直肠结肠切除术和使用硫酸葡聚糖钠的回肠贮袋肛门吻合术后贮袋炎大鼠模型

该协议描述了建立贮袋炎大鼠模型的方法。回肠袋模型是通过使用显微外科技术进行回肠袋肛门吻合术 （IPAA） 手术创建的。手术后，大鼠用 4% 葡聚糖硫酸钠 （DSS） 治疗 4 d。

溃疡性结肠炎 （UC） 是一种慢性免疫介导的疾病，影响整个结肠和直肠，呈复发和缓解过程，导致终生发病。当药物治疗无效时，尤其是在胃肠道大量出血、穿孔、中毒性巨结肠或致癌的情况下，手术成为治愈 UC 的最后一道防线。全结直肠切除术和回肠贮袋肛门吻合术 （IPAA） 为长期治疗提供了最佳机会。贮袋炎是最常见和最麻烦的术后并发症。在这项研究中，采用显微外科手术 通过 IPAA 手术在实验大鼠中创建回肠袋模型。随后，通过用葡聚糖硫酸钠 （DSS） 诱导回肠袋炎症来建立持续的大鼠贮袋炎模型。通过分析术后一般状况、体重、食物和水摄入量、粪便数据以及贮袋组织病理学、免疫组化和炎症因子分析，验证大鼠贮袋炎的成功建立。这种贮袋炎的实验动物模型为研究该病症的发病机制和治疗提供了基础。

贮袋炎是一种影响回肠袋的非特异性炎症，是溃疡性结肠炎 （UC） 患者全直肠结肠切除术和回肠贮袋肛门吻合术 （IPAA） 后的常见并发症^1,2,3。这种情况的发生率相对较高，最高可达 50%，可引起各种临床表现，包括腹泻、腹痛、粪便失血和发热。贮袋炎的确切原因仍然难以捉摸，尽管一些研究人员认为贮袋菌群的改变可能会触发免疫激活和随后的炎症 4,5,6,7。

由于对贮袋炎进行临床试验存在挑战，动物模型可以作为研究贮袋炎药物和机制的宝贵工具。人们越来越担心大鼠回肠袋的产生，有报告表明可能存在炎症⁸。然而，由于制造过程的复杂性，该领域的研究仍然很少，缺乏明确的指导方针 ^9,10。1998 年，Lichtman 首次通过进行全结肠切除术在 Lewis 大鼠和 Sprague-Dawley （SD） 大鼠中建立了回肠袋模型¹¹。他们观察到这些大鼠肠道内巨噬细胞浸润、粘膜溃疡和厌氧菌群的增加，为进一步研究回肠袋炎症提供了坚实的基础。这种大鼠贮袋炎的实验模型与在人类贮袋炎中观察到的身体体征和潜在机制非常相似。

常用的临床前溃疡性结肠炎模型包括 DSS 和 TNBS 模型。诱导性化学 2,4,6-三硝基苯磺酸 （TNBS） 通常模拟克罗恩病¹²。DSS 模型因其疗效、安全性和可负担性而受到尊重，由于观察到明显的症状，它经常被用作 UC 诱导的可靠工具。鉴于贮袋组织的定植，我们使用 DSS^13,14 成功诱导了贮袋炎模型。

在本研究中，显微外科手术 通过 IPAA 手术在实验大鼠中成功创建了回肠袋模型。随后，通过用 DSS 诱导回肠袋炎症来建立持续的大鼠贮袋炎模型。手术过程中的准确性对于成功形成模型至关重要，术后护理也至关重要。该模型可用于研究贮袋炎的发病机制，评估潜在的治疗药物，并进一步了解这种复杂情况。该研究简化了回肠袋的制造程序，缩短了手术时间并提高了效率，从而为术后袋疾病的基础研究奠定了坚实的基础。

所有动物实验均按照天津医科大学总医院伦理委员会的政策进行。本研究使用年龄在 9 至 12 周之间、体重约 320-360 g 的雄性 Sprague-Dawley 大鼠。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 动物选择和饲养

1. 选择健康的动物（体重为 ~220-240 克）。
2. 确保它们符合无特定病原体 （SPF） ¹⁵ 水平的标准，并在通风充足（每小时 8 至 12 次换气）、舒适温度 （20-25 °C）、适当湿度 （40%-70%）、最小噪音（低于 70 分贝）和自然光循环（12 小时光照和 12 小时黑暗）的环境中适应性饲养至少 2 周。
3. 在此期间，将它们安置在标准的干净笼子中，每个笼子的密度为 3 到 5 个，并每周更换两次垫料。 为实验室 大鼠提供随意的食物和水以及标准维持饲料。

2. 术前准备

1. 选择一只体重约为 320 g 至 360 g 的健康大鼠。手术前将大鼠禁食 8-12 小时，并以 1:1 的比例提供生理盐水和 5% 葡萄糖的溶液以供自愿食用。
2. 准备高压灭菌的显微外科器械（术前在酒精中浸泡 1 小时）、显微镜、大鼠解剖台、8-0不可吸收的高分子缝合线、4-0 不可吸收缝线、无菌纱布、无菌棉签等。

3. 大鼠回肠袋模型的建立

1. 腹膜内注射 1% 戊巴比妥钠溶液，剂量为 6 mL/kg，并用 0.5% 罗哌卡因切开浸润局部麻醉剂以麻醉大鼠。在麻醉期间用电灯将大鼠保持在舒适的温度。
2. 按照以下步骤进行全结直肠切除术:
   1. 按照令人满意的麻醉方案，将大鼠固定在解剖工作台上的背卧位上。通过捏脚趾确认麻醉深度。使用剃须刀清除毛发碎屑，并应用碘伏溶液两次进行手术野绝育。
   2. 做一个大约 6 厘米长的中线切口，以解剖皮肤、白线筋膜和腹膜，从而进入腹腔。使用牵开器露出腹膜表面，并用抑菌盐水浸透的无菌纱布覆盖。
   3. 隔离末端空肠的血管流，使用 8-0 连接其起点缝合线，然后切断它。将距离回盲瓣 1-2 cm 的盲肠残端置于静止状态，然后将其切断。
   4. 开始右半结肠切除术，保守地结扎右半结肠和中结肠静脉。
   5. 进一步分离肠系膜下动脉并隔离直肠下动脉。继续沿直肠隔离，直到距离肛缘 2 厘米的间隔。以 45 度左右倾斜切除远端直肠，以避免术后狭窄。
3. 进行 J 袋构建。
   1. 使用切片机手术刀将末端回肠的横切面与肠系膜肠分开，其尺寸应约为 6-7 厘米。
   2. 将末端回肠折叠成 J 形，为回肠创建一个造袋。 通过 联锁缝合进行后壁吻合术。使用改良的 Connell 缝线增强前壁并保留适当的肠道以匹配远端直肠残端的横截面大小。
   3. 用 8-0 加固 J 形袋如果需要，可以缝合。J 袋的长度应在 2.5 厘米至 3.5 厘米的范围内。
4. 进行回肠贮袋肛门吻合术，IPAA。
   1. 确认肠系膜没有扭转，并间隔用 8-0 缝合袋口的蚂蚁侧壁和直肠残端的外壁用于牵引的缝合线。
   2. 最后，对前壁和后壁进行全层连续锁缝合。
   3. 验证是否有活动性出血，并用生理盐水对腹腔进行生理清洁。依次用 4-0 缝合线闭合腹部肌肉筋膜和皮肤。
5. 进行术后管理。
   1. 腹部闭合后，对所有大鼠施用酮洛芬作为术后镇痛剂 （40 mg/kg，皮下注射）。确保使用电灯加热大鼠，直到恢复。
   2. 术后至少 72 小时限制动物进食，以降低肠梗阻的风险。允许随意摄入 5% 葡萄糖的饮食，以快速补充能量和体液，并根据排便模式调整进食频率。
   3. 手术后一周，从有限的营养开始，逐渐增加消耗量。然后，为大鼠提供定期的啮齿动物饲料以自由食用，同时每天记录它们的饮食摄入量、水摄入量和体重。

4. DSS 大鼠回肠贮袋炎模型的建立

1. 执行实验性分组。
   1. 将 12 只接受全结直肠切除术和 IPAA 手术的大鼠随机分配到 IPAA 组 （A 组，n = 6） 和贮袋炎组 （B 组，n = 6）。
   2. 将 4 g DSS 加入 100 mL 每天新鲜制备的纯水中，制备 4% DSS 溶液。
   3. 在术后第 31 天至第 35 天分别用纯水或 4% DSS 给药 IPAA 组和贮袋炎组。允许大鼠在连续 4 天的给药期间自由饮水和吃鼠食。
2. 执行小袋采样。
   1. 第 35 天早上，手术后，用腹膜内注射 1% 戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，施用剂量为 6 mL/kg（遵循机构批准的方案）。
   2. 从造口袋的造口垂直到每组中输入和输出造口袋的交界处切断造口袋。获取贮袋标本。
   3. 沿前壁缝合线打开造袋，用生理盐水清洗肠管。
   4. 将袋组织片段放入微量离心管中，并立即将其冷藏至 -80 °C。 使用此部分进行炎症指示剂的 ELISA 检测。用 10% 甲醛固定剩余的袋切片，用于组织病理学评分和免疫组化染色。
   5. 最后，在深度麻醉下通过空气栓塞对大鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。

5. 组织学分析

1. 从大鼠获得袋组织后，将其浸入 4% 多聚甲醛中 24 小时。随后，继续进行脱水和包埋方案。将处理过的组织切片进行组织学检查¹⁶.
2. 应用苏木精和伊红染色以确定各组之间的组织病理学差异。在显微镜下检查样品并拍摄照片以进行记录。

6. 免疫组化测定

1. 小心地对组织切片进行脱蜡和脱水。然后，通过在柠檬酸钠溶液中冷却切片并用封闭血清封闭 20 分钟来进行抗原修复。
2. 随后，将切片暴露于一抗 blockludin 抗体并在 4 °C 下孵育过夜。 之后，在苏木精复染¹⁶ 之前用二抗处理它们 30 分钟。
3. 切片干燥后，在光学显微镜下观察和拍照。

7. ELISA 检测

1. 7.1 使用超声处理在裂解缓冲液中将组织片段切碎并匀浆，以确保彻底匀浆。利用所得上清液进行检测。
2. 为每组分配空白、样品和重复的孔。通过读取 450 nm 处的吸光度（OD 值）并进行线性回归分析来确定蛋白质浓度¹⁶。

回肠袋模型大鼠建立后的一般情况评价
操作者通过IPAA手术学习曲线后，大鼠对手术的耐受性良好，手术持续时间为192.94 min±27.15 min，术后并发症发生率较低。在术后早期，大鼠的饮食摄入量减少，但术前食欲在术后 10 至 14 天内恢复。术后早期活动量略有下降，眼、鼻无明显分泌物。术前和术后体重减轻分别为 21.17 g ± 1.59 g。术后初始体重呈下降趋势，最大减轻 69.58 g ± 33.19 g。术后 8.25 天± 2.53 天开始稳定生长，术后第 31^天体重 超过体重的 9.35% ±术后第二天体重的 4.7%。大鼠能够在手术后 24 小时内排便，有稀便但没有血便。术后第 9^至 12^天出现 软便。

回肠袋代偿性增加
术后^第 35 天，大鼠腹腔在麻醉下打开，发现回肠袋与盆腔之间有严重粘连。在仔细分离小袋与周围组织之间的粘附后，观察到回肠袋的代偿性扩大、肠壁增厚和远端小肠的轻度扩张（图1）。手术时回肠袋长度为 2.89 cm ± 0.28 cm，术后^第 35 天为 3.86 cm ± 0.87 cm，差异显著，P = 0.000）。与手术测量相比，回肠袋的粘膜面积 （cm²） 也显着增加 （6.46 ± 0.85 vs. 17.02 ± 4.61，P = 0.000）。 IPAA 组与回肠贮袋炎组差异无统计学意义 （P > 0.05）。

回肠贮袋炎大鼠的一般情况评价及粪便评分
术后^第 31 天，回肠贮袋炎组给予 DSS。给药开始时，IPAA 组和回肠贮袋炎组的体重相同 （352.00 g ± 30.03 g vs. 352.00 g ± 25.92 g，P = 1），总体状况良好。然而，回肠贮袋炎组的食物和水消耗量减少，导致精神疲劳、头发松弛、眼鼻分泌物、活动能力下降，IPAA 组未观察到显着变化。术后^第 35 天，回肠贮袋炎组的体重显著低于 IPAA 组 （322.83 g ± 29.24 g vs. 364.83 g ± 30.13 g，P = 0.028）（图 2）。

回肠贮袋炎组在 DSS 给药后的第一天出现明显的腹泻，在 DSS 给药后的第二天，他们有粘液、脓液和血便（图3）。术后^第 35 天，IPAA 组和回肠贮袋炎组的粪便评分分别为^（4.33 ± 0.82 vs. 2.17 ± 0.75，P = 0.001）。 IPAA 组大鼠肛门干净无污染，回肠贮袋炎大鼠肛门肿胀，伴有粘液、脓液和血便附着。

回肠袋的组织病理学改变

回肠袋标本的宏观观察
IPAA 组回肠袋肠壁增厚，未见糜烂、溃疡或出血点。在回肠贮袋炎组中，储袋肠系膜内的血管变厚，回肠袋粘膜广泛或局部发炎，有可见的糜烂、溃疡和出血点，其中一些伴有明显的远端小肠扩张（图4）。

回肠袋组织的显微镜观察
在 IPAA 大鼠组中，袋组织中一些肠绒毛尖端变钝，伴有少量中性粒细胞浸润，偶见粘膜表面有少量渗出。

相比之下，回肠贮袋炎组大鼠回肠袋组织中肠绒毛的排列极为紊乱。一些肠绒毛缺失，可见广泛的侵蚀和多发斑片状溃疡，但不涉及肌肉层。这伴有大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润、过度渗出和可见的隐窝炎症。回肠贮袋炎组回肠袋组织的病理评分显著高于 IPAA 组，观察到显著的统计学差异 （8.50 ± 1.76 vs. 1.33 ± 0.52，P = 0.000）（图5）。

肠道屏障功能蛋白 occludin 的表达水平
occludin 是肠道屏障的一种重要功能蛋白，在大鼠 IPAA 和回肠贮袋炎组的回肠袋组织的细胞膜上表达¹¹。然而，回肠贮袋炎组 occludin 蛋白的表达水平显著低于 IPAA 组 （0.25 ± 0.03 vs. 0.15 ± 0.02，P = 0.000）（图 6）。

检测回肠袋中的炎症因子
回肠贮袋炎组大鼠回肠贮袋组织中 IL-6 、 IL-17 、 TNF-α 和 INF-γ 的表达水平显著高于 IPAA 组 （通过 ELISA 检测¹⁶）。相反，IL-10 显示出相反的结果，观察到统计学差异 （P = 0.000） （表 1）。

图 1:回肠袋的状态。 箭头表示手术时的回肠袋 （A） 和 （B） 手术后^第 35 天（标本采集期间）回肠袋的代偿性增大。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:IPAA 手术后大鼠体重变化的趋势。 误差线与标准差相关，每组中的 n = 6。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:大鼠粪便的照片。 （A） IPAA 组。（B） 回肠贮袋炎组。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:回肠袋标本的宏观观察。 （A） IPAA 组。（B） 回肠贮袋炎组。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:大鼠回肠袋组织的病理变化。 （A） IPAA 组。（B） 回肠贮袋炎组。比例尺:60 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图 6:大鼠回肠袋组织中 occludin 蛋白表达的免疫组织化学检测。 （A） IPAA 组。（B） 回肠贮袋炎组。比例尺:60 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

表 1:大鼠回肠袋组织中炎症因子的表达水平 （pg/mL）。

溃疡性结肠炎 （UC） 是一种慢性肠道炎症，其特征是反复发作的上腹痛、腹泻和粘液血便。它主要影响直肠，并可能在不同程度上累及进展中的结肠。手术在管理 UC 17,18,19 中起着至关重要的作用。自 Parks 等人 ²⁰ 于 1978 年引入全结肠切除术和回肠袋肛门吻合术 （IPAA） 以去除改变的组织并恢复肠道连续性以来，该手术已成为 UC 手术治疗的国际标准。贮袋的炎症性疾病是 IPAA 手术后最常见的并发症。

由于对贮袋炎进行临床试验面临的挑战，动物模型已被用作研究与贮袋炎相关的药物和机制的补充实验。1998 年，Lichtman 等人¹¹ 开发了一种大鼠模型，涉及完全切除大肠并将小袋重新连接到直肠。该模型在术后 4 周内显示出炎症迹象，例如单核细胞浸润、管腔渗出、粘膜溃疡和浆膜炎症。炎症水平与贮袋中细菌数量增加相关，并且可以观察到不同的宿主遗传易感性。2002 年，Shebani 等人 ²¹ 通过 SDD 成功构建了 IPAA 手术大鼠模型，有效诱导了贮袋炎。该模型证实了使用动物研究贮袋炎发病机制的有效性，并为贮袋炎的基础研究提供了强大的实验平台。他们还在人类和啮齿动物宿主中发现了相似的大量细菌生长模式，验证了其在调查肠道细菌失衡和识别与贮袋炎相关的潜在病原体方面的有用性。

凭借之前在小鼠喂养和 IPAA 手术建模方面的经验，将学习曲线压缩到大约 10 名受试者是可行的。这个过程的一个关键步骤是 J 袋的构建和吻合。鉴于小鼠的肠道相对较细长，8-0缝合线用于缝合。连续锁定缝合线和 Connel 缝合分别用于袋的后壁和前壁的缝合线。在造口袋和肛管吻合过程中，以直肠残端为例，创建倾斜表面可以有效减少吻合口部位的狭窄。最初，在吻合口部位的每一侧固定两针，然后进行连续锁定缝合，分别缝合后壁和前壁，确保吻合口的完整性并缩短手术时间。

术后管理在成功建模中也起着关键作用。术后禁食 72 h 可有效减少肠梗阻的发生。另一方面，早期适度的流质饮食可以保证小鼠的营养和液体需求。掌握学习曲线后，外科医生可以在模型建立方面实现更高效、更一致的成功率。

本研究在此基础上，通过初步探索和改进，使用显微外科手术成功建立了大鼠回肠袋模型。然后使用该模型检查贮袋炎症的状态和肠道屏障指标。结果表明，大鼠在暴露于 DSS 后表现出血便、腹泻和体重减轻等显著症状。这导致袋粘膜水肿和糜烂、组织病理学评分显示的炎症以及促炎因子水平升高，包括白细胞介素-6 （IL-6）、IL-17、肿瘤坏死因子-α （TNF-α） 和干扰素-γ （INF-γ），以及抗炎因子白细胞介素-10 （IL-10） 水平降低。此外，肠道屏障指标 occludin 的蛋白表达降低。这些发现与以前的研究一致¹¹ 并肯定了大鼠贮袋炎模型的成功建立，为后续的药物和机制研究提供了坚实的平台。

没有。

没有