Method Article
Qui, presentiamo un protocollo di trapianto tumorale per la caratterizzazione di linfociti infiltrati tumorali intrinseci e periferici derivati dal tumore in un modello di tumore murino. Il tracciamento specifico dell'afflusso di cellule immunitarie derivate dal ricevente con citometria a flusso rivela la dinamica dei cambiamenti fenotipici e funzionali di queste cellule durante le risposte immunitarie antitumorali.
L'immunità mediata dalle cellule T svolge un ruolo cruciale nelle risposte immunitarie contro i tumori, con i linfociti T citotossici (CTL) che svolgono un ruolo di primo piano nell'eradicazione delle cellule cancerose. Tuttavia, le origini e il rifornimento delle cellule T CD8+ specifiche dell'antigene tumorale all'interno del microambiente tumorale (TME) rimangono oscuri. Questo protocollo impiega la linea cellulare di melanoma B16F10-OVA, che esprime stabilmente il neoantigene surrogato, l'ovoalbumina (OVA) e i topi transgenici OT-I TCR, in cui oltre il 90% delle cellule T CD8 + riconosce specificamente il peptide OVAOVA 257-264 derivato (SIINFEKL) legato alla molecola del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I H2-Kb. Queste caratteristiche consentono lo studio delle risposte delle cellule T antigene-specifiche durante la tumorigenesi.
Combinando questo modello con la chirurgia del trapianto di tumore, i tessuti tumorali dei donatori sono stati trapiantati in topi riceventi singenici abbinati al tumore per tracciare con precisione l'afflusso di cellule immunitarie derivate dal ricevente nei tessuti dei donatori trapiantati, consentendo l'analisi delle risposte immunitarie del CD8+ antigene specifico intrinseco al tumore e alla periferia Cellule T. È stata riscontrata una transizione dinamica tra queste due popolazioni. Collettivamente, questo progetto sperimentale ha fornito un altro approccio per studiare con precisione le risposte immunitarie delle cellule T CD8 + nella TME, che getterà nuova luce sull'immunologia tumorale.
La risposta immunitaria mediata dalle cellule T CD8 + svolge un ruolo fondamentale nel controllo della crescita tumorale. Durante la tumorigenesi, le cellule T CD8+ naïve vengono attivate al momento del riconoscimento dell'antigene in modo limitato alla classe I MHC e successivamente si differenziano in cellule effettrici e si infiltrano nella massa tumorale 1,2. Tuttavia, all'interno del microambiente tumorale (TME), l'esposizione prolungata all'antigene, così come i fattori immunosoppressivi, guidano le cellule T CD8+ specifiche del tumore infiltrate in uno stato iporesponsivo noto come "esaurimento"3. Le cellule T esauste (Tex) sono distinte dalle cellule T effettrici o di memoria generate nell'infezione virale acuta, sia trascrizionalmente che epigeneticamente. Queste cellule Tex sono principalmente caratterizzate dall'espressione sostenuta ed elevata di una serie di recettori inibitori e dalla perdita gerarchica delle funzioni effettrici. Inoltre, la ridotta capacità proliferativa delle cellule T CD8+ esauste si traduce in una diminuzione del numero di cellule T specifiche del tumore, in modo tale che le cellule T CD8+ residue all'interno della TME possono a malapena fornire un'immunità protettiva sufficiente contro la progressione tumorale3. Pertanto, il mantenimento o il rinforzo delle cellule T CD8+ specifiche dell'antigene intratumorale è indispensabile per la repressione del tumore.
Inoltre, si ritiene che la terapia di blocco del checkpoint immunitario (ICB) rinvigorisca Tex nei tumori aumentando l'infiltrazione delle cellule T e, quindi, il numero di cellule T e ringiovanendo le funzioni delle cellule T per aumentare la repressione del tumore. L'applicazione diffusa del trattamento con ICB ha cambiato il panorama della terapia del cancro, con un sottogruppo sostanziale di pazienti che hanno sperimentato risposte durature 4,5,6. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti e dei tipi di cancro non risponde o risponde solo temporaneamente al CNB. L'inadeguata infiltrazione di cellule T nella TME è stata postulata come uno dei meccanismi sottostanti alla resistenza del CNB 7,8.
Diversi studi hanno dimostrato l'eterogeneità delle cellule T CD8+ infiltranti il tumore (TIL) sia nei pazienti che nei modelli murini 9,10,11,12. È stato confermato che un sottogruppo di cellule T CD8+ che esprimono il fattore 1 delle cellule T (TCF1) in una massa tumorale presenta proprietà simili a quelle delle cellule staminali, che potrebbero ulteriormente dare origine a cellule T esaurite terminalmente ed è responsabile dello scoppio della proliferazione dopo la terapia con ICB 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Tuttavia, è stato dimostrato che solo una piccola percentuale di cellule TCF1+CD8+ antigene-specifiche esiste nella TME e genera un pool ampliato di progenie differenziata in risposta all'ICB 23,24,25,26. Se la dimensione limitata di questa popolazione sia sufficiente a garantire la persistenza dei linfociti T citotossici (CTL) per controllare la progressione del tumore rimane sconosciuto e se vi sia un rifornimento dai tessuti periferici richiede ulteriori indagini. Inoltre, recenti ricerche suggeriscono l'insufficiente capacità di rinvigorimento delle cellule T tumorali specifiche preesistenti e la comparsa di nuovi clonotipi precedentemente inesistenti dopo il trattamento con proteina 1 di morte cellulare anti-programmata. Ciò indica che la risposta delle cellule T al blocco del checkpoint potrebbe essere dovuta al nuovo afflusso di un repertorio distinto di cloni di cellule T27. Insieme alla presenza di frazioni di cellule T citotossiche non reattive al tumore nella TME, questi risultati hanno spinto la creazione di un modello di allotrapianto tumorale per studiare il ruolo delle cellule T CD8+ 11 derivate dalla periferia.
Fino ad ora, diversi tipi di impianto tumorale, così come il trasferimento adottivo delle cellule immunitarie, sono stati ampiamente utilizzati nel campo dell'immunologia tumorale28. I TIL, le cellule mononucleate del sangue periferico e le cellule immunitarie reattive al tumore originate da altri tessuti possono essere ben caratterizzate utilizzando questi metodi. Tuttavia, quando si studiano le interazioni tra immunità antitumorale sistemica e locale, questi modelli appaiono inadeguati per esaminare le interazioni tra le cellule immunitarie derivate dalla periferia e la TME. Qui, i tessuti tumorali sono stati trapiantati da donatori in topi riceventi abbinati al tumore per tracciare con precisione l'afflusso di cellule immunitarie derivate dal ricevente e osservare contemporaneamente le cellule derivate dal donatore nella TME.
In questo studio, è stato stabilito un modello singenico murino di melanoma con la linea cellulare di melanoma B16F10-OVA, che esprime stabilmente l'ovalbumina neoantigena surrogata. I topi ot-I transgenici TCR, in cui oltre il 90% delle cellule T CD8+ riconoscono specificamente il peptide OVAOVA 257-264 (SIINFEKL) legato alla molecola MHC di classe I H2-Kb, consentono lo studio delle risposte delle cellule T antigene-specifiche sviluppate nel modello tumorale B16F10-OVA. Combinando questo modello con il trapianto di tumore, le risposte immunitarie delle cellule T CD8+ antigene-specifiche intrinseche e periferiche intrinseche del tumore sono state confrontate per rivelare una transizione dinamica tra queste due popolazioni. Collettivamente, questo progetto sperimentale ha fornito un altro approccio per studiare con precisione le risposte immunitarie delle cellule T CD8 + nella TME, che getta nuova luce sulla dinamica delle risposte immunitarie delle cellule T specifiche del tumore nella TME.
Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali della Terza Università medica militare. Utilizzare topi C57BL/6 di 6-8 settimane e topi transgenici OT-I naïve del peso di 18-22 g. Usa sia maschio che femmina senza randomizzazione o "accecamento".
1. Preparazione del mezzo e dei reagenti
2. Preparazione della sospensione cellulare B16F10-OAV
NOTA: la coltura cellulare deve essere effettuata in una cappa di biosicurezza in condizioni asettiche rigorose.
3. Impianto del tumore ectopico di cellule B16F10-OAV nella regione inguinale dei topi
4. Trasferimento adottivo di cellule T OT-I marcate con antigenicamente in topi portatori di tumore
5. Sezionare la massa tumorale da topi donatori portatori di tumore
NOTA: Mantenere condizioni sterili durante l'intervento chirurgico nelle sezioni 5 e 6. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici mediante autoclave prima e dopo ogni utilizzo. Disinfettare l'area operativa nell'armadio di biosicurezza con il 75% di etanolo seguito da irradiazione ultravioletta. Indossare un abito pulito, berretto, maschera facciale e guanti sterili.
6. Trapianto sottocutaneo di tumore derivato da donatore sui topi riceventi abbinati al tumore
NOTA: L'allotrapianto dovrebbe essere impiantato nel fianco inferiore del topo sullo stesso lato del tumore precedentemente esistente per far defluire due tumori al linfonodo identico. Nel protocollo qui presentato, poiché il tumore B16F10-OVA è stato impiantato per via sottocutanea sulla regione inguinale sinistra del topo (sezione 3), il tessuto tumorale derivato dal donatore è stato trapiantato sul fianco sinistro del ricevente in questa fase. Il sito di trapianto può essere adattato al sito tumorale impiantato per la prima volta.
Lo schema di questo protocollo è mostrato nella Figura 1. Otto giorni dopo l'inoculazione tumorale, le cellule CD45.1+ e CD45.1+CD45.2+ OT-I sono state iniettate in topi C57BL/6 contenenti tumore B16F10-OVA. Il tumore è stato sezionato chirurgicamente da topi impiantati con cellule CD45.1+ OT-I (donatore) il giorno 8 post-trasferimento e trapiantato in topi impiantati con cellule OT-I CD45.1 + CD45.2 + abbinati al tumore (ricevente) nel fianco dorsale sullo stesso lato del tumore impiantato. Attraverso l'analisi della citometria a flusso (strategia di gating mostrata nella Figura 2), due popolazioni di cellule T antigene tumorali cd44 +CD8 + possono essere facilmente identificate nella TME, inclusi i TIL CD45.1+ derivati da donatori e CD45.1 + CD45.2 + derivati dal ricevente. Successivamente, le proporzioni di queste due popolazioni all'interno degli alloinnesti sono state analizzate nei punti temporali indicati per studiare la dinamica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche. Al giorno 2 post-trapianto, c'erano circa l'83% delle cellule T CD8+ antigene-specifiche derivate dal donatore all'interno del tumore trapiantato, più predominanti rispetto alle loro controparti derivate dal ricevente. Tuttavia, la percentuale di cellule OT-I derivate dal ricevente era elevata nella fase avanzata della tumorigenesi, superando le cellule OT-I intrinseche del tumore derivate dal donatore. (Figura 3).
Figura 1: Schema del progetto sperimentale. C57BL/6mice sono sfidati con tumore B16F10-OVA sull'area inguinale. Otto giorni dopo, diverse cellule OT-I marcate congenicamente (CD45.1+ o CD45.1 + CD45.2+) vengono trasferite in topi portatori di tumore. Il giorno 8 post-trasferimento, il tumore sui topi impiantati con cellule CD45.1+ OT-I viene sezionato chirurgicamente e trapiantato per via sottocutanea in riceventi impiantati con cellule OT-I CD45.1 + CD45.2 + abbinati al tumore nello stesso lato del tumore esistente. Quindi, i topi vengono sacrificati e le cellule T antigene-specifiche (cellule OT-I) all'interno degli alloinnesti vengono analizzate nei punti temporali indicati. Abbreviazioni: CD = cluster di differenziazione; i.v. = per via endovenosa; Sac = sacrificio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia di Gating dell'analisi della citometria a flusso. Strategia di Gating utilizzata per identificare le cellule T CD44+CD8+ antigene-specifiche derivate dal donatore (CD45.1+CD45.2+) derivate dal donatore (CD45.1+) all'interno degli alloinnesti. Abbreviazioni: SSC-A = side scattering-area; FSC-A = area di scattering in avanti; FSC-W = larghezza di dispersione in avanti; FSC-H = altezza di scattering in avanti; SSC-W = larghezza di scattering laterale; SSC-H = altezza di scattering laterale; L/D = vivi/morti; CD = cluster di differenziazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il rapporto tra cellule T CD8+ antigene-specifiche derivate da donatori e riceventi all'interno di alloinnesti tumorali. Grafici rappresentativi di citometria a flusso che mostrano l'espressione dei marcatori congeniti CD45.1 e CD45.2 utilizzati per identificare le cellule OT-I derivate da donatore e derivate dal ricevente all'interno di alloinnesti tumorali ai giorni 2, 8 e 15 dopo il trapianto. I numeri rappresentano le percentuali dei due sottoinsiemi nella popolazione di cellule T CD44+CD8+. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'immunità mediata dalle cellule T svolge un ruolo cruciale nelle risposte immunitarie contro i tumori, con le CTL che svolgono il ruolo principale nell'eradicazione delle cellule cancerose. Tuttavia, le origini delle CTL antigene tumorale specifiche all'interno della TME non sono state chiarite30. L'uso di questo protocollo di trapianto tumorale ha fornito un indizio importante sul fatto che le cellule T CD8+ specifiche dell'antigene intratumorale potrebbero non persistere a lungo, nonostante l'esistenza di cellule T CD8+ progenitrici TCF1+ simili allo staminale. In particolare, c'è un afflusso continuo di cellule T CD8 + specifiche del tumore derivate dalla periferia nella massa tumorale.
Per quanto ne sappiamo, questo è un metodo relativamente conveniente e convincente che conferma che il mantenimento delle cellule T CD8+ antigene-specifiche all'interno della TME dipende prevalentemente dal rifornimento di cellule T CD8+ specifiche del tumore derivate dalla periferia invece dell'auto-rinnovo dei TIL residenti nel tumore. Sebbene il protocollo qui presentato si concentri solo sulle proporzioni di TIL derivati da donatori e derivati dal ricevente, le proprietà fenotipiche, funzionali e trascrizionali di queste due popolazioni possono essere prontamente esaminate con la citometria a flusso. Inoltre, è possibile combinare gli anticorpi ICB per studiare le risposte di uno specifico sottogruppo cellulare alla terapia ICB.
In questo protocollo, il tessuto tumorale derivato dal donatore viene trapiantato sul topo ricevente con un tumore originale esistente. Due tumori in un topo ricevente porteranno alla distribuzione delle cellule T generate dalla periferia in due masse tumorali. Inoltre, il carico tumorale sarà quasi raddoppiato rispetto agli animali senza trapianti. In esperimenti pilota, abbiamo tentato di asportare il tumore originale sui topi riceventi prima del trapianto; tuttavia, è stato tecnicamente difficile eliminare completamente tutte le cellule tumorali chirurgicamente. Le cellule tumorali residue si assumerebbero rapidamente e presto formerebbero un nuovo tessuto tumorale. Pertanto, esiste una limitazione per questo sistema quando si confrontano le risposte immunitarie delle cellule T con quelle dei topi non trapiantati. Tuttavia, questo sistema è ancora utile per il confronto tra cellule T migrate di recente ed esistenti all'interno della stessa TME trapiantata da topi portatori di tumore donatore. Inoltre, non si può negare che il trapianto di tessuto tumorale possa portare a infiammazione, che potrebbe influenzare la dinamica delle cellule immunitarie all'interno del tumore. Sebbene l'impatto della chirurgia sull'infiltrazione delle cellule OT-I possa essere escluso attraverso controlli non operati e operati da sham, non abbiamo valutato gli effetti delle risposte infiammatorie locali alla dinamica delle cellule OT-I.
Alcune considerazioni dovrebbero essere prese in considerazione, una delle quali è l'uso della ciclofosfamide. La ciclofosfamide31 è un agente alchilante ampiamente usato per trattare tumori maligni di organi solidi e disturbi linfoproliferativi e autoimmuni. Da sei a otto giorni dopo l'inoculazione B16F10-OVA, la ciclofosfamide viene somministrata prima del trasferimento adottivo per indurre la linfodeplezione dei topi ospiti e migliorare l'attività delle cellule OT-I trasferite29. Sebbene il melanoma non sia sensibile a questo reagente, alcune linee cellulari tumorali, come EG732, una linea cellulare di linfoma timico murino, rispondono alla ciclofosfamide. Il trattamento dei topi portatori di EG7 con ciclofosfamide provoca l'eradicazione dei tumori, il che suggerisce che la ciclofosfamide deve essere attentamente utilizzata o titolata per modelli tumorali sensibili. Il metodo alternativo raccomandato è una singola dose subletale di radiazioni (4,5-5,5 Gy) un giorno prima del trasferimento e la scelta ottimale dipende dalle caratteristiche delle linee cellulari tumorali.
Altre misure devono essere prese con cautela, tra cui l'attenta selezione di topi donatori portatori di tumore e la delicata operazione chirurgica durante il trapianto di tumore. I tumori impiantati verrebbero rimossi chirurgicamente e trapiantati in topi riceventi abbinati al tumore 8-10 giorni dopo il trasferimento. Prima del trapianto, una dimensione comparabile della massa tumorale di ~ 5 mm di diametro deve essere scelta come allotrapianto per ridurre le discrepanze tra i singoli topi e rendere più affidabili i dati acquisiti. Inoltre, durante l'intervento chirurgico, l'incisione dovrebbe essere vicino alla linea mediana del topo indietro per mantenere l'alloinnesto a una distanza dal tumore già esistente nel topo ricevente. La dissezione delicata è anche suggerita per prevenire lesioni sul linfonodo inguinale e sui tessuti circostanti.
L'uccisione efficace delle cellule cancerose richiede il coordinamento di vari componenti all'interno della TME33. Il protocollo qui presentato può essere esteso allo studio di cellule immunitarie adattive e innate come cellule natural killer, macrofagi associati al tumore e cellule dendritiche. Inoltre, oltre al B16F10-OVA qui utilizzato, questo protocollo può essere applicato ad altri modelli di tumore sottocutaneo. Per concludere, il suddetto test di trapianto di tumore offre un nuovo approccio per lo studio delle transizioni interattive di alcuni tipi di cellule immunitarie durante le risposte antitumorali ed è utile per i ricercatori in immunologia tumorale.
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (n. 31825011 a LY) e della National Natural Science Foundation of China (n. 31900643 a QH, n. 31900656 a ZW).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
EDTA | Sigma | EDS-500g | |
FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
sodium azide | Sigma | S2002 | |
surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
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