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本协议描述了一个微流体平台,通过将高分辨率显微镜成像与同时压差测量相结合来研究 准二维多孔介质中的生物膜发展。该平台量化了多孔介质中孔径和流体流速对生物堵塞的影响。
细菌生物膜存在于几种环境和工业多孔介质中,包括土壤和过滤膜。生物膜在某些流动条件下生长并会堵塞孔隙,从而改变局部流体流动的方向。生物膜堵塞孔隙的能力,即所谓的生物堵塞,会对多孔介质的局部渗透性产生巨大影响,在系统中产生压力积聚,并影响通过它的质量流。为了了解生物膜生长与流体流动在不同物理条件下(例如,在不同的流速和孔径下)之间的相互作用,在本研究中,开发了一个微流体平台,以在外部施加的受控物理条件下使用显微镜可视化生物膜的发展。可以使用压力传感器同时测量多孔介质中生物膜引起的压力积聚,然后与生物膜的表面覆盖率相关联。所提出的平台为研究流动条件下多孔介质中生物膜引起的生物堵塞的系统方法提供了基线,并且可以适用于研究环境分离物或多物种生物膜。
生物膜 - 嵌入自分泌的超聚合物物质(EPS)基质中的细菌菌落 - 在天然多孔介质中无处不在,例如土壤和含水层1,以及技术和医疗应用,例如生物修复2,水过滤3和医疗设备4。生物膜基质由多糖、蛋白质纤维和细胞外 DNA5,6 组成,并且在很大程度上取决于微生物、营养物质的可用性以及环境条件7。然而,矩阵的功能是通用的;它形成生物膜结构的支架,保护微生物群落免受机械和化学应力的影响,并且主要负责生物膜的流变特性5。
在多孔介质中,生物膜的生长会堵塞毛孔,导致所谓的生物堵塞。生物膜的形成由流体流动和孔径控制,定义为多孔介质8,9,10的两根支柱之间的距离。孔径和流体流量都控制着养分的输送和局部剪切力。反过来,生长的生物膜堵塞孔隙,影响流体11,12,13的速度分布,质量传递和多孔介质14,15的导水率。水力传导率的变化通过密闭系统中压力的增加反映出来16,17,18,19。目前生物膜开发和生物堵塞的微流体研究集中在研究均匀几何形状16,20(即具有单一孔径)或异质多孔介质12,21,22中的流速的影响。然而,为了解开流速和孔径对生物膜发育的影响以及生物堵塞多孔介质中由此产生的压力变化,需要一个高度可控和多功能的实验平台,可以并行研究不同的多孔介质几何形状和环境条件。
本研究引入了一种微流体平台,该平台将压力测量与多孔介质内不断发展的生物膜同时成像相结合。由于其透气性、生物相容性和通道几何形状设计的灵活性,由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的微流体装置是研究多孔介质中生物膜发育的合适工具。微流体允许高精度地控制物理和化学条件(例如,流体流动和营养浓度),以模拟微生物栖息地的环境23.此外,微流体装置可以使用光学显微镜以微米分辨率轻松成像,并与在线测量(例如,局部压力)相结合。
在这项工作中,实验的重点是研究在受控的强加流动条件下均匀多孔介质模拟中孔径的影响。使用注射泵施加培养基的流量,并通过压力传感器同时测量通过微流体通道的压差。通过在微流体通道中播种 枯草芽孢 杆菌的浮游培养物来启动生物膜开发。对不断发展的生物膜进行定期成像和图像分析,可以在各种实验条件下获得有关表面覆盖的孔隙尺度分辨信息。压力变化和生物堵塞程度的相关信息为生物堵塞多孔介质的渗透率估计提供了重要的输入。
1. 硅片制备
2. 微流控装置的制造
注意:此处描述的制造程序适用于具有一个微流体通道的微流体装置。然而,相同的方法可以应用于制造具有多个微流控通道并联的微流控装置。
3.细菌悬浮液的制备
4. 生物膜生长实验
5. 图像分析
在本研究中,使用具有三个具有不同孔径的平行微流控通道的微流控装置(图1)系统地研究多孔介质中生物膜的形成。使用明场显微镜可视化生物膜形成过程。细菌细胞和生物膜在图像中显示为较暗的像素(图2)。此外,观察到逐渐堵塞的过程;在24小时的实验中,最初随机生长的生物膜定植了几乎整个多孔介质。
在 Q = 1 mL / h的流速下,生物膜的表面覆盖率在时间上生长,对应于0.96 mm / s的平均初始流体流速,针对三种不同的孔径(75 μm,150 μm和300 μm)进行了量化(图3,黑线)。结果发现,在 t = 20 h时比较表面覆盖率时,用作生物堵塞程度代表的表面覆盖率在最小孔径75μm处比在最大孔径(300μm)下发生快10%。然后,表面覆盖率与生物膜引起的压力积聚相关(图3,蓝线)。与孔径较大的微流控通道相比,孔径较小的微流控通道中的堵塞导致入口和出口之间的压差更高,表明较小的多孔介质在受到生物堵塞时会产生更高的压力积聚。
图1:微流体通道设计和实验设置。 (A)具有不同孔径(75μm,150μm和300μm)的微流体通道的光掩模用作多孔介质类似物和柱子排列的放大视图(底行)。圆圈表示柱子(不透水障碍物)的位置,代表多孔介质的固相。(B)显示注射器,压力传感器,微流体装置(具有单个微流体通道)和带物镜的数码相机设置(即显微镜)的实验装置示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:多孔介质中生物膜发育的可视化和量化。 (A)在施加流速Q = 1 mL / h(对应于0.96 mm / s的平均初始流体流速)和孔径d = 300μm的施加流速下生物膜发育的代表性图像序列,显示实验时间点t = 5小时, t = 10 小时,t = 15 小时,t = 20 小时。拼接明场图像,并去除背景。(B)这些图像的二值化和生物膜所占区域(暗像素)的量化导致了图3中表面覆盖率的量化。请点击此处查看此图的大图。
图3:生物膜覆盖率的时间演变和对压力的影响。 在 与图2相同的实验条件下,三种孔径(300 μm、150 μm和75 μm)同时压力读数的生物膜覆盖。由多孔介质微流体通道中的生物膜引起的压差Δp(右Y轴上显示的蓝线)随着生物膜表面覆盖率的增加而增加(黑线)。绿色标记对应于 图2所示图像的数据点。 请点击此处查看此图的大图。
微流体多孔介质类似物与压力传感器相结合,为研究多孔介质中的生物膜发展提供了合适的工具。微流体多孔介质设计的多功能性,特别是柱子的排列,包括直径、不规则形状和孔径,允许研究许多几何形状。这些几何形状的范围从单个孔隙到高度复杂、不规则排列的障碍物,模仿不同的自然(例如土壤)和工业(例如膜和过滤器)多孔介质。在目前的微流体平台中,创建了三种多孔介质几何形状,这些几何形状具有规则排列的圆柱形柱(孔径:75μm,150μm和300μm),每个实验可以选择流体流速。所提出的平台可以很容易地适应使用固定压力头而不是施加的流体流速来研究生物堵塞。在这种情况量控制装置应该是带有培养基储液器的压力控制器,而不是注射泵。通过使用流速传感器测量流出量,可以监测由于生物堵塞引起的流速变化。
要成功运行生物膜生长的微流体实验,必须考虑几个关键点。为避免在实验过程中微流控通道中形成气泡,对微流控通道和培养基进行脱气(步骤4.3)。接下来,必须快速但小心地用脱气培养基填充微流体通道,以获得没有任何气泡的完全饱和通道。如果气泡被困在多孔介质中,以较高的流速冲洗微流体通道可以在短时间内去除气泡。第二个关键步骤是确保恒温环境以一致地再现生物膜生长。微生物的生长随温度25而变化,当在实验过程中未保持温度稳定(在这种情况下为24小时)时,这可能会导致不可重复的结果。对于目前的平台,在显微镜周围使用了一个箱式培养箱,尽管用于微流体装置的较小温度稳定的外壳也可能就足够了。最后,在图像采集过程中,应选择重叠至少15%的单个图像的位置,以获得足够的重叠,以便拼接算法24。
目前的微流体平台仅限于二维观察,而土壤或膜等多孔介质应用具有三维结构。然而,与研究生物堵塞的3D多孔介质平台相比,准2D微流控平台的优势在于全光学通道和高时间分辨率,因为3D平台通常执行端点成像26,27。此外,预计生物堵塞过程(即表面覆盖的时间演变)在3D系统26,27中持续存在,因为它也发生在多孔介质28内不混溶相的簇大小分布中,这在2D和3D系统中呈现相同的缩放。
该方法允许测量对多孔介质中生物膜生长的压力响应,同时在高时间和空间分辨率以及不同孔径下研究其时空发展。从这些测量中获得的数据集可以深入了解孔隙尺度生物膜发育与生物膜多孔介质系统的压力响应的相关性,并为生物膜的数值建模提供基准。这些建模工作对于扩展超出实验能力的条件范围(例如,孔径、流速和其他物种或多物种生物膜的生物膜特性)特别相关。后者与理解井附近生物堵塞的机制、生物修复应用和生物矿化高度相关29,30,31。总体而言,该方法可以很容易地用于研究生物矿化或跟踪多孔介质中生物膜对污染物的生物转化。
作者声明不存在利益冲突。
作者感谢SNSF PRIMA赠款179834(给E.S.),ETH(给RS),苏黎世联邦理工学院研究基金(给R.S.和J.J.M.)的酌情资助,以及Eawag(给J.J.M.)的酌情资助。作者要感谢Roberto Pioli在 图1B 中说明实验设置,并感谢Ela Burmeister用于硅晶圆制备。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
Handy | Migros | Detergent solution | |
Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
mrDev600 developer | Microresist | ||
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
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