Method Article
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.
סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המצויות באפידרמיס עלי הצמח. ויסות הצמצם הסטומטלי חיוני לא רק לאיזון ספיגת פחמן דו-חמצני לצורך פוטוסינתזה ואיבוד מים טרנספירטיביים, אלא גם להגבלת פלישת חיידקים. בעוד שצמחים סוגרים פיוניות עם זיהוי חיידקים, חיידקים פתוגניים, כגון מזרקי Pseudomonas pv . עגבניה DC3000 (Pto), פתח מחדש את הפיוניות הסגורות כדי לקבל גישה לפנים העלה. בבדיקות קונבנציונליות להערכת תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים, קליפות אפידרמיס עלים, דיסקיות עלים או עלים מנותקים צפים על תרחיף חיידקי, ולאחר מכן נצפו פיוניות תחת מיקרוסקופ ואחריו מדידה ידנית של צמצם סטומטלי. עם זאת, בדיקות אלה מסורבלות ועשויות שלא לשקף תגובות סטומאטליות לפלישה חיידקית טבעית בעלה המחובר לצמח. לאחרונה פותח מכשיר הדמיה נייד שיכול לצפות בפיוניות על ידי צביטת עלה מבלי לנתק אותו מהצמח, יחד עם צינור ניתוח תמונה מבוסס למידה עמוקה שנועד למדוד באופן אוטומטי את הצמצם הסטומטלי מתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר. כאן, בהתבסס על התקדמות טכנית זו, שיטה חדשה להערכת תגובות stomatal לפלישת חיידקים Arabidopsis thaliana מוצג. שיטה זו מורכבת משלושה שלבים פשוטים: חיסון ריסוס של Pto המחקה תהליכי זיהום טבעיים, תצפית ישירה של פיוניות על עלה של צמח מחוסן Pto באמצעות מכשיר הדמיה נייד, ומדידה אוטומטית של צמצם stomatal על ידי צינור ניתוח תמונה. שיטה זו שימשה בהצלחה כדי להדגים סגירה סטומטית ופתיחה מחדש במהלך פלישת Pto בתנאים המחקים באופן הדוק את האינטראקציה הטבעית בין צמחים לחיידקים.
סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המוקפות בזוג תאי שמירה על פני השטח של עלים וחלקים אוויריים אחרים של צמחים. בסביבות המשתנות ללא הרף, ויסות הצמצם הסטומטלי הוא מרכזי עבור צמחים כדי לשלוט בספיגת הפחמן הדו-חמצני הנדרשת לפוטוסינתזה על חשבון איבוד מים באמצעות טרנספירציה. לפיכך, כימות הצמצם הסטומטלי סייע להבנת ההסתגלות הסביבתית של הצמח. עם זאת, כימות הצמצם הסטומטלי הוא מטבעו זמן רב ומסורבל מכיוון שהוא דורש עבודה אנושית כדי לזהות ולמדוד נקבוביות סטומטליות בתמונת עלה שצולמה במיקרוסקופ. כדי לעקוף מגבלות אלה, פותחו שיטות שונות כדי להקל על כימות הצמצם הסטומטלי ב- Arabidopsis thaliana, צמח מודל המשמש באופן נרחב לחקר ביולוגיה סטומטית 1,2,3,4,5,6. לדוגמה, ניתן להשתמש בפורומטר כדי למדוד את קצב השעתוק כמדד של מוליכות סטומטלית. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת מידע ישיר על מספר הסטומטלית והצמצם הקובעים את המוליכות הסטומטלית. מחקרים מסוימים השתמשו בטכניקות מיקרוסקופיה קונפוקלית המדגישות נקבוביות סטומאטליות באמצעות סמן אקטין פלואורסצנטי, צבע פלואורסצנטי או אוטופלואורסצנטיות של דופן התא 1,2,3,4,5. בעוד שגישות אלה מקלות על איתור פיוניות, העלות הן של הפעלת מתקן מיקרוסקופיה קונפוקלית והן של הכנת דגימות מיקרוסקופיה יכולה להוות מכשול ליישום שגרתי. בעבודה פורצת דרך של סאי ואחרים, פותח מודל רשת עצבית עמוקה למדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי מתמונות מיקרוסקופיות בשדה בהיר של קליפות אפידרמיס A. thaliana 6. עם זאת, חידוש זה אינו פוטר חוקרים מהמשימה של הכנת קליפת אפידרמיס לתצפית מיקרוסקופית. לאחרונה, התגברו על מכשול זה על ידי פיתוח מכשיר הדמיה נייד שיכול לצפות בפיוניות על ידי צביטת עלה של A. thaliana, יחד עם צינור ניתוח תמונה מבוסס למידה עמוקה המודד באופן אוטומטי צמצם סטומטלי מתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר7.
סטומטות תורמות לחסינות מולדת של הצמח מפני פתוגנים חיידקיים. המפתח לתגובה חיסונית זו הוא סגירה סטומטית המגבילה את כניסת החיידקים דרך הנקבובית המיקרוסקופית אל פנים העלה, שם פתוגנים חיידקיים מתרבים וגורמים למחלות8. סגירה סטומטית נגרמת על ידי זיהוי של דפוסים מולקולריים הקשורים למיקרובים (MAMPs), מולקולות אימונוגניות המשותפות לעתים קרובות לסוג של מיקרובים, על ידי קולטני זיהוי תבניות מקומיות של קרום פלזמה (PRR)9. אפיטופ של 22 חומצות אמינו של שוטון חיידקי המכונה flg22 הוא MAMP טיפוסי הגורם לסגירה סטומטית באמצעות זיהויו על ידי PRR FLS210. כאמצעי נגד, פתוגנים חיידקיים כגון מזרקי Pseudomonas pv. עגבניה DC3000 (Pto) ו-Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria פיתחו מנגנוני אלימות כדי לפתוח מחדש פיוניות 9,11,12. תגובות סטומאטליות אלה לפתוגנים חיידקיים נותחו באופן קונבנציונלי בבדיקות שבהן קליפות אפידרמיס עלים, דיסקיות עלים או עלים מנותקים צפים על תרחיף חיידקי, ולאחר מכן נצפו פיוניות תחת מיקרוסקופ ואחריו מדידה ידנית של צמצם סטומטלי. עם זאת, בדיקות אלה מסורבלות ועשויות שלא לשקף תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים טבעית המתרחשת בעלה המחובר לצמח.
כאן, מוצגת שיטה פשוטה לחקור סגירה סטומטית ופתיחה מחדש במהלך פלישת Pto במצב המחקה באופן הדוק את האינטראקציה הטבעית בין צמחים לחיידקים. שיטה זו ממנפת את מכשיר ההדמיה הנייד לתצפית ישירה על פיוניות A. thaliana על עלה המחובר לצמח המחוסן ב-Pto, יחד עם צינור ניתוח התמונה למדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי.
1. גידול צמחים
2. הכנת חיסון חיידקי
3. חיסון ריסוס של חיידקים
4. תצפית ישירה על הפיוניות באמצעות מכשיר הדימות הנייד
הערה: התקן ההדמיה הסטומטלית הנייד מצויד באור LED ובמודול מצלמה ויכול לרכוש 2,592 תמונות × 1,944 (גובה × רוחב; פיקסלים) ברזולוציה של כ- 0.5 מיקרומטר לפיקסל.
5. מדידה ידנית של צמצם סטומטלי
הערה: ניתן להוריד את תוכנת ImageJ בכתובת https://imagej.nih.gov/ij/download.html
6. מדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי
הערה: צינור ניתוח התמונות פועל ב- Google Colaboratory, סביבת הפעלה של שפת תכנות Python בענן. למשתמשים חייב להיות חשבון Google חוקי עם כונן Google פעיל, דפדפן Google Chrome וחיבור אינטרנט יציב כתנאי מוקדם.
לאחר חיסון ריסוס של Pto, פיוניות על עלים המחוברים לצמחים המחוסנים נצפו ישירות על ידי מכשיר הדמיה סטומטלי נייד. באמצעות מדידות ידניות ואוטומטיות, אותן תמונות עלים שימשו לחישוב צמצם סטומטלי על ידי לקיחת יחסים של רוחב לאורך של כ -60 פיוניות. מדידות ידניות ואוטומטיות הצביעו באופן עקבי על ירידה בצמצם הסטומטלי בצמחים שחוסנו ל-Pto בהשוואה לצמחים מחוסנים מדומה שעה אחת לאחר החיסון (hpi) (איור 3A,B), מה שמצביע על כך שצמחי תאליאנה נסגרים בפיוניות בתגובה לפלישת פטו. ב-3 hpi, הצמצם הסטומטי בצמחים שחוסנו ב-Pto ובצמחים שחוסנו ב-Mock היה כמעט זהה (איור 3C,D), מה שמזכיר את הפתיחה מחדש של הסטומטלית על-ידי Pto. למרבה הפלא, המדידה האוטומטית של צמצם סטומטלי ארכה רק כ-5 שניות לעיבוד תמונה אחת (טבלה 1), מה שקיצר את זמן המדידה ביותר מ-95% בהשוואה למדידה הידנית. לפיכך, פרוטוקול זה מציע אמצעי פשוט מבחינה תפעולית וחוסך עבודה כדי לעקוב אחר תגובות stomatal דינמיות של A. thaliana לפתוגן חיידקי.
איור 1: מכשיר הדמיה נייד. תמונות המתארות את מכשיר ההדמיה הנייד עם דף מוצב על הבמה (משמאל) ועם הכריכה העליונה סגורה (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיאגרמה סכמטית של מדידת צמצם סטומטלי. (A) צמצם סטומטלי נקבע על ידי חישוב היחס בין רוחב לאורך סטומה, כפי שמצוין על ידי חיצים לבנים. (B) יש להוציא מהמדידה פיוניות מוקדמות ו-(ג) מעורפלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תגובות סטומאטליות ל-Pto בצמח שלם שלם. צמחי A. thaliana רוססו ב-mock או Pto, ופיוניות על עלים שהוצמדו לצמחים המחוסנים נצפו ישירות ב-(A,B) 1 hpi ו-(C,D) 3 hpi על ידי מכשיר הדמיה סטומטלי נייד. צמצם סטומטלי (יחס) חושב על ידי מדידות ידניות (A,C) ו-(B,D) אוטומטיות. ערכי P חושבו על ידי מבחן t דו-זנבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
זמן עיבוד (ים) | ||
שיטת | התכוון | SD |
ידני | 130.1 | 48.8 |
אוטומטיות | 4.7 | 0.8 |
טבלה 1: זמן עיבוד למדידות ידניות ואוטומטיות של צמצם סטומטלי לכל תמונה. אמצעים וסטיות תקן (SD) של זמן עיבוד חושבו מתוך מדידות של תשע תמונות מייצגות.
מחקרים קודמים השתמשו בקליפות אפידרמיס, דיסקיות עלים או עלים מנותקים כדי לחקור תגובות סטומאטליות לפלישות חיידקים 9,11,12. לעומת זאת, השיטה המוצעת במחקר זה ממנפת את מכשיר הדימות הסטומטלי הנייד כדי לצפות ישירות בפיוניות על עלה המחובר לצמח לאחר חיסון בתרסיס של Pto, המחקה תנאים טבעיים של פלישת חיידקים. בנוסף, מכיוון ששיטה זו אינה כרוכה בתהליכי הכנת דגימות הרסניים כגון ניתוק עלים, כריתת דיסק עלה וקילוף אפידרמיס, ניתן להימנע מפצעים ואיבוד מים הקשורים לתהליכי הכנת הדגימות. אין להקל ראש בהשפעות אלה, שכן פציעה ואיבוד מים מייצרים בהכרח אותות שמקורם בצמחים כגון פיטוהורמונים יסמונאט וחומצה אבסציסית המשפיעים על תנועות סטומטליות13,14.
ישנן מספר הנחיות לשימוש מיטבי במכשיר הדמיה סטומטלית נייד. ראשית, הסרה יסודית של טיפות מים ממשטחי העלים היא בעלת חשיבות עליונה לקבלת תמונות של בהירות ומיקוד אופטימליים. שנית, מומלץ לצלם תמונות מרובות מאזורי עלים זהים על ידי מניפולציה של בורג הכוונון כדי לכוונן את המיקוד. פרקטיקה זו צפויה להגדיל את מספר הפיוניות הניתנות לניתוח לכל אזור עלה, ובכך להפחית הטיות דגימה פוטנציאליות. לבסוף, כאשר צובטים עלה עם המכשיר, נדרש טיפול זהיר כדי למנוע גרימת נזק לעלה. זה קריטי מכיוון שפציעה היא אחד הרמזים שמעוררים סגירה סטומטית14.
הצמצם הסטומטלי נטה להיות משתנה יותר במדידה האוטומטית מאשר במדידה הידנית (איור 3). ישנן מספר סיבות אפשריות לכך. בעבר דווח כי נקבוביות סטומטליות המוסקות על ידי צינור ניתוח התמונה כוללות לעתים קרובות קירות תאים ו / או צללים של תאי שמירה המקיפים את נקבובית סטומטל7, מה שאינו המקרה במדידה ידנית על ידי עיניים אנושיות. סטומטות עם צורות חריגות עשויות להשפיע גם על השונות בין מדידות ידניות ואוטומטיות, אם כי מודל זיהוי הפיוניות אומן להוציא פיוניות כאלה מהניתוח7. מספר פיוניות קיבלו ערכי אפס עבור צמצם סטומטלי במדידה האוטומטית, אך אף אחת מהן לא בוצעה במדידה הידנית מסיבות לא ידועות. ייתכן שיהיה צורך בעדכונים עתידיים של המודלים כדי לטפל בבעיות אלה. עם זאת, מכיוון שמדידת הצמצם הסטומטלית האוטומטית תאמה למעשה את המדידה הידנית, הגרסה הנוכחית של צינור ניתוח התמונה היא שימושית מעשית.
התצפית הישירה והמדידה האוטומטית של צמצם סטומטלי ב- A. thaliana המתוארים במחקר זה טומנים בחובם יישומים שונים להבהרת תפקיד הפיוניות בהסתגלות סביבתית של צמחים. לדוגמה, השיטה המוצגת צריכה להיות ישימה באופן נרחב לכימות מהיר של צמצם סטומטלי במערכת צמחית שלמה שלמה לאחר חשיפה לעקות ביוטיות כגון MAMPs ופתוגנים מיקרוביאליים, כמו גם לעקות אביוטיות כגון בצורת. כדי לתמוך בכך, מחקר קודם יישם בהצלחה את צינור ניתוח התמונות כדי לכמת במדויק את הצמצם הסטומטלי של "דיסקי עלים" שטופלו ברעל הפטרייתי פוסיקוצין שגורם לפתיחת סטומטלית או בהורמון הלחץ חומצה אבסציסית שגורם לסגירת סטומטלית7. יתר על כן, באופן עקרוני, מכשיר ההדמיה הנייד מאפשר ניתוח ארוך טווח של הצמצם הסטומטלי על עלה זהה יחיד המחובר לצמח. זה עשוי לשפוך אור על היבטים חדשים של אינטראקציות צמחים-מיקרואורגניזמים מאחר שרוב המחקרים התמקדו בתגובות סטומאטליות לפתוגנים חיידקיים בשעות הראשונות של האינטראקציה 9,10,11. יהיה מעניין גם להשתמש ולשנות את השיטה המוצגת כדי לחקור תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים בתנאים סביבתיים שונים. זה רלוונטי במיוחד להבנת ההשפעות של גורמים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות וזמינות מי קרקע המשפיעים על תנועות סטומטליות והתפתחות מחלות על ידי פתוגנים חיידקיים 8,15. לסיכום, השיטה המוצגת צפויה להאיץ את המחקר על תפקודים סטומטיים באינטראקציות צמחים-מיקרואורגניזמים ומעבר להם תחת סביבות ניסוי שלא ניתן היה להשיג עד כה.
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
אנו מודים לכל חברי פרויקט המחקר, "יצירה משותפת של תכונות אדפטיביות צמחיות באמצעות הרכבה של הולוביונט צמחי-מיקרובי", על דיונים פוריים. עבודה זו נתמכה על ידי Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 ו-21H05149 עד A.M. ו-21H05152 ל-Y.T.) ו-Grant-in-Aid for Challenge Exploratory Research (22K19178 to A. M).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
Glycerol | Wako | 072-00626 | |
Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
KCl | Wako | 163-03545 | |
KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved