多孔質媒体中のバイオクラッシングを研究するためのマイクロ流体プラットフォーム

本プロトコルは、高解像度顕微鏡イメージングと同時圧力差測定を組み合わせることにより、 準2D多孔質媒体におけるバイオフィルムの発生を研究するためのマイクロ流体プラットフォームについて説明しています。このプラットフォームは、バイオ詰まりに対する多孔質媒体中の細孔径と流体流量の影響を定量化します。

細菌バイオフィルムは、土壌やろ過膜など、いくつかの環境および工業用多孔質媒体に含まれています。バイオフィルムは特定の流動条件下で成長し、細孔を詰まらせ、それによって局所的な流体の流れをリダイレクトする可能性があります。バイオフィルムが細孔を詰まらせる能力、いわゆるバイオクラックは、多孔質媒体の局所的な透過性に多大な影響を及ぼし、システム内に圧力が上昇し、システムを通る質量の流れに影響を与える可能性があります。本研究では、異なる物理的条件(例えば、異なる流速および細孔サイズ)におけるバイオフィルムの成長と流体の流れとの間の相互作用を理解するために、外部から課され制御された物理的条件下で顕微鏡を使用してバイオフィルムの発達を視覚化するためのマイクロ流体プラットフォームを開発する。多孔質媒体中のバイオフィルム誘発圧力上昇は、圧力センサーを使用して同時に測定することができ、後でバイオフィルムの表面被覆率と相関させる。提示されたプラットフォームは、フロー条件下で多孔質媒体中のバイオフィルムによって引き起こされるバイオロギングを調査するための体系的なアプローチのベースラインを提供し、環境分離株または複数種のバイオフィルムの研究に適応することができます。

バイオフィルム(高分子外物質(EPS)の自己分泌マトリックスに埋め込まれた細菌コロニー)は、土壌や帯水層¹などの天然多孔質媒体や、バイオレメディエーション²、水ろ過³、医療機器⁴などの技術的および医学的用途に遍在しています。バイオフィルムマトリックスは、多糖類、タンパク質繊維、および細胞外^DNA5,6で構成されており、微生物、栄養素の利用可能性、および環境条件に強く依存します⁷。それでも、行列の関数は普遍的です。バイオフィルム構造の足場を形成し、微生物群集を機械的および化学的ストレスから保護し、バイオフィルムのレオロジー特性に大きく関与しています⁵。

多孔質媒体では、バイオフィルムの成長が毛穴を詰まらせ、いわゆるバイオ目詰まりを引き起こす可能性があります。バイオフィルムの発達は、多孔質媒体^8、9、10の2本の柱を隔てる距離として定義される流体の流れと細孔サイズによって制御されます。細孔サイズと流体の流れの両方が、栄養素の輸送と局所的なせん断力を制御します。次に、成長するバイオフィルムは細孔を詰まらせ、流体11、¹²、¹³の速度分布、物質輸送、および多孔質媒体^14、15の透水伝導率に影響を与える。透水係数の変化は、閉じ込められたシステムの圧力の増加に反映されます^16,17,18,19。バイオフィルムの発生とバイオクロッキングにおける現在のマイクロ流体研究は、均質な形状^16,20(すなわち、単一の細孔サイズを有する)または不均一な多孔質媒体^12,21,22における流速の影響の研究に焦点を当てている。しかし、バイオフィルムの発達に対する流量と細孔サイズの影響と、その結果生じるバイオ詰まった多孔質媒体の圧力変化を解きほぐすには、さまざまな多孔質媒体の形状と環境条件を並行して研究できる高度に制御可能で用途の広い実験プラットフォームが必要です。

本研究では、圧力測定と多孔質媒体内の進化するバイオフィルムの同時イメージングを組み合わせたマイクロ流体プラットフォームを紹介します。ポリジメチルシロキサン(PDMS)製のマイクロ流体デバイスは、ガス透過性、生体適合性、およびチャネル形状設計の柔軟性により、多孔質媒体でのバイオフィルム発生を研究するのに適したツールです。マイクロフルイディクスは、物理的および化学的条件(例えば、流体の流れおよび栄養素濃度)を高精度で制御して、微生物生息地の環境を模倣する^{ことを可能にする23}。さらに、マイクロ流体デバイスは、光学顕微鏡を使用してマイクロメートル分解能で容易に画像化し、オンライン測定(例えば、局所圧力)と組み合わせることができる。

この研究では、実験は、制御された課された流動条件下での均質な多孔質媒体アナログにおける細孔サイズの影響の研究に焦点を当てています。シリンジポンプを使用して培地の流れを強制し、マイクロ流体チャネルを通る圧力差を圧力センサーと同時に測定します。バイオフィルムの開発は、枯 草菌 のプランクトン培養物をマイクロ流体チャネルに播種することによって開始されます。進化するバイオフィルムの定期的なイメージングと画像解析により、さまざまな実験条件下での表面被覆に関する細孔スケール分解情報を取得できます。圧力変化とバイオクロッキングの程度に関する相関情報は、バイオ詰まった多孔質媒体の透過性推定に重要なインプットを提供します。

1. シリコンウェーハの準備

1. コンピュータ支援設計(CAD、 材料表を参照)ソフトウェアでマイクロ流体チャネルの形状を設計し、それを透明フィルムに印刷してフォトマスクを作成します(図1A)。
2. 以下の手順に従って、ソフトリソグラフィー(クリーンルーム条件下)でマスターモールドを製作します。
   1. シリコンウェーハを200°Cで2時間焼きます。
   2. ウェーハをスピンコーターの中央に置き、SU8 3050フォトレジスト( 材料表を参照)をウェーハに注ぎます。スピンコートは1,700rpmで40秒間、ランプタイムは10秒/100rpmです。
      注:スピンコーティングパラメータは、SU8 3050のターゲット厚さ100μmになるように設定されました。
   3. スピンコーティングプロセスの後、シリコンウェーハを65°Cで600秒間、95°Cで2,700秒間ソフトベークします。ウェーハを室温で一晩冷まします。
      注意: 一晩冷却すると、SU8のウェーハへの接着力が向上します。
   4. フォトマスク(ステップ1.1)をウェーハ上に置き、露光エネルギー250mJ/^cm2 、波長350nmのUV光に露光します。
   5. 露光後、露光した基板を65°Cで60秒間、95°Cで300秒間ベークします。
   6. シリコンウェーハを開発し、mrDev600現像剤で満たされたビーカーに浸してマスターモールドを取得します( 材料の表を参照)。ビーカーを1,800秒間静かに振って、未重合のレジストを洗い流します。その後、シリコンウェーハにイソプロパノールをスプレーしてスプラッシュ洗浄し、風乾します。
   7. シリコンウェーハを200°Cで1,800秒間ハードベークします。
3. 20 μLのトリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン( 材料表を参照)を真空デシケーター内のスライドガラスに40分間置き、100 mbarのゲージ圧を作り出してマスターモールドをシラナイズします。

2. マイクロ流体デバイスの作製

注:ここで説明する製造手順は、1つのマイクロ流体チャネルを備えたマイクロ流体デバイス用です。しかしながら、同じ方法を適用して、複数のマイクロ流体チャネルを並列に有するマイクロ流体デバイスを作製することができる。

1. エラストマーとその架橋剤を10:1の比率で混合し( 材料表を参照)、PDMS混合物を調製します。気泡が閉じ込められているために均一に混合され、不透明になるまで混合物を攪拌します。
2. 真空デシケーターで混合物を脱気し、閉じ込められた気泡が除去されて透明に見えるまで、100mbarのゲージ圧を作り出します。脱気に必要な時間は通常30分です。
3. マスターモールド(ステップ1)を細胞培養皿に入れます( 材料表を参照)。PDMS混合物20 gをマスターモールドに注ぎ、最終厚さ5 mmのチャネルを作成します。
4. マスターモールドを70°Cで2時間焼きます。
5. 硬化したPDMSをブレードを使用してマイクロ流体チャネルの周囲(約3mmの距離)で切断し、PDMSマイクロ流体チャネルをマスターモールドから剥離します。
6. マイクロ流体チャネルの入口と出口を作成するには、生検パンチ(直径1.5 mm)で端に穴を開けます(三角形の上部、 図1Aを参照)。入口の三角形の中央に1つの追加の穴を開けて、後で圧力センサーを取り付けます。
7. スライドガラスとマイクロ流体チャネルを市販の1%洗剤溶液( 材料表を参照)で5分間洗浄し、脱イオン水ですすいでください。その後、PDMSマイクロ流体チャネルおよびスライドガラスをイソプロパノールで洗浄する。その後、脱イオン水でもう一度すすいでください。PDMSマイクロ流体チャネルとスライドガラスを圧縮空気で1バールで1分間乾燥させます。
   注:接着を有効にするには、PDMSの多孔質構造が完全に乾燥している必要があります。
8. スライドガラスとマイクロ流体チャネルをプラズマクリーナー( 材料表を参照)に入れ、接着する表面が上を向いていることを確認します。プラズマクリーナーの電源を入れ、マイクロ流体チャネルとスライドガラスを1 SL / h(標準リットル/時)の気流で1分間エアプラズマで処理します。マイクロ流体チャネルをクリーナーから取り出した直後にスライドガラスに接着し、互いに接触させます。
   注意: 接着に影響を与える可能性があるため、処理された表面に触れないようにしてください。複数のマイクロ流体チャネルを持つマイクロ流体デバイスを作製する場合は、マイクロ流体チャネルを同時に露出させ、ワンステップで接合します。
9. 接着したマイクロ流体デバイスを80°Cのホットプレートに15分以上置きます。
10. 実験が始まるまで、マイクロ流体デバイスを清潔な細胞培養皿に保管してください。

3.細菌懸濁液の調製

1. 実験開始の20時間前に、15 mLの培養チューブ内の凍結グリセロールストックから3 mLの栄養ブロスNo.3培地(材料の表を参照)を直接接種することにより、枯草菌NCIB 3610の集団を増殖させます。振とうインキュベーター内で30°C、200rpmで一晩(16時間)インキュベートします。
2. 実験開始の4時間前に、15 mLの培養チューブに3 mLの新鮮な培養液(1:1,000希釈)に3 μLの一晩培養を加えて、一晩培養から継代培養を行います。継代培養液を振とうインキュベーター内で30°C、200rpmで3.5〜4時間インキュベートし、600nmでの光学密度(_OD600)0.1を得た。

4. バイオフィルム増殖実験

1. 実験の3時間前に顕微鏡のボックスインキュベーターの電源を入れ、25°Cの安定した温度を確保しました。 シリンジポンプと圧力センサーを取り付けます(材料の表を参照)。
2. 入口チューブと出口チューブをマイクロ流体デバイスに接続します。針(外径0.6 mm)をインレットチューブに直接挿入して、チューブとシリンジの間の接続を固定します。
3. マイクロ流体デバイス、30 mLの脱イオン水、および30 mLの培養液を真空デシケーターに入れ、少なくとも1時間脱気します。次に、培養液と脱イオン水を2つの別々の30 mLシリンジにゆっくりと引き込みます。
   注:このステップは、培地で洗い流す際にチャネルに気泡が形成されるのを防ぐために重要です。
4. マイクロ流体デバイスを顕微鏡に取り付け、出口チューブを廃棄物容器に入れます。
   1. 脱イオン水で満たされたシリンジをマイクロ流体チューブを介してマイクロ流体チャネルに接続し、圧力センサーの出口から出るまでゆっくりと水を注入します。圧力センサーに水を入れ、マイクロ流体チャネルと圧力センサーを接続するチューブからすべての気泡を洗い流します。圧力センサー専用のネジで圧力センサーの出口を閉じます。
      注意: 説明されている充填手順により、マイクロ流体チャネルの入口での圧力変化が正確に記録されます。複数のマイクロ流体チャネルで実験を行う場合は、各チャンネルを別々のシリンジに接続して、すべてのチャンネルで等しい流量条件を確保します。
5. マイクロ流体チャネルの残りの部分を脱イオン水で満たします。
6. 1.2 μmフィルター( 材料の表を参照)を培地シリンジに置きます。次に、水シリンジを取り外し、培地シリンジを入口マイクロ流体チューブに慎重に接続します。シリンジポンプにシリンジを取り付け、チャネルを培養液とともに2 mL/hの流速で1時間フラッシュします。
   注意: フィルターは、装填中に細菌細胞がシリンジに入るのを防ぎます。マイクロ流体チャネルを培地で洗い流すと、多孔質構造に残っている気泡が除去されます。
7. 実験中はシリンジポンプを希望の流量(ここでは1 mL / h)に設定し、圧力センサーの圧力読み取り値をゼロに設定します。
   注:初期圧力測定値をゼロに設定すると、実験中のバイオフィルムの発生によって引き起こされる圧力差のみが測定されます。
8. 1.5 mL遠心バイアル中のOD₆₀₀ で1 mLの細菌培養物をピペットで入れます。出口チューブを遠心分離バイアルに入れて、細菌培養物をマイクロ流体チャネルにロードします。チューブの出口から潜在的な気泡を取り除くために5分間待った後、マイクロ流体チャネルが細菌培養物で満たされるまで、1 mL / hの流速で150 μLの細菌溶液を回収します。
9. 培地シリンジフィルターを慎重に取り外し、出口を廃棄物容器に入れます。細菌細胞をマイクロ流体チャネル内のゼロフロー状態で3時間放置して、多孔質媒体に表面付着させます。
   注:細菌細胞をゼロフロー条件で3時間放置することは、十分に酸素化された細菌培養を保証しながら、使用される細菌株の付着に最適化されました。他の細菌株は多かれ少なかれ時間を必要とするかもしれません。
10. 実験を開始するには、シリンジポンプを希望の流量(ここでは1 mL / h)に設定してフローを開始し、1Hzで圧力読み取りを開始します。
11. 成長するバイオフィルムの画像を、所望の時間間隔、光学構成、および倍率で取得します。
    注:本研究では、多孔質媒体の全領域にまたがる18の位置で明視野モードで4倍の倍率で画像を6分ごとに24時間取得しました。

5. 画像解析

1. 画像解析ソフトウェア( 材料表参照)およびステッチングアルゴリズム²⁴を使用して、18の位置から画像をステッチすることによって記録された画像シーケンスから多孔質媒体全体を再構築する。
2. ステッチされた画像シーケンスを単一の画像のシーケンスとして保存します。
   注: ファイルが大きすぎる場合は、この時点で、画像を再スケーリングし、適切なサイズにビン分割して、さらに処理することができます。
3. 多孔質媒体の柱のマスクを作成して、分析からそれらを削除します。
4. t=0時間で撮影した画像で画像の背景で除算して画像の背景を取り除き(図2A)、バイオフィルムをセグメント化するのに適した閾値で画像を二値化します(図2B)。
5. 多孔質ドメインの空隙面積と比較して、バイオフィルムがカバーする面積(バイオフィルムに起因する画素数)を計算することにより、バイオフィルムの彩度を計算します(図3)。

本研究では、孔径の異なる3つの平行なマイクロ流体チャネルを備えたマイクロ流体デバイス(図1)を使用して、多孔質媒体中のバイオフィルム形成を体系的に研究しました。バイオフィルム形成過程は、明視野顕微鏡を用いて可視化した。細菌細胞とバイオフィルムは、より暗いピクセルとして画像に現れました(図2)。さらに、緩やかな目詰まりプロセスが観察されました。24時間の実験中に、最初にランダムに成長したバイオフィルムは、多孔質媒体のほぼ全体にコロニーを形成した。

平均初期流体流速0.96 mm/sに相当する Q = 1 mL/hの流速で成長したバイオフィルムの表面被覆率を、3つの異なる細孔径(75 μm、150 μm、300 μm)について定量化しました(図3、黒線)。バイオロギング度の代用として使用された表面被覆率は、 t = 20時間での表面被覆率を比較すると、最大孔径(300μm)よりも最小孔径75μmで10%速く発生することがわかった。次に、表面被覆率は、バイオフィルムによって引き起こされる圧力上昇と相関しました(図3、青い線)。細孔サイズの小さいマイクロ流体チャネルの目詰まりは、大きな細孔サイズのマイクロ流体チャネルよりも入口と出口の間の圧力差が大きくなり、バイオクラックを受けたときに小さいサイズの多孔質媒体がより高い圧力蓄積を発達させることを示しています。

図1:マイクロ流体チャネルの設計と実験のセットアップ。 (A)多孔質媒体アナログとして用いる細孔径(75 μm、150 μm、300 μm)の異なるマイクロ流体チャネルのフォトマスクと、柱の配置を拡大した図(下段)。円は柱(不浸透性の障害物)の位置を示し、多孔質媒体の固相を表します。(B)シリンジ、圧力センサー、マイクロ流体デバイス(単一のマイクロ流体チャネル付き)、および対物レンズ(すなわち顕微鏡)を備えたデジタルカメラセットアップを示す実験セットアップの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:多孔質媒体中のバイオフィルム発達の可視化と定量化。 (A)実験時点t=5時間について示したQ=1mL/h(平均初期流体流速0.96mm/sに相当)および孔径d=300μmでのバイオフィルム発達の代表的な画像配列、 t = 10時間、t = 15時間、およびt = 20時間。明視野画像はステッチされ、背景は削除されました。(B)これらの画像の二値化とバイオフィルムが占める領域(暗いピクセル)の定量化により、図3の表面被覆率の定量化が行われました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:バイオフィルム被覆の時間的進化と圧力への影響。図2と同じ実験条件での3つの細孔サイズ(300 μm、150 μm、および75 μm)の同時圧力読み取りによるバイオフィルムカバレッジ。多孔質媒体マイクロ流体チャネル内のバイオフィルムに起因する圧力差Δp(右y軸に示す青線)は、バイオフィルムの表面被覆率の増加(黒線)とともに増加する。緑色のマーカーは、図2に示す画像のデータポイントに対応しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

圧力センサーと組み合わせたマイクロ流体多孔質媒体類似体は、多孔質媒体中のバイオフィルム発達を研究するための適切なツールを提供します。マイクロ流体多孔質媒体の設計における多様性、特に直径、不規則な形状、孔径などの柱の配置により、多くの形状の調査が可能になります。これらの形状は、単一の細孔から、異なる天然(例えば、土壌)および工業用(例えば、膜およびフィルター)多孔質媒体を模倣する非常に複雑で不規則に配置された障害物にまで及ぶ。現在のマイクロ流体プラットフォームでは、規則的に配列された円筒形の柱(細孔サイズ:75 μm、150 μm、および300 μm)を使用して3つの多孔質媒体形状を作成し、実験ごとに流体流量を選択できました。提示されたプラットフォームは、強制された流体流量ではなく、固定圧力ヘッドでバイオロギングを研究するために容易に適合させることができる。この場合、流量制御装置は、シリンジポンプの代わりに培地リザーバーを備えた圧力コントローラーである必要があります。バイオロギングによる流量の変化は、流量センサーを使用して経時的に流出を測定することによって監視できます。

バイオフィルムの成長を伴うマイクロ流体実験を成功させるには、いくつかの重要なポイントを考慮する必要があります。実験中にマイクロ流体チャネル内の気泡形成を回避するために、マイクロ流体チャネルおよび培養培地を脱気した(ステップ4.3)。次に、マイクロ流体チャネルに脱気された培養培地を充填して、気泡のない完全に飽和したチャネルを得るために、迅速かつ慎重に行う必要があります。気泡が多孔質媒体に閉じ込められている場合、より高い流量でマイクロ流体チャネルをフラッシュすると、短時間で気泡を除去できます。2番目の重要なステップは、バイオフィルムの成長を一貫して再現するために一定の温度環境を確保することです。微生物の増殖は温度25によって変化するため、実験中(この場合は²⁴時間)に温度を安定させないと、再現性のない結果が生じる可能性があります。現在のプラットフォームでは、顕微鏡の周りにボックスインキュベーターが使用されていましたが、マイクロ流体デバイス用のより小さな温度安定性ケーシングでも十分である可能性があります。最後に、画像取得の間、個々の画像の位置は、スティッチングアルゴリズム²⁴のための十分なオーバーラップを得るために、少なくとも15%のオーバーラップで選択されるべきである。

現在のマイクロ流体プラットフォームは2次元観察に限定されていますが、土壌や膜などの多孔質媒体アプリケーションは3次元構造を持っています。しかしながら、バイオロギングを研究するための3D多孔質媒体プラットフォームと比較した準2Dマイクロ流体プラットフォームの利点は、3Dプラットフォームが通常エンドポイントイメージングを実行するので、完全な光学アクセスおよび高い時間分解能である^26,27。さらに、バイオクロギングプロセス(すなわち、表面被覆の時間発展)は、多孔質媒体²⁸内の非混和性相のクラスターサイズ分布についても発生するため、3Dシステム^26,27において持続することが予想され、これは^2Dおよび3Dシステムで同じスケーリングを示す。

この方法では、多孔質媒体中のバイオフィルムの成長に対する圧力応答を測定すると同時に、高い時間的および空間的分解能とさまざまな細孔サイズでの時空間的発達を研究することができます。このような測定から得られたデータセットは、細孔スケールのバイオフィルムの発達とバイオフィルム-多孔質媒体システムの圧力応答との相関関係についての洞察をもたらし、バイオフィルムの数値モデリングのベンチマークを提供することができます。これらのモデリング作業は、実験能力を超える条件の範囲(例えば、孔径、流速、および他の種または複数種のバイオフィルムのバイオフィルム特性)を拡張することに特に関連しています。後者は、井戸付近のバイオクラッシングのメカニズム、バイオレメディエーションアプリケーション、およびバイオミネラリゼーションのメカニズムを理解するのに非常に関連しています29,30,31。全体として、この方法は、バイオミネラリゼーションの研究や、多孔質媒体中のバイオフィルムによる汚染物質の生体内変化の追跡に簡単に適合させることができます。

著者は利益相反を宣言しません。

著者らは、SNSF PRIMA助成金179834(E.S.へ)、ETHからの裁量的資金提供(R.S.へ)、ETHチューリッヒ研究助成金(R.S.およびJ.J.M.へ)、およびEawagからの裁量的資金提供(J.J.M.へ)を認めている。著者らは、 図1B の実験セットアップを説明してくれたRoberto Pioliと、シリコンウェーハの準備をしてくれたEla Burmeisterに感謝したいと思います。