Method Article
Questo protocollo descrive il metodo per stabilire un modello di acacite nel ratto. Il modello della sacca ileale è stato creato eseguendo un intervento chirurgico di anastomosi anale della sacca ileale (IPAA) utilizzando tecniche microchirurgiche. Dopo l'intervento chirurgico, il ratto è stato trattato con destrano solfato di sodio (DSS) al 4% per 4 giorni.
La colite ulcerosa (CU) è una malattia cronica immuno-mediata che colpisce l'intero colon e il retto con un decorso recidivante e recessivo, causando morbilità per tutta la vita. Quando il trattamento medico è inefficace, soprattutto in caso di sanguinamento gastrointestinale massivo, perforazione, megacolon tossico o cancerogenesi, la chirurgia diventa l'ultima linea di difesa per curare la colite ulcerosa. La resezione totale del colon-retto e l'anastomosi ileale-tasca (IPAA) offrono le migliori possibilità di trattamento a lungo termine. La bachite è la complicanza postoperatoria più comune e problematica. In questa indagine, la microchirurgia viene impiegata per creare un modello di sacca ileale in ratti sperimentali tramite chirurgia IPAA. Successivamente, viene stabilito un modello di pouchite di ratto sostenuto inducendo l'infiammazione della sacca ileale con destrano solfato di sodio (DSS). Il successo dell'instaurazione della pouchite di ratto è convalidato dall'analisi dello stato generale postoperatorio, del peso, dell'assunzione di cibo e acqua, dei dati fecali, nonché della patologia tissutale della sacca, dell'immunoistochimica e dell'analisi dei fattori infiammatori. Questo modello animale sperimentale di pouchite fornisce una base per lo studio della patogenesi e del trattamento della condizione.
La pouchite è un'infiammazione aspecifica che colpisce la sacca ileale ed è una complicanza prevalente dopo proctocolectomia totale e anastomosi ileale-anale (IPAA) in individui con colite ulcerosa (UC)1,2,3. Questa condizione ha un tasso di occorrenza relativamente alto, fino al 50%, e può causare varie manifestazioni cliniche, tra cui diarrea, dolore addominale, perdita di sangue fecale e febbre. La causa esatta della pouchite rimane sfuggente, anche se alcuni ricercatori ritengono che un cambiamento nella flora della pouch possa innescare l'attivazione immunitaria e la conseguente infiammazione 4,5,6,7.
A causa delle sfide associate alla conduzione di studi clinici sulla pouchite, i modelli animali possono fungere da strumenti preziosi per lo studio dei farmaci e dei meccanismi della pouchite. Ci sono crescenti preoccupazioni per quanto riguarda la creazione di sacche ileali di ratto, con rapporti che indicano una possibile infiammazione8. Tuttavia, la ricerca in questo campo rimane scarsa a causa della natura complessa del processo di produzione, che manca di linee guida chiare 9,10. Nel 1998, Lichtman è stato il primo a stabilire un modello di sacca ileale nei ratti Lewis e nei ratti Sprague-Dawley (SD) eseguendo la colectomia totale11. Hanno osservato l'infiltrazione di macrofagi, l'ulcerazione della mucosa e un aumento della flora batterica anaerobica all'interno dell'intestino di questi ratti, fornendo una solida base per ulteriori ricerche sull'infiammazione della sacca ileale. Questo modello sperimentale di pouchite di ratto imita da vicino i segni fisici e i meccanismi sottostanti osservati nella pouchite umana.
I modelli preclinici di colite ulcerosa comunemente applicati includono i modelli DSS e TNBS. L'acido chimico 2,4,6-trinitrobenzensolfonato (TNBS) simula tipicamente la malattia di Crohn12. Il modello DSS, rispettato per la sua efficacia, profilo di sicurezza e convenienza, è spesso utilizzato come strumento affidabile per l'induzione della CU a causa degli evidenti sintomi osservati. Data la colonizzazione del tessuto della sacca, abbiamo indotto con successo un modello di pouchite utilizzando DSS13,14.
Nel presente studio, la microchirurgia è stata utilizzata per creare con successo un modello di sacca ileale in ratti sperimentali tramite chirurgia IPAA. Successivamente, è stato stabilito un modello di pouchite di ratto sostenuta inducendo l'infiammazione della sacca ileale con DSS. L'accuratezza durante l'intervento chirurgico è essenziale per il successo della formazione del modello e anche l'assistenza postoperatoria è fondamentale. Questo modello può essere utilizzato per studiare la patogenesi della pouchite, valutare potenziali agenti terapeutici e approfondire la nostra comprensione di questa complessa condizione. Lo studio semplifica la procedura di produzione della sacca ileale, riducendo la durata dell'operazione e aumentando l'efficienza, stabilendo così una solida base per la ricerca fondamentale sui disturbi post-chirurgici della sacca.
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le politiche dei comitati etici dell'Ospedale Generale dell'Università di Medicina di Tianjin. Per questo studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley di età compresa tra 9 e 12 settimane, del peso di circa 320-360 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Selezione e mantenimento degli animali
2. Preparazione preoperatoria
3. Istituzione del modello di sacca ileale per ratti
4. Definizione del modello di pouchite ileale di ratto con DSS
5. Analisi istologica
6. Dosaggio immunoistochimico
7. Test ELISA
Valutazione delle condizioni generali dei ratti modello di sacca ileale dopo l'insediamento
Dopo che l'operatore ha superato la curva di apprendimento chirurgico IPAA, i ratti hanno tollerato bene l'intervento chirurgico, con una durata chirurgica di 192,94 minuti ± 27,15 minuti, e si sono verificate meno complicanze postoperatorie. Durante il primo periodo postoperatorio, i ratti hanno sperimentato una diminuzione dell'assunzione con la dieta, ma il loro appetito preoperatorio è stato ripristinato entro 10-14 giorni dopo l'intervento chirurgico. L'attività postoperatoria precoce è leggermente diminuita e non c'erano secrezioni evidenti dagli occhi e dal naso. La perdita di peso prima e dopo l'intervento chirurgico è stata di 21,17 g ± 1,59 g. Il peso iniziale postoperatorio ha mostrato un trend decrescente, con una riduzione massima di 69,58 g ± 33,19 g. La crescita stabile è iniziata l'8,25 ± 2,53 giorni dopo l'intervento e il 31° giorno dopo l'intervento il peso ha superato il 9,35% ± il 4,7% del peso il giorno dopo l'intervento. I ratti sono stati in grado di defecare entro 24 ore dall'intervento chirurgico, con feci molli ma senza feci sanguinolente. La formazione di feci molli si è verificata dal 9° al 12° giorno dopo l'intervento.
Aumento compensatorio della sacca ileale
Il 35° giorno dopo l'intervento, la cavità addominale del ratto è stata aperta in anestesia, rivelando una grave adesione tra la sacca ileale e la cavità pelvica. Dopo aver accuratamente separato l'adesione tra la sacca e i tessuti circostanti, sono stati osservati un ingrossamento compensatorio della sacca ileale, un ispessimento della parete intestinale e una lieve dilatazione dell'intestino tenue distale (Figura 1). La lunghezza della sacca ileale era di 2,89 cm ± 0,28 cm al momento dell'intervento, mentre il 35° giorno dopo l'intervento misurava 3,86 cm ± 0,87 cm, mostrando una differenza statistica significativa di P = 0,000). Anche l'area della mucosa (cm2) della sacca ileale è risultata significativamente aumentata rispetto alla misurazione chirurgica (6,46 ± 0,85 vs. 17,02 ± 4,61, P = 0,000). Non c'era alcuna differenza significativa tra il gruppo IPAA e il gruppo della pouchite ileale (P > 0,05).
Valutazione delle condizioni generali e punteggio fecale di ratti con pouchite ileale
Il 31° giorno dopo l'intervento chirurgico, il DSS è stato somministrato al gruppo della pouchite ileale. All'inizio della somministrazione, sia il gruppo IPAA che il gruppo della pouchite ileale avevano lo stesso peso corporeo (352,00 g ± 30,03 g vs. 352,00 g ± 25,92 g, P = 1) ed erano generalmente in buone condizioni. Tuttavia, la quantità di cibo e acqua consumata nel gruppo della pouchite ileale è diminuita, con conseguente affaticamento mentale, capelli opachi, secrezione negli occhi e nel naso, diminuzione della mobilità e non sono stati osservati cambiamenti significativi nel gruppo IPAA. Al 35° giorno dopo l'intervento, il peso del gruppo pouchite ileale era significativamente inferiore a quello del gruppo IPAA (322,83 g ± 29,24 g vs. 364,83 g ± 30,13 g, P = 0,028) (Figura 2).
Il gruppo con pouchite ileale ha manifestato diarrea significativa il primo giorno dopo la somministrazione del DSS e il secondo giorno dopo la somministrazione del DSS aveva muco, pus e feci sanguinolente (Figura 3). Al 35° giorno dopo l'intervento, i punteggi delle feci11 del gruppo IPAA e del gruppo pouchite ileale erano rispettivamente (4,33 ± 0,82 vs. 2,17 ± 0,75, P = 0,001). I ratti del gruppo IPAA avevano un ano pulito e privo di inquinamento, mentre i ratti con pouchite ileale avevano gonfiore dell'ano accompagnato da muco, pus e feci sanguinolente.
Alterazioni istopatologiche della sacca ileale
Osservazione macroscopica di campioni di sacca ileale
Nel gruppo IPAA, la parete intestinale della sacca ileale si è ispessita e non è stata osservata alcuna erosione, ulcera o punto di sanguinamento. Nel gruppo della pouchite ileale, i vasi sanguigni nel mesentere della sacca di conservazione diventano più spessi e la mucosa della sacca ileale è ampiamente o localmente infiammata, con erosione visibile, ulcere e punti di sanguinamento, alcuni dei quali sono accompagnati da una significativa dilatazione distale dell'intestino tenue (Figura 4).
Osservazione microscopica del tessuto della sacca ileale
Nel gruppo di ratti IPAA, la punta di alcuni villi intestinali nel tessuto della sacca è diventata smussata, accompagnata da una piccola quantità di infiltrazione di neutrofili e, occasionalmente, è stata osservata una piccola quantità di essudazione sulla superficie della mucosa.
Al contrario, la disposizione dei villi intestinali nel tessuto della sacca ileale dei ratti nel gruppo della pouchite ileale era estremamente disordinata. Mancavano alcuni villi intestinali ed erano visibili un'estesa erosione e ulcere multiple a chiazze senza coinvolgere lo strato muscolare. Questo è stato accompagnato da un gran numero di neutrofili e infiltrazione di linfociti, eccessiva essudazione e infiammazione visibile della cripta. Il punteggio patologico del tessuto della sacca ileale nel gruppo della pouchite ileale era significativamente più alto di quello del gruppo IPAA, con una differenza statistica significativa osservata (8,50 ± 1,76 vs. 1,33 ± 0,52, P = 0,000) (Figura 5).
Livello di espressione della proteina funzionale della barriera intestinale occludina
L'occludina, un'importante proteina funzionale della barriera intestinale, è espressa sulla membrana cellulare del tessuto della tasca ileale sia nel gruppo IPAA che in quello della pouchite ileale dei ratti11. Tuttavia, il livello di espressione della proteina occludina nel gruppo della pouchite ileale era significativamente inferiore a quello del gruppo IPAA (0,25 ± 0,03 vs. 0,15 ± 0,02, P = 0,000) (Figura 6).
Rilevamento di fattori infiammatori nella sacca ileale
I livelli di espressione di IL-6, IL-17, TNF-α e INF-γ nel tessuto della sacca ileale dei ratti nel gruppo pouchite ileale erano significativamente più alti di quelli del gruppo IPAA (come determinato dal test ELISA16). Al contrario, l'IL-10 ha mostrato risultati opposti, con differenze statistiche osservate (P = 0,000) (Tabella 1).
Figura 1: Lo stato della sacca ileale. La freccia indica la sacca ileale (A) al momento dell'intervento chirurgico e (B) l'allargamento compensatorio della sacca ileale il 35° giorno dopo l'intervento (durante la raccolta del campione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Andamento delle variazioni di peso corporeo nei ratti dopo l'intervento chirurgico con IPAA. La barra di errore è correlata alla deviazione standard, n = 6 in ogni gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fotografia di feci di ratto. (A) Gruppo IPAA. (B) Gruppo della bustite ileale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Osservazione macroscopica di campioni di sacca ileale. (A) Gruppo IPAA. (B) Gruppo della bustite ileale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Alterazioni patologiche del tessuto della sacca ileale di ratto. (A) Gruppo IPAA. (B) Gruppo della bustite ileale. Barre della scala: 60 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Rilevazione immunoistochimica dell'espressione della proteina occludina nel tessuto della sacca ileale di ratto. (A) Gruppo IPAA. (B) Gruppo della bustite ileale. Barre della scala: 60 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Gruppo | n | IL-6 | IL-10 | IL-17 | TNF-α | INF-γ |
Gruppo IPAA | 6 | 2,60 ± 0,36 | 5,81 ± 0,66 | 17.48 ± 4.81 | 86.94 ± 24.06 | 4,08 ± 0,56 |
Gruppo pouchite | 6 | 6,94 ± 1,18 | 2,77 ± 0,60 | 34,82 ± 2,41 | 213.00 ± 26.11 | 9.67 ± 1.70 |
P | 0 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
Tabella 1: Livello di espressione dei fattori infiammatori nel tessuto della sacca ileale di ratto (pg/mL).
La colite ulcerosa (CU) è un'infiammazione intestinale cronica caratterizzata da dolore epigastrico ricorrente, diarrea e feci sanguinolente mucose. Colpisce principalmente il retto e può coinvolgere il colon in progressione a vari livelli. La chirurgia svolge un ruolo cruciale nella gestione dell'UC 17,18,19. Da quando Parks et al.20 hanno introdotto la colectomia totale con una procedura di anastomosi anale ileale (IPAA) nel 1978 per rimuovere il tessuto alterato e ripristinare la continuità intestinale, questa operazione è diventata lo standard internazionale per il trattamento chirurgico della CU. I disturbi infiammatori della sacca sono le complicanze più comuni dopo l'intervento di IPAA.
A causa delle sfide affrontate nella conduzione di studi clinici sulla pouchite, i modelli animali sono stati utilizzati come esperimenti complementari per lo studio di farmaci e meccanismi correlati alla pouchite. Nel 1998, Lichtman et al.11 hanno sviluppato un modello di ratto che prevedeva la rimozione completa dell'intestino crasso e la riconnessione della sacca al retto. Questo modello ha mostrato segni di infiammazione, come infiltrazione di cellule mononucleate, essudazione luminale, ulcerazione della mucosa e infiammazione sierosa entro quattro settimane dall'intervento chirurgico. Il livello di infiammazione era correlato a un aumento della conta batterica nella sacca e si poteva osservare una distinta suscettibilità genetica dell'ospite. Nel 2002, Shebani et al.21 hanno costruito con successo un modello chirurgico di ratto IPAA tramite SDD, che ha efficacemente indotto la pouchite. Questo modello ha confermato l'efficacia dell'uso di animali per studiare la patogenesi della pouchite e ha fornito una solida piattaforma sperimentale per la ricerca di base sulla pouchite. Hanno anche identificato modelli simili di abbondante crescita batterica sia nei serbatoi umani che in quelli dei roditori, convalidando la sua utilità nello studio dello squilibrio batterico intestinale e nell'identificazione di potenziali agenti patogeni correlati alla pouchite.
Con una precedente esperienza nell'alimentazione dei topi e nella modellazione della chirurgia IPAA, è possibile comprimere la curva di apprendimento fino a una decina di soggetti. Una fase fondamentale di questo processo è la costruzione e l'anastomosi della sacca J. Dato che il tratto intestinale dei topi è relativamente sottile, 8-0 Per le suture è stata utilizzata la sutura. Suture di bloccaggio continue e un punto Connel sono stati impiegati separatamente per le suture della parete posteriore e della parete anteriore della sacca. Durante l'anastomosi della sacca e del canale anale, la creazione di una superficie inclinata può ridurre efficacemente la stenosi nel sito anastomotico prendendo come esempio il moncone rettale. Inizialmente, il fissaggio di due punti su ciascun lato del sito anastomotico, quindi la procedevolezza con suture di bloccaggio continue per suturare individualmente le pareti posteriore e anteriore, garantisce l'integrità dell'anastomosi e riduce i tempi chirurgici.
Anche la gestione postoperatoria svolge un ruolo fondamentale nel successo della modellazione. Un periodo di digiuno di 72 ore dopo l'intervento può ridurre efficacemente l'insorgenza di ostruzione intestinale. D'altra parte, una dieta liquida moderata precoce può garantire il fabbisogno nutrizionale e di liquidi dei topi. Dopo aver padroneggiato la curva di apprendimento, i chirurghi possono ottenere un tasso di successo più efficiente e costante nella creazione del modello.
Questo studio si è basato su queste basi e, attraverso l'esplorazione preliminare e il perfezionamento, ha stabilito con successo un modello di sacca ileale di ratto utilizzando la microchirurgia. Questo modello è stato quindi utilizzato per esaminare lo stato dell'infiammazione della sacca e gli indicatori della barriera intestinale. I risultati hanno dimostrato che i ratti mostravano sintomi notevoli come feci sanguinolente, diarrea e perdita di peso dopo essere stati esposti al DSS. Ciò ha portato a edema ed erosione della mucosa della sacca, infiammazione come indicato dal punteggio istopatologico e aumento dei livelli di fattori proinfiammatori, tra cui interleuchina-6 (IL-6), IL-17, fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α) e interferone-gamma (INF-γ), insieme a livelli ridotti del fattore antinfiammatorio interleuchina-10 (IL-10). Inoltre, l'espressione proteica dell'occludina dell'indicatore della barriera intestinale è diminuita. Questi risultati sono in linea con gli studi precedenti11 e affermano il successo dell'istituzione del modello di pouchite di ratto, fornendo una solida piattaforma per la successiva ricerca di farmaci e meccanismi.
Nessuno.
Nessuno
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anhydrous ethanol | Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., Ltd | China | Hematoxin-eosin Staining |
Dextran Sulfate Sodium | Yeasen | 60316ES76 | Used to induce pouch inflammation |
Formaldehyde solution | Tianjin Zhiyuan Reagent Company | China | Hematoxin-eosin Staining |
Gauze | Jiangxi Zhonggan Medical Equipment Company | China | Used for animal microsurgery |
Hematoxylin | Beijing Zhongshan Jinqiao Company | China | Hematoxin-eosin Staining |
Interferon γ Detection reagent kit | Cloud-clone | SEA049Ra | Detecting inflammatory factors |
Interleukin-10 detection kit | Cloud-clone | SEA056Ra | Detecting inflammatory factors |
Interleukin-17 detection kit | Cloud-clone | SEA063Ra | Detecting inflammatory factors |
Interleukin-6 detection kit | Cloud-clone | SEA079Ra | Detecting inflammatory factors |
Iodophor | Tangpai Medical Equipment Co., Ltd | China | Used for animal microsurgery |
Microscopic manipulation instruments | Aesculap | Germany | Used for animal microsurgery |
Occludin | abcam | ab216327 | Immunohistochemical testing |
Sewing needle | Yangzhou Fuda Medical Equipment Co., Ltd | China | Used for animal microsurgery |
tumor necrosis factor α Detection reagent kit | Cloud-clone | SEA133Ra | Detecting inflammatory factors |
Two person binocular surgical microscope | OPTON | Germany | Used for animal microsurgery |
Xylene | Tianjin Yingda Rare and Precious Reagent Factory | China | Hematoxin-eosin Staining |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon