양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

이 프로토콜은 효율적으로 세포 분열의 동기화를 통합 하 여 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열을 연구 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링 그리고 양적 이미징 분석입니다.

어떻게 포유류의 세포 연구 규제는 3d 환경 크게 그것의 생리 적인 관련성 및 치료의 중요성에도 불구 하 고 미개척 남아. 탐험의 부족에 대 한 가능한 이유는 실험 제한 및 비효율적인 3D 문화에서의 세포 연구를 렌더링 하는 기술적 과제 이다. 여기는 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 상호 작용 3D 콜라겐 매트릭스에 효율적으로 공부 하는 영상 기반 방법에 설명 합니다. 형광 H2B 표시 셀 티 미 딘 및 nocodazole 처리, 기계적인 동요-오프 기술에 의해 다음의 조합을 사용 하 여 동기화 됩니다. 동기화 된 셀 다음 3D 콜라겐 매트릭스에 포함 됩니다. 세포 분열은 라이브 셀 현미경을 사용 하 여 모니터링 됩니다. 변형 콜라겐 섬유의 세포 분열, 세포-매트릭스 상호 작용은, 전후 동안 모니터링할 수 있습니다 그리고 양적 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 계량. 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 순수 관련 3D 환경에서 상호 작용을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 방법은 정상 조직과 질병 개발의 분자 기초에 새로운 통찰력을 제공 뿐만 아니라 또한 새로운 진단 및 치료 접근의 디자인에 대 한 수 있습니다.

세포 유사 분열의 규제 조직 및 장기 개발에 중요 한 역할 세포 인생에서 중요 한 이벤트입니다. 비정상적인 유사 분열은 자연 유전 변이, 인간의 노화 과정과 암^1,2,3,,45의 진행에 연루 됩니다. 정상 세포와 비교 하는 종양 세포의 증식의 증가 속도 사실 셀 동작 종양의 종류 및 환자 중 에서도 상당히 이질적인에 불구 하 고 암의 특징 중 하나입니다. 유망한 임상 결과도 불구 하 고 일부 새로 개발 된 antimitotic 약물 임상 시험^{6,7,,89,10 에에서 효과가 표시 되지 않은 11}. 실험 및 전 임상 모델의 관련성 고려 될 수 있다. 많은 유형의 정상 포유류 및 암 세포 섬유 아 세포와 콜라겐-풍부한 3D 결합 조직, fibrosarcoma 셀과 전이성 암 세포는 3D stromal 세포 외 기질 (ECM)에 같은 3 차원 (3D) 행렬에 나눕니다. 그러나, 포유류 세포 분열 실험 및 분석의 대다수가 2 차원 (2D) 기판에 경작 하는 세포에 수행 되었습니다. 미세, 기계적 특성, 및 두 정상과 pathologic 조직^12,,1314, 의 3D ECM의 생 화 확 적인 신호 설계 3D 매트릭스 정리 더 수 ^15,,1617.

어떻게 포유류의 세포 연구 규제 차원에서 환경 생리 관련성 및 치료 중요성^18,19도 불구 하 고 크게 미개척 남아. 가능한 이유는 기술적인 어려움 및 3D 매트릭스에서 세포 분열을 공부와 관련 된 실험 과제 포함 됩니다. 세포의 유사 분열 전체 세포 주기²⁰에 극히 일시적인 구성합니다. 이전 작업을 인간 유 방 선 암 MCF-7, 인간의 다리 U2OS, 그리고 인간의 간 같은 많은 포유류 세포의 확산 속도 보이고 있다 HepG2에 훨씬 낮은 3D 매트릭스 2D 기판^{21에 그들의 대조 물과 비교 22}. 또한, 세포 3D 매트릭스에 포함 된 라이브 셀 이미징 동안 초점 밖으로 이동 합니다. 이러한 모든 요소는 이미징 기술을 사용 하 여 3D 문화에서 세포 분열 이벤트 캡처의 매우 낮은 효율에 기여.

세포와 ECM 사이 상호 작용 세포 분열 조절에 중요 한 역할을 재생 합니다. 여기, 우리는 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열을 효율적으로 공부 하는 방법을 설명 합니다. 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링 뿐만 아니라 세포, 세포 분열의 동기화 mitotic 마커의 포함 하는 메서드 및 양적 이미징 분석입니다. 형광 표시 된 히스톤 단백질 H2B mitotic 차별화 및 interphase 셀 표식으로 셀에 처음 소개 된다. 다음 셀 티 미 딘 및 nocodazole 처리, 기계적인 동요-오프 기술에 의해 다음의 조합을 사용 하 여 동기화 됩니다. 동기화 된 세포는 직접 3D 콜라겐 매트릭스에 캡슐화 됩니다. 여러 셀의 세포 분열 이벤트 낮은 확대 경과 라이브 셀 이미징에 효율적으로 사용 하 여 모니터링 됩니다. 세포-매트릭스 상호 작용은, 콜라겐 섬유의 변형 고배율에서 반사 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 모니터링 됩니다.

우리가 감시 하 고 세포-매트릭스 상호 작용 하는 동안과 이후, 이전 두 개의 전이성 암 세포 선, 인간의 침략 적인 ductal 암 MDA-MB-231 및 3D 콜라겐에서 인간의 fibrosarcoma HT1080 세포의 유사 분열을 계량이 기술을 사용한 이전 행렬¹⁹. 여기에 제시 된 방법 3D 환경과 세포-매트릭스 상호 작용에서 모두 포유류 세포 분열을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근을 제공 합니다. MDA-MB-231 셀 라인 종이 걸쳐 예제로 사용 됩니다. 이 프로토콜의 정상 조직과 질병, 개발의 분자 기초에 새로운 통찰력을 제공 하 고 또한 새로운 진단 및 치료 접근의 디자인에 대 한 수 있습니다.

제공 하는 프로토콜의는 홈 우드 기관 검토 위원회 (HIRB) 지침을 따릅니다.

1. 안정적인 표현의 H2B mCherry 마커로 세포 유사 분열에 대 한

1. 인간 미 발달 신장 293T에서에서 lentiviral 입자 (HEK 293T)의 세포
   1. HEK 293T 세포 세포 배양 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 포함 된 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 그리고 1%에에서 10⁶ 셀/접시 x 5의 밀도에서 10 cm 세포 문화 접시에 접시 페니실린-스 (펜/Strep)). 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO₂)에서 24 h에 대 한 품 어. Transfection 당일 셀의 원하는 confluency 약 70-80% 이다.
      참고: HEK 293T 세포는 여기 사용 됩니다 나중 transduce MDA-MB-231 셀을 안정적으로 H2B mCherry 표현 셀 라인을 생성 하려면 바이러스 입자를 생산 하는 데 사용 됩니다. 셀은 접시에 걸쳐 고르게 분포 하 고 있는지 확인 합니다. 셀의 추가 삭제 플레이트, 현명 하 고 부드럽게 이동 뒤로 앞 접시 분산에 도움이 될 수 있습니다. 셀 또는 바이러스 성 입자의 다른 볼륨의 컬렉션 귀 착될 것 이다 다른 크기의 플라스 크에 시드할 수 있습니다.
   2. Transfection 시 약을 사용 하 여 3 개의 플라스 미드 (lentiviral 벡터, CMV ΔR 8.91, 및 pMDG-VSVG)와 HEK 293T 세포 transfect H2B mCherry 인코딩 플라스 미드 lentiviral 벡터 phosphoglycerate 키 발기인 (PGK)에서 복제 됩니다. CMV ΔR 8.91 3 필수 HIV 유전자, 개 그, 폴및 회전을 포함합니다. pMDG-VSVG VSV G 봉투 유전자를 포함 되어 있습니다.
      참고: 여러 transfection 에이전트에서 선택할 수 있습니다.
      1. Transfection 시 약 실 온 (RT) 도달의 유리병 사용 하기 전에 수 있습니다. 반전 또는 소용돌이 짧게 유리병입니다.
      2. H2B mCherry 플라스 미드의 6 µ g, CMV ΔR 8.91의 8 µ g의 감소 된 혈 청 미디어의 1 mL에 pMDG-VSVG, 2 µ g으로 구성 된 DNA의 믹스 16 µ g. 5 분에 대 한 RT에서 품 어.
         참고: 금액 및 3 개의 벡터의 비율은 다양 하 고 다른 lentiviral 전송 벡터에 대 한 최적화.
      3. 48 µ L 추가 (DNA의 1:3 비율을 사용 하 여: transfection 시 약) 위의 DNA 솔루션으로 transfection 시 약의 다음 RT에 적어도 15 분 동안 품 어 고.
         참고: transfection 시 약 대 DNA의 비율은 다양 하 고 다른 lentiviral 전송 벡터에 대 한 최적화. Transfection 시 약 1.5 mL 원심 분리기 튜브의 측면을 연결 하지 못한 다는 것을 확인 하십시오.
      4. 셀에 drop-wise 단계 1.1.2.3에서에서 만든 DNA 지질 복잡 한 솔루션을 추가 합니다. 부드럽게 접시에 복잡 한의 동등한 배급을 보장 하기 위해 플레이트를 소용돌이 친다.
   3. Transfection, 후 대략 6 h 매체를 발음 하 고 신선한 세포 배양 매체 추가 (DMEM과 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 1% 펜/Strep).
   4. 표면에 뜨는 24, 48, 및 72 h 후 transfection 수확. 각 수확 후 매체를 대체 (DMEM, 4.5 g/L 포도 당, 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).
   5. 세포질 파편을 제거 하는 0.45 μ m 필터를 통해 lentiviral 입자를 필터링 합니다. 또는, 세포 파편 분리 하 상쾌한 아래로 회전 합니다. 상쾌한 변환, 바로 사용할 수 있습니다 또는-80 ° c.에 저장 될 수 있다
2. 셀의 세대 라인 안정적으로 표현 H2B-mCherry
   참고:이 프로토콜은 MDA-MB-231 셀에 대 한 세부 사항에 설명 되어 있습니다. 실험에 사용 하기 전에 인간의 유 방 암 세포 MDA-MB-231 (물리 과학 종양학 센터, NIH) 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 포함 된 DMEM에 교양 펜/Strep.
   1. 35 mm 문화 접시에 1 x 10⁵ 셀의 밀도에서 MDA-MB-231 셀 접시
      참고: 다른 셀 라인에 대 한 도금의 밀도 최적화 해야 하 고 따라서 MDA-MB-231 셀에 대 한 최적의 밀도에서 다를 수 있습니다.
   2. 셀, 도금 후 24 h 1 mL 신선한 매체의 1 mL 및 바이러스의 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).
   3. 하룻밤에 6 h의 시간 동안 세포를 품 어.
      참고: 바이러스의 외피 시간 모두 볼륨 다른 세포에 최적화 될 필요가 있다. 예를 들어, 셀 보이지 않는 건강 한 바이러스의 추가 후에 몇 시간, 바이러스 및 2 mL 신선한 매체의 1 mL 사용 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep) 단계 1.2.2. 1.2.3 단계에서 부 화 시간 또한 줄어들 수 있습니다.
   4. 매체를 발음 하 고 10 mL 신선한 매체의 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS 1% 펜/Strep). 37 ° C, 5% CO₂에서 24 ~ 72 시간 사이 품 어.
   5. H2B-mCherry epifluorescence 현미경을 사용 하 여 셀에 식을 확인 합니다.
      참고: 변환 효율 셀에 낮은 경우에, 단계 2.2에서에서 바이러스와 단계 2.3에서에서 보육 시간 볼륨 수 증가.

2. 안정적으로 H2B mCherry을 표현 하는 세포의 동기화

1. 50 ~ 60 %confluency, 즉 플레이트 2 x 10⁴ MDA-MB-231에서 셀 24-잘 접시의 각 음에 세포 격판덮개.
2. 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO₂ 문화를 품 어.
3. 매체의 0.5 mL에 성장 매체를 바꿉니다 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep) 2mm 티 미 딘을 포함 하 고 24 시간에 대 한 인큐베이터에서 두고.
   참고: 셀에 티 미 딘 노출 세포 성장 (G1)의 단계에서 체포 / DNA 합성 (S) 전환 및 DNA 종합의 금지로 인해 S 단계에 걸쳐. 보육 시간 다양 하 고 다른 셀 라인에 대 한 최적화 해야 합니다.
4. 티 미 딘 노출에서 셀을 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 세 번 그들을 세척 하 여 놓습니다. 다음, 정상적인 세포 배양에 있는 셀을 품 어 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS 1% 펜/Strep) 5 h.
   참고: 티 미 딘 노출에서 셀의 릴리스 수 있습니다 세포 성장 (G2)을 진행 하는 세포/셀 mitotic (M) 단계 이전 g 1/S 단계에서 체포 하 고는 S에서 체포 이전 셀에 대 한 g 1 단계로 단계. 출시 시간 다양 하 고 다른 셀 라인에 대 한 최적화 해야 합니다.
5. 12 h에 대 한 nocodazole의 250 ng/mL로 세포를 차단 합니다.
   참고: 모든 nocodazole에 노출 셀 G2/M 단계에서 체포 됩니다. Nocodazole은 세포 독성. Nocodazole에 장기간된 노출은 apoptosis를 발생할 수 있습니다. 세포 죽음은 관찰 하는 경우 기간 또는 다른 세포에 대 한 노출의 농도 조정 합니다. 성공적으로 동기화 되는 셀 구형 형태를 전시할 것 이다.
6. 45에 대 한 셀을 흔들어 s 궤도 셰이 커를 사용 하 여 150 ~ 200 rpm에서 1 분.
   참고: 있는 기판에 작은 부착, Mitotic 세포 됩니다 수 동요 과정에서.
7. 원심 분리기 튜브에 매체를 pipetting으로 세포를 추출 하는 매체를 제거 한 다음 0.5 mL 신선한 매체의 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep) 격판덮개의 각각 잘.
8. 2.6 및 2.7 3 번 단계를 반복 합니다.
9. 3 분 동안 800 x g에 mitotic 세포를 포함 하는 수집된 매체 원심
   참고:이 단계는 셀 매체에서는 nocodazole를 제거 하는 데 사용 됩니다.

3. 법인은 동기화의 세포는 콜라겐으로 나 행렬

참고: 유형 I 교원 질은 인간의 신체에서 가장 풍부한 단백질의 결합 조직 ECM에 따라서은 널리 사용 되 고 함수는 3D 환경^{17,23,24에 의해 변조는 어떻게 진 핵 세포를 조사 하} . 콜라겐은 초 산에 용 해. 중화 후 20-37 ° c 콜라겐 솔루션 온난화, 콜라겐 단위체 교원 질 소의 meshwork에 유해.

1. DMEM 분말, 나트륨 중 탄산염 (NaHCO₃)의 3.7 g, 증류수 50ml에 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES)의 1 g의 패킷을 용 해 하 여 10 x DMEM 솔루션을 준비 합니다. 다음 증류수 50 mL 펠 릿 NaOH 2g을 용 해 하 여 1 M 수산화 나트륨 (NaOH)의 준비 및 솔루션을 필터링 합니다. 필터 하 고 약 1.5 mL 원심 분리기 관으로 수.
   참고: 일반 DMEM 솔루션이이 단계에서 사용할 수 없습니다. 콜라겐 솔루션의 중요 한 볼륨의 추가 매체를 희석 것 이다. 따라서 집중된 DMEM 솔루션 콜라겐 매트릭스에서 DMEM의 최종 농도 정상 DMEM 동일 될 준비가 되어 있습니다.
2. 세포 단계 2.9에서에서 수집한와 함께 작동 하도록 계속 합니다. 매체, 그리고 중단 다시 셀에 약 0.25-0.5 mL 신선한 세포 배양 매체의 발음 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).
   참고: 콜라겐 매트릭스에 특정 세포 밀도 도달 하는에 셀의 초기 밀도 수 없습니다 너무 낮은. 따라서, 다시 셀을 일시 중단 하는 데 사용 하는 매체의 볼륨 사용할 수 있는 셀의 총 수에 따라 달라 집니다.
3. Hemocytometer를 수 용액에 셀의 밀도에 3.2 단계에서 다시 정지 셀 솔루션의 장소 10 µ L.
4. 3D 콜라겐 매트릭스 수 있도록 모든 구성 요소에 필요한 볼륨을 결정 합니다. 500 µ L 2 µ g / µ L 콜라겐 젤의 사용 예를 들어 여기.
   1. 40, 000 셀/mL (또는 콜라겐 젤의 500 µ L에 대 한 20000 셀)을 얻는 데 필요한 셀 솔루션의 볼륨을 계산 합니다. µ L에이 숫자는 X. 50 µ L 10 x DMEM 필요 하 게 됩니다. FBS의 50 µ L은 필요 합니다.
   2. 콜라겐 나 재고 필요한 볼륨을 계산 합니다. 콜라겐의 농도 4 µ g / µ L 주위입니다. µ L에 필요한 콜라겐의 양은 Y 이다.
   3. 수산화 나트륨의 볼륨 콜라겐 솔루션에 아세트산을 중화 하는 데 필요한 계산: Y µ L 콜라겐 * 0.023 * 1000 = Z µ L NaOH 필요.
   4. 필러 솔루션의 볼륨을 결정: (500 µ L 총 젤-X µL 셀-50 µ L 10 DMEM-FBS의 50 µ L-Y µ L 콜라겐-Z µ L X NaOH) = R µ L
      참고: 필러 솔루션은 증 류 물. 계산된 볼륨 필러 솔루션의 음수 이면 세포 현 탁 액에서 원래 셀 밀도 너무 낮습니다. 셀 다시 스핀 다운을 다시 작은 양의 중간에 중단 해야 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).
5. 깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 다음과 같은 순서로 구성 요소를 추가: 매체, 콜라겐, NaOH, 이온된 (DI) 수, FBS, DMEM x 10에에서 셀. 콜라겐 솔루션의 겔 화를 감속 하는 얼음에 모든 구성 요소를 배치 합니다. 적절 한 pipetting 기술을 사용 하 여 거품의 형성을 방지.
6. NaOH를 추가 후 1 mL를 피펫으로와 솔루션을 신중 하 게 섞는다.
   참고: 콜라겐의 겔 화 시작 됩니다 오른쪽 NaOH의 추가 직후. 혼합 신중 하 고 신속 하 게 수행 되어야 합니다.
7. 일단 솔루션은 잘 혼합 하 고, 24-잘 접시의 각 음을 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다. 37 ° C 배양 기에서 24-잘 접시를 놓습니다. 37 ° C 물 목욕에 신선한 세포 배양 매체를 배치 합니다.
   참고: 플라스틱 바닥 접시는 렌즈의 거리는 1 mm. 유리 바닥 고배율 라이브 셀 현미경 높은의 짧은 거리 때문에 사용 되는 접시 위에 낮은 확대 라이브 셀 microcopy 사용 됩니다. 확대 렌즈입니다.
8. 미리 데워 진된 매체의 500 µ L 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS 1% 펜/Strep) 젤 3.7 단계를 완료 한 후 30 분의 상단에.

4. 라이브 셀 이미징 3D 콜라겐 매트릭스 (낮은 배율)에 분할 하는 세포의

참고: 셀의 이미지는 10 X 목표 및 이미징 소프트웨어에 의해 제어 위상 대비 현미경에 장착 된 충전 결합된 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여 2 분 간격으로 수집 됩니다.

1. 대물 렌즈 위에 탑재 라이브 셀 단위를 켭니다. 안정화 될 때까지 온도 37 ° C에서, CO₂ 농도 5%에 습도 75%에서 기다립니다.
2. 현미경에 라이브 셀 단위로 젤 24-잘 접시를 넣어. 접시의 바닥을 찾아 이동한 다음 목표 렌즈까지 현미경 접시의 바닥에서 약 500 µ m에 초점을 맞추고 있다.
   참고: 셀 콜라겐 매트릭스에 너무 가까이 있는 접시의 바닥에 완전히 3D 매트릭스에 포함 되지 않습니다. 접시의 아래쪽에서 500 µ m 세포 이미징 하는 것은 셀 가장자리 효과^16,,1725에 의해 영향을 받지 않습니다 것을 보장 합니다.
3. 찾을 셀, 무대 주위를 이동 하 고 이미징에 대 한 여러 위치를 선택 합니다.
4. 시간 경과 실험 2 분 간격을 설정 합니다.
   참고: 위치 2 분 간격 동안 수행할 수 있는 최대 수는 전동된 스테이지의 움직이는 속도 이미지 캡처에 대 한 노출 시간의 길이 의해 제한 됩니다.

5. 콜라겐 네트워크 변형 세포 분열 (고배율 현미경) 동안

1. 대물 렌즈 위에 탑재 라이브 셀 단위를 켭니다. 안정화 될 때까지 온도 37 ° C에서, CO₂ 농도 5%에 습도 75%에서 기다립니다.
2. 흠 없는 3D 콜라겐 매트릭스에 콜라겐 섬유를 시각화 하려면 반사 빛 (488 nm)의 샘플을 밝게 하는 데 사용 하는 488 nm 레이저에서 잡으려고 공초점 현미경을 구성 합니다. 레이저 사용 하 여 물 집중 목표, 나 X 60 = 1.2, WD = 200 µ m 및 이미징 소프트웨어에 의해 제어 됩니다.
3. 라이브 셀 단위로 샘플 (콜라겐 매트릭스 셀)을 넣어. 접시의 바닥을 찾아 이동한 다음 목표 렌즈까지 현미경 접시의 바닥에서 약 100 µ m에 초점을 맞추고 있다. 접시의 아래쪽에서 100 µ m 세포 이미징 하는 것은 셀 가장자리 효과 의해 영향을 받지 않습니다 것을 보장 합니다.
   참고: 여기 물 침수 목표 사용 됩니다 기름 침수 렌즈 대신 기름 침수 렌즈의 작동 거리는 약 100 µ m만 하기 때문에. 기름 침수 렌즈의 사용으로 접시의 바닥에 유리의 두께 일반적으로 약 100 µ m 문제가 포즈지 않습니다.
4. 찾을 셀, 무대 주위를 이동 하 고 이미징에 대 한 여러 위치를 선택 합니다.
   참고: Confocal 현미경 광학 샘플 섹션 및만 초점면에서 신호를 캡처. 라이브 셀 시간 경과 실험 기간 동안 초점 밖으로 이동 될 수도 있습니다. 시간의 오랜 기간 동안 셀 이미지를 캡처 수 있도록, Z-스택 5 µ m 간격 연속 분할 영역에서 이미지를 수집 하는 데 사용 됩니다. 25 µ m에 걸친 5 조각의 총 몇 군데 있습니다.
5. 5 분 간격으로 시간 경과 실험을 설정 합니다.
   참고: 5 분 사용 됩니다 대신 형광 H2B mCherry, 반사, 콜라겐에 대 한 검색 및 Z-스택 스캔에 대 한 검색을 포함 하 여 여러 스캔 모드, 각 위치에 적용 됩니다 때문에 섹션 4에서에서 사용 되는 2 분 간격으로 여기. 여러 스캔 모드를 사용 하 여 낮은 확대 영상에 비해 위치 검색의 속도 감소 시킨다.
6. 계량 이미징 하위 픽셀 해상도²⁰velocimetry (PIV) 입자를 사용 하 여 해당 셀에 의해 발휘 된 힘으로 인해 셀 주변 콜라겐 매트릭스의 변형. H2B mCherry 신호 콜라겐 섬유 모두의 명확한 시각화 2D 이미지에서이 분석을 수행 할 수 있습니다. 이방성 낮은 통과 콜라겐 네트워크²⁰의 신호를 향상 시키기 위해 필터링을 적용 합니다.
7. K+ 1 프레임, 15 × 15의 지역 창 추출 프레임에서에서 (x,y)에 있는 관심의 하위 이미지 영역의 로컬 변위를 측정 하기 위해 픽셀 프레임 k에서 (x,y)에 중심으로. 다음 가장 일치 하는 (x,y) 위치 식별 * 프레임 k+ 1에서 얻은 이미지에 최대 정규화 된 교차 상관 계수 기능 위치를 통해. 변형 벡터 (x,y)로 계산 됩니다 *-(x,y).

이 문서의 목표 3 차원 행렬에 포유류 세포 분열 과정을 공부 하 고 동안 그리고 세포 분열 후 세포와 3 차원 기질 간의 상호 작용을 계량 하는 영상 기반 방법을 제시 하는입니다. 촉진 하기 위해 세포 유사 분열의 이미징, 우리 통합 H2B mCherry lentiviral 변환을 사용 하 여 MDA-MB-231 셀. 형광 단백질 활용 된 H2B interphase 셀, mitotic 세포를 구별 하 고 세포 유사 분열^19,,2026동안 여러 단계를 정의 하 mitotic 표식으로 사용 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 안정적으로 H2B-mCherry 3D 콜라겐 매트릭스 (그림 1A)에서 표현 하는 MDA-MB-231 셀의 전체 부문 과정을 모니터 할 수 있었습니다. Mitotic 단계 (의향; 프레임 1, 그림 1A); 핵 막의 해체로 시작 염색체의 개편 (prometaphase: 2 프레임); 세포 체 (분열; 프레임 3); 중간 염색체의 맞춤 (anaphase; 프레임 4); 염색체의 분리 염색체와 핵 막, 2 개의 딸 세포 (telophase/cytokinesis, 프레임 5)의 시체의 분리 개편.

3 차원 행렬에서 셀의 확산 속도가 일반적으로 3D 효율이¹⁹에 세포 분열의 모니터링 렌더링 2D 기판에 그들의 대조 물 보다 훨씬 낮은. 3D 세포 분열의 효율성 증가, 우리는 티 미 딘, nocodazole, 및 동기화 하 고 mitotic 단계에 있는 MDA-MB-231 셀 선택 쉐이크-오프 기술을 결합 하는 방법 채택. 동기화 된 셀 다음 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 여러 셀의 분할 프로세스 사용 하 여 실시간 모니터링 했습니다 라이브 셀 이미징에 10 배 확대. 셀의 약 70%는 3d (그림 2) 유사 분열의 효율적인 모니터링 되므로 콜라겐 매트릭스 (그림 2)의 형성 후 첫 2 시간 이내 분할.

셀과 그들의 주변 콜라겐 매트릭스 간의 상호 작용을 모니터링, 우리는 이미지 콜라겐 섬유, 반사 confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 현미경 검사 법 셀의 이미지를 결합. 60 X 렌즈 콜라겐 섬유의 높은 품질의 이미지의 캡처 수 있습니다. 보기의 각 필드에 적은 세포를 캡처하는 고배율 렌즈를 사용 하 여 이미징은 훨씬 낮은 처리량에 비해 낮은 배율 10 배 또는 20 X 사용 하 여. 동기화 된 전지의 대부분 콜라겐 매트릭스의 형성 후 첫 2 시간 이내 분할 이후 셀의 성공적인 동기화 크게 효율성과 같은 실험의 처리량을 향상. 행렬 변형 세포 분열 동안 전후는 시각 ( 그림 1B에서 스냅샷 표시 됩니다) 및 사용자 지정 PIV 소프트웨어를 사용 하 여 계량. 우리 계량 하 고 매트릭스 interphase 셀 mitotic 단계로 동기화 mitotic 단계 동안 변형 비교. 우리 매트릭스 변형 거의 변경 관찰 동안에 mitotic 단계 (그림 3A), 그리고 변형 보다 포스트 mitotic 단계 (그림 3B)에서 관찰 됩니다. 이 결과 포유류 세포는 최소한의 첨부 파일 주변 매트릭스와의 상호 작용 mitotic 단계에 있는 동안 보여줍니다.

그림 1: 안정적으로 H2B mCherry을 표현 하는 콜라겐 매트릭스에 포함 된 대표적인 현미경 MDA-MB-231 셀의 고배율 라이브 셀 이미징 비디오에서 얻은. (A) MDA-MB-231 셀의 mitotic 진행의 다른 단계 빨간색으로 표시 된 H2B mCherry에 의해 정의 됩니다. (B) mitotic 과정에서 콜라겐 섬유 (흰색) 시간에 따른 confocal 반사 현미경으로 시각화 됩니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 동기화 된 3D 콜라겐 매트릭스 셀의. 셀 g 2/M 단계로 동기화 되었고 콜라겐 매트릭스에 포함 된. 반면 컨트롤 동기화 분할 없이 무작위로 세포 동기화 된 세포의 약 70% 첫 2 시간 이내 나눕니다. 오차 막대 SEM는 뜻의 (표준 오차) =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: MDA-MB-231에 대 한 매트릭스 변형 정량화 interphase 및 유사 분열 중 세포. (A) 매트릭스 변형 매트릭스 포함 MDA-MB-231 셀의 크기에서 변화. 녹색 화살표 의향을 나타내고 빨간색 화살표는 telophase를 나타냅니다. (B) 의 부 량 interphase mitotic 단계 동안 MDA-MB-231 셀에 대 한 매트릭스 변형 나타내는 매트릭스 변형 세포 분열 동안 최소 이다. 오차 막대 SEM는 뜻의 (표준 오차) =. * p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3d에서 세포 분열의 이전 연구 실험 제한 및 기술 과제^18,19효율적인 아니었다. 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열의 효율적인 연구를 위한 중요 한 단계는: (1) 셀;에 mitotic 마커 형광 표시 관 (2) 세포 분열;의 동기화 (3) 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경 검사 법, 양적 이미지 분석을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링.

2D 기판에 mitotic 세포는 그들의 형태에 따라 interphase 셀에서 구별 될 수 있다, 즉, mitotic 세포는 원형 interphase 세포 밖으로 확산 하 고 기판에 단단히 부착 기판에 간신히 연결. 그러나 3 차원 행렬에서, 세포 형태학 mitotic 세포에 대 한 신뢰할 수 있는 마커 간신히 밖으로 확산 하는 일부 셀부터 이며 매트릭스^27,28라운드 유지. 따라서, 3D 매트릭스에서의 세포 연구에 대 한 셀에 mitotic 마커를 소개 하는 것이 필수적입니다. 우리는 안정적으로 H2B-mCherry MDA-MB-231 셀, telophase/cytokinesis, anaphase, 분열, 의향, prometaphase를 포함 하 여 다른 mitotic 단계에 대 한 신뢰할 수 있는 표식으로 봉사에 표현. 우리는 이전 3D 매트릭스에 interphase 셀에서 mitotic 세포를 구별 하는 것이 방식을 사용. 이 표식 기의 도움으로, 우리 또한 수 있었다 HT1080 세포, 다른 셀 라인, mitotic 위상의 길이 측정 하 2D 기판 및 3D 매트릭스¹⁹에서 분할.

혈 청 기아²⁹, mitotic 쉐이크-오프^30,31,³²및 nocodazole³²를 차단 하는 이중 티 미 딘을 포함 하 여 셀을 동기화 하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 우리는 티 미 딘 치료와 효율적으로 동기화 G2/M 단계에 MDA-MB-231 셀 nocodazole 치료 결합. 티 미 딘에 노출 셀 티 미 딘 G1/S 과도 그리고 DNA 종합의 금지로 인해 S 단계에 걸쳐 체포 됩니다. 티 미 딘 노출에서 셀의 릴리스 셀 g 1/S 단계에서 체포 G2/M 단계 그리고 S 단계에서 체포 하는 셀에 대 한 G1 셀 진행 하자. Nocodazole에 노출 하는 모든 셀 G2/M 단계에서 체포 됩니다. 반올림-최대 셀 mitotic 단계를 입력 했다 다음 동요-오프 접시에서 그리고 콜라겐 매트릭스에 직접 캡슐화. 우리는 후에 그들은 콜라겐 매트릭스 (그림 2)에 통합 하는 세포의 약 70 %2 시간 이내 분할을 보였다. 그러나 또는 셀 동기화 전에 콜라겐 매트릭스에 포함 될 수 있습니다,, 콜라겐 매트릭스의 상호 연결 된 네트워크 물리적 방 벽을 선물 바이오 확산 및 대류^33, 의 속도 감소 시킨다 ³⁴. 사실, 우리 셀 콜라겐 매트릭스 티 미 딘 및 nocodazole를 사용 하 여 동기화 하려고 하지만 효율적인 동기화를 실패. 이 결과 비효율적인 확산 및 대류 콜라겐 매트릭스를 통해 약물의 수 있습니다.

반사는 많은 biopolymers, 콜라겐 등의 내장 광학 속성입니다. 반사 confocal 현미경 검사 법 기술 시각화와 합성 고분자와 3D 콜라겐 매트릭스^{23,,2435,36에서 준비 하는 다공성 생체의 microtopography quantitates ,37}. 우리 실험실에서 우리는 콜라겐의 농도 차이가³⁸로 콜라겐 섬유 극성에 변경 사항을 모니터링 하는 기술을 설치 했다. 여기, 우리는 콜라겐 섬유 세포-매트릭스 상호 작용을 나타내는 데 반사 공초점 이미지의 시간 경과 비디오에 따라 변형 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 여기에 제시 된 대표적인 결과 mitotic MDA-MB-231 셀에 대 한 매트릭스 변형 interphase, 포유류 세포는 최소한의 첨부와 함께 상호 작용 하는 제안에 그 세포 보다 훨씬 작은 표시는 주변 매트릭스 mitotic 단계¹⁹들어가면.

이전에, 우리가 감시 하 고 세포-매트릭스 상호 작용 하기 전에, 중 및 후에 HT1080 세포의 유사 분열을 계량 반사 confocal 현미경 검사 법 사용. 우리는 또한 interphase와 mitotic 단계 동안 β1 integrin 눕 HT1080 세포에 의해 매트릭스 변형 모니터링. 크게 β1 integrin를 없애고 interphase 동안 셀에 의해 매트릭스 변형을 줄어듭니다. 그러나, 둥근 β1 integrin 최저 (KD) 세포와 HT1080 야생 타입 셀¹⁹mitotic 단계 변형 매트릭스에에서 차이가 있다.

콜라겐 섬유를 시각화 하는 양자 택일 접근 형광 활용 된 고용 하는 유형 I 교원 질. 우리는 이전 셀¹⁹에 의해 생성 된 콜라겐 매트릭스에서 이미지 트랙에이 접근을 사용. 그러나이 방법은,, 라벨 fluorescein isothiocyanate (FITC), 둘 다 시간이 소모 하 고 덜 같은 형광 염료와 콜라겐의 효율적인 필요 합니다. 다른 한편으로, confocal 반사 현미경 시간과 리소스를 절약 하 고 형광 photobleaching와 관련 된 문제를 제외 하려면 수정 되지 않은 콜라겐을 직접 적용할 수 있습니다. 또한,이 메서드는 개별 형광 채널을 필요 하지 않습니다 이며 따라서 모든 형광 염료와 호환.

이 문서에 소개 된 메서드는 잠재적으로 모든 유형의 3D 콜라겐 매트릭스에 분할 하는 포유류 세포에 적용할 수 있습니다. H2B mCherry 마커의 설립 lentiviral 변환 하 여 다른 포유류 세포에 따를 것 이다 정확 하 게 동일한 절차는 종이에 설명 된 대로 셀의 종류는 다양 한 수 있습니다 변환에 대 한 효율성 lentivirus에 의해 비록 ³⁹. 모두 변환 시 세포의 밀도 및 바이러스 titer 효율성을 위해 최적화 될 수. 높은 변환 효율을 얻을 수 없다, 세포 형광 보조 셀 정렬 (FACS)에 의해 선정 수 있습니다. 티 미 딘 및 nocodazole 헬러⁴⁰등 포유류 세포, 여러 다른 유형의 동기화에 적용 됩니다. 기계적인 동요-오프 모아 겨우 mitotic 단계^30,31동안 기판에 연결 하는 세포 유형에 적용 될 수 있는. 또한, 반사 confocal 현미경 검사 법, 그리고 매트릭스 변형의 정량화를 사용 하 여 콜라겐 섬유의 이미징 포유류 세포 분열의 모든 다른 종류에 직접 적용할 수 있습니다.

여기에 제시 된 방법은 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 3 차원 환경에서 상호 작용을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근입니다. 접근 정상 조직과 질병 개발의 분자 기초에 우리의 조사를 용이 하 게 하 고 소설 진단의 디자인 potentiates 미래에 치료 접근.

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01CA174388 및 U54CA143868를 부여. 저자는 PURA 수상 웨이 통 첸의 지원에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 인정 하 고 싶습니다. 이 자료는 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 보조금 번호 1232825 아래에서 지 원하는 작업을 기반으로 합니다.