加罗斯凝胶（D）中分离。图表比较了在基础条件下 HEK293-Flag 和 HeLa-PLKO 细胞中的 13S、12S 和 9S 等形的百分比。来自三个独立实验的数据。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:在微基因E1A拼接模式下的思铂治疗效果。 HEK293 稳定地表示旗空矢量 （旗） 或 Nek4.1 旗标签融合， 被 pMTE1A 质粒感染。转染四环素被添加到蛋白质表达感应的六小时后。24 小时至 48 小时，细胞培养介质被替换为含有 30μM Cisplatin 的介质。经过24小时的孵化，提取了总RNA，将PCR产品分离为3%的玫瑰凝胶。 A） 描绘主要的微基因 E1A 等形体。相对于三个变种（13S、12S 和 9S）的总和， 图表 B-D 表示每个等形的百分比。在 E中，表示到每个等形的百分比的差异相对于车辆（中）控制。图形作为三个独立实验的平均值和 SEM 呈现。* p< 0.05， ** p<0.01 在未修复的 t 测试中。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:小基因E1A拼接模式下的帕利塔塞尔治疗效果。 HEK293 稳定地表示旗空矢量 （旗） 或 Nek4.1 旗融合， 被 pMTE1A 质粒感染。转染四环素被添加到蛋白质表达感应的六小时后。24 小时至 48 小时，细胞培养介质被含有 1 μM Paclitaxel 或乙醇（0.02%）的介质取代，用作车辆控制。经过24小时的孵化，提取了总RNA，将PCR产品分离为3%的玫瑰凝胶。 A） 主要等形图被描绘。相对于三个变种（13S、12S 和 9S）的总和， 图表 B-D 表示每个等形的百分比。在 E中，每个等形的表达百分比的差异相对于车辆（乙醇）控制。图形作为三个独立实验的平均值和 SEM 呈现。* p< 0.05 在未修修的 t 测试中。 请单击此处查看此图的较大版本。

微基因是确定全球替代拼接在体内的影响的重要工具。腺微基因E1A已经成功地使用了几十年，通过增加这些在细胞^13，14中的数量来评估蛋白质的作用。在这里，我们建议使用微型E1A来评估化疗暴露后的替代拼接。使用了表达Nek4等离子体1的稳定细胞线，避免了瞬态瞬态感染引起的过度表达。Nek4的同位素1在^基础条件下的微基因E1A替代拼接中没有显示出效果，但有许多拼接相关相互作用，因此，使我们能够评估这些细胞中E1A替代拼接的化疗治疗的具体效果。

尽管其灵敏度较低，主要与放射性方法相比，这里描述的方法很简单，不需要特殊的试剂或实验室条件。然而，重要的是要注意，迷你基因E1A是全球记者的5的SS选择，虽然3的SS选择可以评估与这个协议，特定的迷你基因记者必须使用14，33，34。此外，结果可能受细胞线的影响，应仔细评估以避免误解，因为基础替代拼接轮廓。

通常，只有在改变拼接因子的表达时，才会观察到微基因 E1A 拼接模式的巨大差异。其他变化不那么明显，因为大量的蛋白质调节这些因素的活动。因此，在开始间接候选者的研究时，应首选基于该候选蛋白质数量增加的经典方法。观察到某些效果后，可以进行治疗，以探索该调节是否特定于特定的细胞刺激。

初步阳性后，可以进行时间标准化和药物浓度优化实验。

这个简单的协议是一个初步的测定，一个起点，可以回答感兴趣的蛋白质是否表现出对替代拼接的效果，而且，当替代拼接调节的某些效果已经为人所知时，可以将研究引向更一致的途径，其中蛋白质在化疗反应中起到调节替代拼接的作用。

作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。

我们感谢圣保罗埃斯塔多·安帕罗基金会（FAPESP， 通过格兰特·特梅蒂科 2017/03489-1 到 JK 和研究金 FLB 2018/05350-3） 和康塞略国家德森沃尔维托科学公司 （CNPq） 资助这项研究。我们要感谢阿德里安·克雷纳博士提供了pMTE1A质粒和泽勒及其同事在E1A克隆方面所做的工作。我们还要感谢帕特里西亚·莫里尔教授、万达·佩雷拉·阿尔梅达教授、马塞洛·兰斯洛蒂教授和卡琳娜·科戈·科戈·穆勒教授允许我们使用他们的实验室空间和设备。