Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

여기에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 직접 관찰하고 자동으로 측정하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 휴대용 기공 영상 장치와 장치에서 캡처한 잎 이미지를 위해 설계된 이미지 분석 파이프라인을 활용합니다.

기공은 식물 잎 표피에서 발견되는 미세한 구멍입니다. 기공 구멍의 조절은 광합성을 위한 이산화탄소 흡수와 증열 수분 손실의 균형을 맞출 뿐만 아니라 박테리아 침입을 제한하는 데에도 중추적인 역할을 합니다. 식물은 미생물을 인식하면 기공을 닫는 반면, 슈도모나스 주사기와 같은 병원성 박테리아는 pv. 토마토 DC3000 (Pto), 닫힌 기공을 다시 열어 잎 내부로 접근합니다. 세균 침입에 대한 기공 반응을 평가하기 위한 기존 분석법에서는 잎 표피 껍질, 잎 디스크 또는 분리된 잎을 박테리아 현탁액에 띄운 다음 현미경으로 기공을 관찰한 후 기공 구멍을 수동으로 측정합니다. 그러나 이러한 분석은 번거롭고 식물에 부착된 잎의 자연적인 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 반영하지 않을 수 있습니다. 최근에는 잎을 식물에서 떼어내지 않고 꼬집어 기공을 관찰할 수 있는 휴대용 영상 장치와 함께 기기로 촬영한 잎 이미지에서 기공 개구를 자동으로 측정하도록 설계된 딥러닝 기반 이미지 분석 파이프라인이 개발되었습니다. 여기에서 이러한 기술적 진보를 바탕으로 애기장대(Arabidopsis thaliana )의 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 평가하는 새로운 방법이 소개되었습니다. 이 방법은 자연 감염 과정을 모방한 Pto 분무 접종, 휴대용 이미징 장치를 사용하여 Pto 접종 식물의 잎에 있는 기공을 직접 관찰하는 방법, 이미지 분석 파이프라인에 의한 기공 개구의 자동 측정의 세 가지 간단한 단계로 구성됩니다. 이 방법은 자연적인 식물-박테리아 상호 작용을 밀접하게 모방하는 조건에서 Pto 침입 중 기공 폐쇄 및 재개를 입증하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

기공은 식물의 잎 표면과 다른 공중 부분에 있는 한 쌍의 보호 세포로 둘러싸인 미세한 구멍입니다. 끊임없이 변화하는 환경에서 기공 구멍의 조절은 식물이 증산을 통한 수분 손실을 희생하면서 광합성에 필요한 이산화탄소 흡수를 제어하는 데 중요합니다. 따라서 기공 구멍의 정량화는 식물 환경 적응을 이해하는 데 중요한 역할을 했습니다. 그러나 기공 조리개를 정량화하는 것은 현미경으로 캡처한 잎 이미지에서 기공 기공을 발견하고 측정하기 위해 사람의 노동이 필요하기 때문에 본질적으로 시간이 많이 걸리고 번거롭습니다. 이러한 한계를 피하기 위해, 기공 생물학 ^1,2,3,4,5,6을 연구하는 데 광범위하게 사용되는 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 기공 구멍의 정량화를 용이하게 하기 위한 다양한 방법이 개발되었습니다. 예를 들어, 기공 전도도의 척도로 증산 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 기공 전도도를 결정하는 기공 수와 구멍에 대한 직접적인 정보를 제공하지 않습니다. 일부 연구에서는 형광 액틴 마커, 형광 염료 또는 세포벽 자가형광 1,2,3,4,5를 사용하여 기공 기공을 강조하는 컨포칼 현미경 기술을 사용했습니다. 이러한 접근법은 기공 검출을 용이하게 하지만, 컨포칼 현미경 검사 시설을 운영하고 현미경 샘플을 준비하는 데 드는 비용은 일상적인 적용에 장애물이 될 수 있습니다. Sai et al.의 획기적인 연구에서는 A. thaliana 표피 껍질의 명시야 현미경 이미지에서 기공 조리개를 자동으로 측정하기 위해 심층 신경망 모델이 개발되었습니다⁶. 그러나 이러한 혁신이 연구자들이 현미경 관찰을 위해 표피 껍질을 준비하는 작업을 면제하지는 않습니다. 최근에는 A. thaliana의 잎을 꼬집어 기공을 관찰할 수 있는 휴대용 영상 장치와 이 장치에 의해 캡처된 잎 이미지로부터 기공 개구를 자동으로 측정하는 딥러닝 기반 이미지 분석 파이프라인을 개발함으로써 이러한 장애물을 극복할 수 있었다(⁷).

기공은 박테리아 병원균에 대한 식물의 선천성 면역에 기여합니다. 이 면역 반응의 핵심은 세균성 병원체가 증식하여 질병을 유발하는 미세한 구멍을 통해 잎 내부로 세균이 침투하는 것을 제한하는 기공폐쇄(stomatal closure)이다⁸. 기공 폐쇄는 원형질막 국소화 패턴 인식 수용체(PRR^)에 의해 미생물 종류에 흔히 나타나는 면역원성 분자인 미생물 관련 분자 패턴(MAMP)을 인식할 때 유도됩니다9. flg22로 알려진 박테리아 편모의 22 아미노산 에피토프는 PRR FLS2¹⁰에 의한 인식을 통해 기공폐쇄를 유도하는 전형적인 MAMP입니다. 이에 대한 대책으로, 슈도모나스 주사기(Pseudomonas syringae) pv와 같은 세균성 병원체. 토마토 DC3000 (Pto)와 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria는 기공 ^9,11,12를 다시 열기 위해 독성 메커니즘을 진화시켰습니다. 세균성 병원체에 대한 이러한 기공 반응은 잎 표피 껍질, 잎 디스크 또는 분리된 잎을 박테리아 현탁액에 띄운 다음 현미경으로 기공을 관찰한 후 기공 구멍을 수동으로 측정하는 분석법에서 일반적으로 분석되었습니다. 그러나 이러한 분석은 번거롭고 식물에 부착된 잎에서 발생하는 자연적인 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 반영하지 못할 수 있습니다.

여기에서는 자연적인 식물-박테리아 상호 작용을 밀접하게 모방하는 조건에서 Pto 침입 중 기공 폐쇄 및 재개를 조사하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 기공 개구부의 자동 측정을 위한 이미지 분석 파이프라인과 함께 Pto를 접종한 식물에 부착된 잎에서 A. thaliana 기공을 직접 관찰하기 위해 휴대용 이미징 장치를 활용합니다.

1. 식물 재배

1. 휴면을 깨기 위해 A. thaliana (Col-0) 씨앗을 탈이온수에 재현탁시키고 어둠 속에서 4일 동안 4°C에서 배양합니다.
2. 토양에 씨앗을 뿌리고 흰색 형광등이 장착 된 방에서 자랍니다. 22°C의 온도, 10시간 동안 6,000lux(약 100μmol/m²/s)의 광도, 60%의 상대 습도를 유지합니다.
3. 필요한 경우 액체 비료로 식물에 물을 줍니다. 접종 1 주일 전부터 2 일 전까지는 급수를 삼가하고 접종 1 일 전에는 우물물을 주세요.

2. 세균 접종 준비

1. 50μg/mL 리팜피신으로 고형화된 King's B(KB) 배지(트립톤 20g, K₂HPO 4 1.5g_, 1L용 글리세롤 15g, 1.5% 한천)의 글리세롤 스톡에서 Pto를 줄무늬 Pto하고 28°C에서 2일 동안 배양합니다.
2. 50μg/mL 리팜피신을 5mL의 KB 액체 배지에 단일 콜로니를 접종하고 28°C에서 200rpm에서 진탕하여 후기 로그 성장 단계까지 배양합니다.
3. 배양액을 6,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 펠릿을 멸균수 1mL에 재현탁시킵니다. 이 단계를 다시 한 번 반복합니다.
4. 상층액을 제거하고, 펠릿을 기공 개방 완충액 1mL(25mM MES-KOH pH 6.15, 10mM KCl)에 재현탁시키고, OD₆₀₀을 측정합니다.
5. 현탁액을 0.04% 실리콘 계면활성제가 함유된 기공 개방 완충액으로 OD₆₀₀ 0.2로 희석합니다.

3. 세균의 살포 접종

1. 접종 1일 전부터 실험이 끝날 때까지 식물을 약 10,000lux(약 170μmol/m²/s)의 광도에 노출시킵니다.
2. 대부분의 기공이 열리도록 하려면 스프레이 접종 전에 최소 3시간 동안 투명한 뚜껑으로 덮인 트레이에 식물을 조명 아래 보관하십시오.
3. 뚜껑을 열고 에어브러시를 사용하여 잎의 축면에 3개당 2.5mL의 박테리아 현탁액을 한 화분에 뿌립니다.
4. 접종한 식물을 투명한 뚜껑으로 덮인 트레이에 배양하여 상대 습도를 약 85%로 유지합니다.
5. 섹션 4에 설명된 방법을 사용하여 분무 접종 후 1시간 및 3시간에 기공의 이미지를 획득합니다.

4. 휴대용 영상 장치를 이용한 기공의 직접 관찰

참고: 휴대용 기공 이미징 장치에는 LED 조명과 카메라 모듈이 장착되어 있으며 약 0.5μm/픽셀의 해상도로 2,592 × 1,944(높이 × 너비, 픽셀) 이미지를 획득할 수 있습니다.

1. 휴대용 기공 영상 장치를 이미지 획득 소프트웨어가 장착된 개인용 컴퓨터(PC)에 연결합니다.
2. 종이로 접종 된 잎에서 물방울을 부드럽지만 완전히 제거하십시오.
3. 장치의 상단 덮개를 열고 리프를 스테이지에 놓고 상단 덮개를 닫습니다(그림 1).
4. 조절 나사를 조작하여 이미지의 초점을 조정한 다음 PC 화면에서 이미지 저장 버튼을 클릭합니다. 이미지는 즉시 획득됩니다. 일반적으로 초점이 맞춰진 이미지에는 약 10개의 분석 가능한 기공이 포함되어 있습니다. 확실한 결과를 얻으려면 세 가지 다른 식물의 잎 6개(식물당 잎 2개)에서 기공 이미지를 획득하십시오.

5. 기공 구멍의 수동 측정

참고: ImageJ 소프트웨어는 다음에서 다운로드할 수 https://imagej.nih.gov/ij/download.html

1. ImageJ에서 이미지 파일을 엽니다.
2. 분석 > 도구 > ROI 관리자를 선택하여 ROI 관리자를 엽니다.
3. 직선 선택 도구를 사용하여 장(요)루의 너비에 해당하는 선을 그리고(그림 2) ROI Manager에서 Add(추가)를 클릭하여 ROI를 등록합니다.
4. 동일한 장(요)루의 길이에 해당하는 선을 그리고(그림 2A) 5.3단계에서 설명한 대로 ROI를 등록합니다.
5. ROI 매니저에서 측정을 클릭하여 너비와 길이를 측정합니다.
6. 너비를 길이로 나누어 기공 구멍(비율)을 구합니다. 확실한 정량화를 위해 각 치료 및 시점에 대해 60개 이상의 기공을 사용하십시오. 분석을 위해 조숙하거나 모호한 기공을 선택하지 마십시오(그림 2B, C).

6. 기공 구멍의 자동 측정

참고: 이미지 분석 파이프라인은 클라우드 Python 프로그래밍 언어 실행 환경인 Google Colaboratory에서 실행됩니다. 사용자는 작동하는 Google 드라이브, Google 크롬 브라우저 및 안정적인 인터넷 연결을 전제 조건으로 하는 유효한 Google 계정이 있어야 합니다.

1. Zenodo(https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.5281/zenodo.8062528)에서 Google Colaboratory 노트북을 다운로드하고 노트북을 엽니다.
2. 파일 > 드라이브에 사본 저장을 선택하여 노트북의 로컬 사본을 Google Drive에 만듭니다. 새 탭이 나타나면 원래 전자 필기장의 탭을 안전하게 닫습니다.
3. 노트북의 Environmental Setup 섹션 아래에 있는 Execute 버튼을 한 번 누르면 셀 블록을 펼치지 않고 필요한 라이브러리를 가져올 수 있습니다.
4. 디렉터리 설정 섹션을 실행하여 Google 드라이브에서 분석에 사용되는 폴더 3개(예: example_result, inference_results, 모델)를 만듭니다.
   참고: 이 경우 example_result, inference_results 및 model 이라는 폴더가 부모 디렉터리로 사용되어 각각 추론 결과와 학습된 모델을 저장합니다. 이 노트북은 대표적인 절차로 디렉터리 구성의 예를 보여 줍니다. 이름을 변경하려면 pardir, infdir 또는 modeldir 경로를 다시 작성하십시오.
5. 이미지 준비 섹션에 따라 획득한 이미지를 example_result로 이동하고 최종 그래프 생성을 위해 처리 또는 샘플(예: mock_1h_XXXXXX.jpg)별로 이미지 제목으로 그룹화합니다. 샘플 이미지는 Zenodo(https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.5281/zenodo.8062528)에서 사용할 수 있습니다.
6. 학습된 모델 다운로드 부분을 수행하여 Zenodo(https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.5281/zenodo.8062528)에서 학습된 모델의 ONNX 파일을 다운로드하고 모델 디렉터리 아래에 배치합니다.
7. Inference and Measurement of Stomatal Aperture 부분을 실행하여 개별 이미지에서 기공 조리개를 정량화합니다. 중첩 추론이 있는 결과 이미지와 example_result.csv라는 csv 파일은 inference_results 디렉터리로 내보내집니다.
8. Graph Generation 섹션을 실행하여 기공 조리개 비율에 대한 그래프를 만들고 inference_results 디렉토리로 내보냅니다.

Pto의 분무 접종 후, 접종한 식물에 부착된 잎의 기공을 휴대용 기공 영상 장치로 직접 관찰했습니다. 수동 및 자동 측정을 사용하여 동일한 잎 이미지를 사용하여 약 60개의 기공의 너비와 길이의 비율을 취하여 기공 구멍을 계산했습니다. 수동 및 자동 측정은 접종 후 1시간(hpi)에 모의 접종된 식물과 비교하여 Pto 접종 식물의 기공 구멍이 감소한 것으로 일관되게 나타났으며(그림 3A,B), 이는 A thaliana 식물이 Pto 침입에 반응하여 기공을 닫는다는 것을 나타냅니다. 3 hpi에서, Pto를 접종한 식물과 모의 접종을 한 식물의 기공 구멍은 거의 동일했으며(그림 3C,D), Pto에 의한 기공 재개를 연상시킵니다. 놀랍게도, 기공 조리개의 자동 측정은 하나의 이미지를 처리하는 데 약 5초밖에 걸리지 않았으며(표 1), 수동 측정에 비해 측정 시간을 95% 이상 단축했습니다. 따라서 이 프로토콜은 박테리아 병원체에 대한 A. thaliana의 동적 기공 반응을 추적하기 위한 운영상 간단하고 노동력 절감 수단을 제공합니다.

그림 1: 휴대용 이미징 장치 무대 위에 나뭇잎이 놓여 있는 휴대용 이미징 장치(왼쪽)와 상단 덮개가 닫힌 상태(오른쪽)를 묘사한 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 기공 개구 측정의 개략도. (A) 기공 구멍은 흰색 화살표로 표시된 것처럼 장(요)루의 너비와 길이의 비율을 계산하여 결정합니다. (B) 조기 기공 및 (C) 모호한 기공은 측정에서 제외해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 온전한 전체 식물에서 Pto에 대한 기공 반응. A. thaliana 식물에 모의 또는 Pto를 분무 접종하고, 접종된 식물에 부착된 잎의 기공을 휴대용 기공 영상 장치에 의해 (A,B) 1hpi 및 (C,D) 3hpi에서 직접 관찰하였다. 기공 조리개(비율)는 (A,C) 수동 및 (B,D) 자동 측정으로 계산되었습니다. p-값은 양측 t-검정으로 계산되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 이미지당 기공 조리개의 수동 및 자동 측정 처리 시간. 처리 시간의 평균 및 표준 편차(SD)는 9개의 대표 이미지 측정에서 계산되었습니다.

이전 연구에서는 세균 침입에 대한 기공 반응을 조사하기 위해 표피 껍질, 잎 디스크 또는 분리된 잎을 사용했다 ^9,11,12. 대조적으로, 본 연구에서 제안된 방법은 휴대용 기공 영상 장치를 활용하여 Pto를 분무 접종한 후 식물에 부착된 잎의 기공을 직접 관찰하여 박테리아 침입의 자연 조건을 모방합니다. 또한 이 방법은 잎 분리, 잎 디스크 절제 및 표피 박리와 같은 파괴적인 샘플 준비 프로세스를 포함하지 않기 때문에 이러한 샘플 준비 프로세스와 관련된 상처 및 수분 손실을 방지할 수 있습니다. 상처와 수분 손실은 필연적으로 기공 운동에 영향을 미치는 식물 호르몬인 자스모네이트(jasmonate)와 아브시스산(abscisic acid)과 같은 식물 유래 신호를 생성하기 때문에 이러한 효과를 가볍게 여겨서는 안 된다^13,14.

휴대용 장루 영상 장치를 최적으로 사용하기 위한 몇 가지 지침이 있습니다. 첫째, 잎 표면에서 물방울을 철저히 제거하는 것이 최적의 선명도와 초점의 이미지를 얻는 데 가장 중요합니다. 둘째, 초점을 미세 조정하기 위해 조절 나사를 조작하여 동일한 잎 영역에서 여러 이미지를 촬영하는 것이 좋습니다. 이 관행은 잎 면적당 분석 가능한 기공의 수를 증가시켜 잠재적인 샘플링 편향을 완화할 것으로 예상됩니다. 마지막으로, 장치로 잎을 꼬집을 때 잎이 손상되지 않도록 조심스럽게 다루어야 합니다. 이는 매우 중요한데, 그 이유는 상처가 기공 폐쇄를 유도하는 단서 중 하나이기 때문이다¹⁴.

기공 조리개는 수동 측정보다 자동 측정에서 더 가변적인 경향이 있었습니다(그림 3). 여기에는 몇 가지 이유가 있을 수 있습니다. 이미지 분석 파이프라인에 의해 추론된 기공 기공은 종종 기공 기공(⁷)을 둘러싼 보호세포의 세포벽 및/또는 그림자를 포함하는 것으로 보고되었는데, 이는 사람의 눈으로 수동으로 측정하는 경우에는 그렇지 않다. 특이한 모양의 기공은 수동 측정과 자동 측정 사이의 차이에도 영향을 미칠 수 있지만, 기공 검출 모델은 이러한 기공을 분석에서 제외하도록 훈련되었다⁷. 몇몇 기공은 자동 측정에서 기공 구멍에 대해 0 값을 받았지만 알 수 없는 이유로 수동 측정에서는 아무 값도 주어지지 않았습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 향후 모델 업데이트가 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 자동 기공 개구 측정은 기본적으로 수동 측정과 일치하기 때문에 현재 버전의 이미지 분석 파이프라인이 실용적입니다.

이 연구에서 기술된 A. thaliana의 기공 구멍에 대한 직접 관찰 및 자동 측정은 식물 환경 적응에서 기공의 역할을 밝히기 위한 다양한 응용 분야에 대한 가능성을 제시합니다. 예를 들어, 제시된 방법은 가뭄과 같은 비생물적 스트레스뿐만 아니라 MAMP 및 미생물 병원체와 같은 생물학적 스트레스에 노출된 후 온전한 전체 식물 시스템에서 기공 구멍을 빠르게 정량화하는 데 광범위하게 적용할 수 있어야 합니다. 이를 뒷받침하기 위해 이전 연구에서는 기공 개방을 유도하는 곰팡이 독소 푸시코신 또는 기공 폐쇄를 유도하는 스트레스 호르몬 앱시식산으로 처리한 "잎 디스크"의 기공 개구를 정확하게 정량화하는 데 성공했습니다⁷. 더욱이, 원칙적으로 휴대용 이미징 장치는 식물에 부착된 하나의 동일한 잎에서 기공 구멍의 장기 시간 경과 분석을 허용합니다. 이것은 식물-미생물 상호작용의 새로운 측면에 대한 실마리를 제공할 수 있는데, 왜냐하면 대부분의 연구들이 상호작용의 처음 몇 시간 동안 박테리아 병원체에 대한 기공 반응에 초점을 맞추었기 때문이다 ^9,10,11. 다양한 환경 조건에서 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 탐구하기 위해 제시된 방법을 채택하고 수정하는 것도 흥미로울 것입니다. 이는 특히 세균성 병원체에 의한 기공 운동 및 질병 발생에 영향을 미치는 온도, 습도 및 토양 수분 가용성과 같은 환경 요인의 영향을 이해하는 것과 관련이 있습니다 ^8,15. 결론적으로, 제시된 방법은 지금까지 달성할 수 없었던 실험 환경에서 식물-미생물 상호 작용 안팎의 기공 기능에 대한 연구를 가속화하기 위해 구상될 것입니다.

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

유익한 토론을 해주신 '식물-미생물 홀로비온트 조립을 통한 식물 적응 형질의 공동 창조'라는 연구 프로젝트의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 Grant-in-Aid for Transformative Research Areas(21H05151 및 21H05149 - A.M. 및 21H05152 to Y.T.) 및 Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research(22K19178 - A. M.)의 지원을 받았습니다.