Purificazione della tubulina con modifiche e isotipi posttraslazionali controllati da fonti limitate mediante cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione

Questo protocollo descrive la purificazione della tubulina da fonti di piccole/medie dimensioni come cellule coltivate o cervelli di topo singolo, utilizzando cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. La tubulina purificata è arricchita in specifici isotipi o ha specifiche modifiche posttraslazionali e può essere utilizzata in saggi di ricostituzione in vitro per studiare la dinamica e le interazioni dei microtubuli.

Un aspetto importante degli studi sul citoscheletro microtubulo è lo studio del comportamento dei microtubuli negli esperimenti di ricostituzione in vitro. Consentono l'analisi delle proprietà intrinseche dei microtubuli, come la dinamica, e delle loro interazioni con le proteine associate ai microtubuli (POP). Il "codice di tubulina" è un concetto emergente che indica diversi isotipi di tubulina e varie modifiche posttraslazionali (PTM) come regolatori di proprietà e funzioni dei microtubuli. Per esplorare i meccanismi molecolari del codice della tubulina, è fondamentale eseguire esperimenti di ricostituzione in vitro utilizzando tubulina purificata con isotipi e PTT specifici.

Ad oggi, questo è stato tecnicamente impegnativo in quanto la tubulina cerebrale, che è ampiamente utilizzata negli esperimenti in vitro, ospita molte PTM e ha una composizione di isotipo definita. Quindi, abbiamo sviluppato questo protocollo per purificare la tubulina da diverse fonti e con diverse composizioni di isotipi e PTM controllate, utilizzando l'approccio classico dei cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. Rispetto ai metodi esistenti basati sulla purificazione dell'affinità, questo approccio produce una tubulina pura e competente per la polimerizzazione, poiché la tubulina resistente alla polimerizzazione o alla depolimerizzazione viene scartata durante le successive fasi di purificazione.

Descriviamo la purificazione della tubulina dalle linee cellulari, coltivata in sospensione o come colture aderenti, e da cervelli di topo singolo. Il metodo descrive per la prima volta la generazione di massa cellulare sia in ambienti di sospensione che aderenti, la fase di lisi, seguita dalle successive fasi di purificazione della tubulina da cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione. Il nostro metodo produce tubulina che può essere utilizzata in esperimenti che affrontano l'impatto del codice di tubulina sulle proprietà intrinseche dei microtubuli e sulle interazioni dei microtubuli con le proteine associate.

I microtubuli svolgono un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Danno alle cellule la loro forma, costruiscono mandrini meiotici e mitotici per la segregazione cromosomica e fungono da binari per il trasporto intracellulare. Per svolgere queste diverse funzioni, i microtubuli si organizzano in modi diversi. Una delle domande intriganti sul campo è comprendere i meccanismi molecolari che permettono ai microtubuli conservati strutturalmente ed evolutivamente di adattarsi a questa pletora di organizzazioni e funzioni. Un meccanismo potenziale è la diversificazione dei microtubuli, definita dal concetto noto come "codice di tubulina"^1,2,3. Il codice della tubulina comprende due componenti principali: l'incorporazione differenziale dei prodotti gene α e β-tubulina (isotipi di tubulina) nei microtubuli e le modifiche posttraslazionali della tubulina (PTM).

Dagli anni '70, gli esperimenti di ricostituzione in vitro, combinati con tecniche di microscopia ottica in evoluzione, hanno aperto la strada a importanti scoperte sulle proprietà dei microtubuli: instabilità dinamica⁴ e tapis roulant^5,e i loro altri^{meccanismi e funzioni 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Quasi tutti gli esperimenti in vitro eseguiti finora sono stati basati su tubulina purificata dal tessuto cerebrale utilizzando cicli ripetuti di polimerizzazione e depolimerizzazione^16,17. Sebbene la purificazione dal tessuto cerebrale conferisa il vantaggio di ottenere tubulina di alta qualità in grandi quantità (di solito quantità di grammi), uno svantaggio importante è l'eterogeneità come tubulina purificata dal tessuto cerebrale è una miscela di diversi isotipi di tubulina ed è arricchita con molte PTT di tubulina. Questa eterogeneità rende impossibile delineare il ruolo di un particolare PTM o isotipo di tubulina nel controllo delle proprietà e delle funzioni dei microtubuli. Pertanto, la produzione di tubulina competente per l'assemblaggio con PTT di tubulina controllata e composizione omogenea dell'isotipo è essenziale per affrontare i meccanismi molecolari del codice della tubulina.

Recentemente, è stato sviluppato un approccio per purificare la tubulina mediante cromatografia di affinità utilizzando il dominio TOG legante i microtubuli (gene sopraespresso tumorale) del lievito Stu2p¹⁸. In questo metodo, la tubulina nei lisati grezzi di cellule o tessuti viene passata attraverso una colonna in cui si lega al dominio TOG immobilizzato dalla matrice, che consente l'analisi dell'intero pool di tubulina di un dato campione, anche molto piccolo. Negli ultimi anni è stato descritto anche un approccio tanto atteso per purificare la tubulina ricombinante. Si basa sul sistema baculovirus, in cui un vettore bi-cistronico contenente geni α- e β-tubulina è espresso nelle cellule degli^{insetti 19}. Tuttavia, questo metodo è molto ingombrante e dispendioso in termini di tempo ed è quindi utilizzato principalmente per studiare l'impatto delle mutazioni della tubulina²⁰ e degli isotipi di tubulina^21,22,23 in vitro.

Nel protocollo attuale, descriviamo un metodo che utilizza il consolidato e ampiamente utilizzato approccio di polimerizzazione-depolimerizzazione come progetto per generare tubulina con diversi livelli di modifica sia dalle linee cellulari che dal tessuto cerebrale del topo²⁴. In questa procedura, la tubulina viene pedalata tra la forma solubile (dimero di tubulina a 4 °C) e polimerizzata (microtubulo a 30 °C in presenza di guanosina 5'-trifosfato [GTP]). Ogni forma è separata attraverso fasi successive di centrifugazione: i dimeri di tubulina rimarranno nel supernatante dopo uno spin freddo (4 °C), mentre i microtubuli saranno pellettati a 30 °C. Inoltre, una fase di polimerizzazione viene effettuata ad alta concentrazione di piperazina-N,N′-bis(acido 2-etanosolfonico) (PIPES), che consente la rimozione delle proteine associate ai microtubuli dai microtubuli e quindi dalla tubulina infine purificata. La tubulina purificata dalle cellule HeLa S3 coltivate come colture sospese o aderenti è praticamente priva di qualsiasi PTM di tubulina ed è stata utilizzata in recenti esperimenti di ricostituzione in vitro^25,26,27,28. Abbiamo ulteriormente adattato il metodo per purificare la tubulina dal cervello di un singolo topo, che può essere utilizzato per un gran numero di modelli di topi con cambiamenti negli isotipi di tubulina e nelle PTT.

Nel protocollo, descriviamo prima la generazione del materiale sorgente (massa cellulare o tessuto cerebrale), la sua lisi (Figura 1A), seguita dai successivi passaggi di polimerizzazione della tubulina e depolimerizzazione per purificare la tubulina (Figura 1B). Descriviamo inoltre il processo di valutazione della purezza(figura 2A,B)e della quantità(figura 3A,B)della tubulina purificata. Il metodo può essere adattato per produrre tubulina arricchita con un PTM selezionato sovraesprimendo un enzima modificante nelle cellule prima della purificazione della tubulina (Figura 4B). In alternativa, gli enzimi che modificano la tubulina possono essere aggiunti alla tubulina durante il processo di purificazione. Infine, possiamo purificare la tubulina priva di isotipi specifici o PTM dal cervello di topi carenti nei corrispondenti enzimi che modificano la tubulina (Figura 4B)²⁹.

Il metodo che descriviamo qui ha due vantaggi principali: (i) consente la produzione di quantità sufficientemente grandi di tubulina in un tempo relativamente breve, e (ii) genera tubulina pura di alta qualità, con una specifica composizione di isotipo di tubulina o PTT. Nel video associato di questo manoscritto, evidenziamo alcuni dei passaggi critici coinvolti in questa procedura.

La cura e l'uso degli animali per questo studio sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Comunità europea (2010/63/UE). Le procedure sperimentali sono state specificamente approvate dal comitato etico dell'Institut Curie CEEA-IC #118 (autorizzazione n. 04395.03 concessa dall'Autorità Nazionale) nel rispetto delle linee guida internazionali.

1. Preparazione dei reagenti per la purificazione della tubulina

NOTA: Tutti i tamponi utilizzati per la purificazione della tubulina devono contenere sali di potassio e NON sali di sodio³⁰.

1. Preparare 1 L di mezzo completo: il mezzo aquila modificato di Dulbecco (DMEM), con siero bovino fetale al 10% (FBS, 100 mL), 200 mM L-glutammina (10 mL di 2 M di stock) e 1x penicillina-streptomicina (10 mL di stock 100x). Conservare a 4 °C.
2. Preparare 10 M di idrossido di potassio (KOH) sciogliendo 140 g di KOH in acqua, regolare il volume finale a 250 mL e conservare a temperatura ambiente.
3. Preparare 0,5 M di acido tetraacetico etilendiammina (EDTA), pH 8, sciogliendo 36,5 g di EDTA in acqua, regolare il pH a 8,0 usando KOH (altrimenti l'EDTA non si dissolverà) e il volume finale a 250 mL, sterilizzare il filtro e conservare a temperatura ambiente.
4. Preparare 5 mM di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)-EDTA aggiungendo 5 mL di EDTA da 0,5 M a 500 mL di PBS, sterilizzare il filtro e conservare a temperatura ambiente.
5. Preparare 0,5 M K-PIPES, pH 6.8, sciogliendo 75,5 g di TUBI in acqua, regolare a pH 6.8 con KOH (altrimenti PIPES non si dissolverà) e il volume finale a 500 mL, filtrare-sterilizzare e conservare a 4 °C.
6. Preparare 1 M K-PIPES, pH 6.8, sciogliendo 15,1 g di TUBI in acqua, regolare a pH 6.8 con KOH e il volume finale a 50 mL, filtrare-sterilizzare e conservare a 4 °C.
7. Preparare 0,5 M di glicole potassio-etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N′,N′-acido tetraacetico (K-EGTA, pH 7.7) sciogliendo 47,5 g di EGTA in acqua, regolare a pH 7,7 con KOH e il volume finale a 250 mL, sterilizzare il filtro e conservare a temperatura ambiente.
8. Preparare BRB80 (K-PIPES da 80 mM, pH 6.8; 1 mM K-EGTA; 1 mM di cloruro di magnesio [MgCl₂]) mescolando 3,2 mL di TUBI da 0,5 M, 40 μL di 0,5 M K-EGTA e 20 μL di 1 M MgCl 2 e_regolare il volume finale a 20 mL. Conservare a 4 °C.
9. Preparare 0,1 M di fluoruro di fenilmetanosulfonil (PMSF) sciogliendo 435 mg di PMSF in isopropanolo per ottenere un volume finale di 25 mL e conservare a -20 °C.
10. Preparare la miscela di inibitori della proteasi (200x) sciogliendo 10 mg di aprotinina, 10 mg di leupeptina e 10 mg di 4-(2-amminoetil)-benzenesulfonil fluoruro in acqua per ottenere un volume finale di 2,5 mL, fare aliquote di 100 μL e conservare a -20 °C.
11. Preparare il 10% di Tritone X-100 mescolando 5 mL di Triton X-100 in 45 mL di acqua, sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.
12. Preparare il tampone di lisi (BRB80 integrato con 1 mM 2-mercaptoetanolo, 1 mM PMSF, 1 miscela di inibitori della proteasi e, facoltativamente, per le cellule HEK-293, 0,2% Tritone X-100) il giorno della purificazione della tubulina mescolando 20 mL di BRB80 con 1,5 μL di 2-mercaptoetanolo, 200 μL di 0,1 M PMSF, 100 μL della miscela di inibitori della proteasi e, facoltativamente, per le cellule HEK-293 , 400 μL del 10% Tritone X-100.
    NOTA: Il 2-mercaptoetanolo è tossico e deve essere utilizzato nella cappa dei fumi.
13. Preparare 0,2 M GTP sciogliendo 1 g di GTP in 9,5 mL di acqua, regolare il pH a 7,5 usando KOH, fare aliquote di 20 μL e conservare a -20 °C. Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
14. Preparare 1 M tris (idrossimetil) aminometano-cloridrato (Tris-HCl) sciogliendo 60,56 g di Tris in acqua, regolare a pH 6,8 con HCl, completo di un volume finale di 500 mL, sterilizzare il filtro e conservare a temperatura ambiente.
15. Preparare 5x tampone campione di Laemmli (450 mM ditiotrimetolo (DTT); 10% dodecilsolfato di sodio (SDS); 400 μM Tris-HCl, pH 6,8; 50% glicerolo; ~0,006% blu bromofenolo) aggiungendo 4 g di SDS a 16 mL di Tris-HCl preriscaldato, pH 6,8 e mescolare delicatamente la soluzione. Aggiungere 2,6 g di DTT e 20 mL di glicerolo al 100% alla miscela e mescolare fino a quando la soluzione diventa omogenea. Aggiungere la quantità desiderata di blu bromofenolo (2,5 mg) per raggiungere l'intensità di colore richiesta. Fare aliquote da 5 mL e conservare a -20 °C. Preparare la soluzione di lavoro 2x del tampone campione Laemmli diluire lo stock 5x in acqua distillata.

2. Fonti di amplificazione e raccolta della tubulina

NOTA: In questo protocollo sono state utilizzate tre fonti di tubulina: (i) cellule (HeLa S3 e HEK-293) coltivate come colture di sospensione; (ii) cellule coltivate come colture aderenti (HEK-293, HeLa e U2 OS); e (iii) tessuto cerebrale del topo. Questo protocollo considera il giorno della purificazione della tubulina come "giorno 0" e, di conseguenza, sono stati descritti altri passaggi relativi al giorno 0.

1. Amplificazione delle cellule
   1. Cellule coltivate come colture di sospensione
      NOTA: Per purificare con successo la tubulina dalle colture di sospensione, utilizzare almeno 2 L di coltura delle sospensioni.
      1. Per 2 L di coltura di sospensione, ravvivare e far crescere il tipo di cella preferito per ottenere 6 × 10⁷ cellule 10 giorni prima del giorno di preparazione. Il giorno -10, celle di piastra su sei piatti di 15 cm di diametro a 10⁷ celle per piatto.
      2. Il giorno -8, preriscaldare la quantità richiesta di mezzo completo a 37 °C. Aggiungere 1 L di mezzo preriscaldato a ogni bottiglia di filatore in condizioni sterili. Posizionare i filatori su un tavolo agitatore fissato a 20-25 giri/min all'interno dell'incubatore di coltura cellulare, aprire leggermente i tappi dello spinner laterale per consentire al mezzo di equilibrare nell'atmosfera dell'incubatore.
         NOTA: Per evitare qualsiasi contaminazione, pulire accuratamente la superficie esterna del supporto e delle bottiglie di filatore utilizzando il 70% di etanolo.
      3. Il giorno -7, tripinare e raccogliere le cellule coltivate fino all'80-90% di confluenza (circa 1,8 × 10⁸ cellule). Raccogliere celle da 3 piatti alla volta, girare verso il basso (200 × g, 5 minuti, temperatura ambiente) e sospendere di nuovo tutte le celle in 10 mL di DMEM.
         NOTA: Una dissociazione approfondita delle cellule a questo punto è molto importante per evitare la formazione di aggregati più grandi nelle bottiglie spinner, che influisce sulla sopravvivenza cellulare e si traduce in una bassa resa di tubulina.
      4. Aggiungere 5 ml della sospensione cellulare a ogni bottiglia di filatore contenente 1 L di DMEM, restituire i filatori al tavolo dell'agitatore nell'incubatore di coltura cellulare e consentire alle cellule di crescere per una settimana.
   2. Cellule coltivate come colture aderenti
      NOTA: Per purificare con successo la tubulina dalle cellule aderenti, utilizzare un minimo di 10 piatti di confluenza dell'80-90%.
      1. Ravvivare e amplificare il tipo di cella desiderato per ottenere 1 × 10⁸ celle tre giorni prima del giorno della preparazione della tubulina.
      2. Il giorno -3, placcare queste cellule su dieci piatti da 15 cm a 1 × 10⁷cellule per piatto e consentire loro di coltivare l'80-90% di confluenza.
      3. Il giorno -1, se necessario, trans infettare le cellule con un plasmide per esprimere un enzima che modifica la tubulina o un particolare isotipo di tubulina.
2. Raccolta delle cellule/tessuto cerebrale
   1. Cellule coltivate come colture di sospensione
      1. Trasferire la sospensione cellulare dai filatori in bottiglie di centrifuga da 1 L(Table of Materials)e celle a pellet a 250 × g,15 min, temperatura ambiente. Per iniziare immediatamente un'altra coltura di celle HeLa S3 nelle bottiglie spinner, lasciare 100 ml di sospensione cellulare nei filatori e aggiungere 1 L di DMEM completo e preriscaldato alla bottiglia spinner.
         NOTA: Controllare attentamente la contaminazione batterica prima di procedere per la purificazione della tubulina.
      2. Resuspend celle a pellet da ogni bottiglia di centrifuga in 10 ml di PBS ghiacciato e trasferire tutte le celle in tubi a vite da 50 ml. Durante la sospensione, tenere le cellule sul ghiaccio. Pellettizzare le cellule a 250 × g,15 min, 4 °C.
         NOTA: Seguire le raccomandazioni per la pulizia e lo stoccaggio delle bottiglie di filatore (vedi Tabella dei materiali).
      3. Scartare il supernatante e determinare il volume del pellet cellulare. Da 2 L di coltura di sospensione (due bottiglie spinner), aspettatevi un pellet di cella di 5-6 ml.
         NOTA: Nel protocollo descritto di seguito, si presume che il volume del pellet di cella sia di 10 mL. Regolare l'esperimento in base ai volumi del pellet.
      4. Aggiungere 1 volume (10 mL) di tampone dilisi e sospendere di nuovo il pellet di cella.
         NOTA: Il rapporto tra il volume del pellet cellulare e il volume del tampone di lysis è molto importante per una corretta purificazione della tubulina. L'aggiunta di più tampone di lisi riduce la concentrazione di tubulina, che poi non riesce a raggiungere la concentrazione critica necessaria per la polimerizzazione, riducendo così notevolmente la resa della tubulina.
         NOTA: Le cellule resospendate nel tampone dilisi possono essere congelate a scatto in azoto liquido e conservate a -80 °C per due mesi.
   2. Cellule coltivate come colture aderenti
      NOTA: Le cellule provenienti da colture aderenti devono essere raccolte molto rapidamente per una corretta purificazione della tubulina (circa 15 minuti per la raccolta di dieci piatti da 15 cm). Tre persone hanno partecipato a questa fase del protocollo.
      1. Rimuovere il mezzo dai piatti da 15 cm inclinando i piatti, quindi lavare delicatamente le celle con 7 mL di PBS-EDTA a temperatura ambiente (persona 1). Lavorare solo con tre piatti da 15 cm alla volta per evitare di lasciare le cellule senza mezzo o tampone.
      2. Aggiungere 5 mL di PBS-EDTA alle cellule e incubarle per 5 minuti a temperatura ambiente.
      3. Utilizzare un sollevatore di celle per staccare delicatamente le celle spalafilandole su un bordo del piatto (persona 2) e raccogliere tutte le celle in un tubo a vite da 50 ml (persona 3). Risciacquare ogni piatto con altri 2 mL di PBS-EDTA per raccogliere eventuali celle rimanenti dai piatti. Durante questa fase, mantenere il tubo a vite da 50 ml contenente la sospensione cellulare sul ghiaccio.
      4. Pellet le cellule a 250 × g, 10 min, 4 °C. Scartare il supernatante e determinare il volume del pellet cellulare. Aspettatevi un volume di ~ 1 mL da dieci piatti da 15 cm.
         NOTA: Nel protocollo descritto di seguito, si presume che il volume del pellet di cella sia di 10 mL. Regolare gli esperimenti in base ai volumi del pellet.
      5. Rimescolare le celle in 1 volume (10 mL) di tampone di lysis.
         NOTA: Le cellule resospense nel tampone di lysis possono essere conservate a -80 °C per un massimo di due mesi.
   3. Tessuto cerebrale
      NOTA: Possono essere utilizzati topi di qualsiasi età, sesso o background genetico. La scelta del ceppo transgenico di topo dipenderà dalla questione scientifica da affrontare. In questo manoscritto, mostriamo l'esempio della tubulina purificata dal topo ttll1^-/-, privo di un importante enzima glutamilante cerebrale, la proteina 1 (TTLL1) simile alla tirosina della tubulina³¹.
      1. Sacrifica il topo per lussazione cervicale, decapita rapidamente e raccogli il cervello in un tubo a fondo rotondo. Se c'è sangue in eccesso sul cervello, lavare rapidamente con tampone di lysis. Raccogli il cervello non appena il topo viene sacrificato poiché un ritardo post mortem può influenzare il successo della purificazione della tubulina. Utilizzare tubi a fondo tondo per adattarsi alla larghezza della sonda utilizzata per l'omogeneizzazione.
         NOTA: I cervelli di topo raccolti possono essere congelati a scatto in azoto liquido e conservati a -80 °C per un massimo di 3 anni.
      2. Aggiungere 500 μL di tampone di lysis a un singolo cervello estratto da un topo adulto. Per il resto del protocollo, si presume che il volume del buffer di lysis aggiunto sia di 10 mL. Regola per il tuo esperimento in base al numero di cervelli da utilizzare.

3.Lisi delle cellule o del tessuto cerebrale

1. Cellule coltivate come colture di sospensione
   1. Per HEK-293, liscire le cellule sul ghiaccio tubazionando ripetutamente su e giù utilizzando punte di pipette di diverse larghezze. In primo luogo, attaccare una punta p1000 a una pipetta da 10 mL e pipettare la sospensione della cella su e giù ogni 5 minuti, per 10 minuti (tre cicli di pipettazione). In secondo luogo, fissare una punta p200 a una punta p1000 e un'ulteriore pipetta ogni 5 minuti, per 20 minuti (cinque cicli di pipettazione).
   2. Per HeLa S3, liscivia le celle utilizzando una pressa francese (vedi Tabella dei materiali per le impostazioni).
   3. Prendere 1/100° volume della miscela di lisi (L) (200 μL per 20 mL di L) e aggiungere lo stesso volume di tampone 2x Laemmli, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
2. Cellule coltivate come colture aderenti
   1. Trasferire le celle in un tubo di fondo rotondo da 14 ml la cui altezza è stata ridotta per ospitare la sonda sonicatore (per le impostazioni, vedere Tabella dei materiali). Sonicare le cellule per ~45 impulsi e confermare la llisi cellulare campionando una goccia della miscela di lisi al microscopio.
      NOTA: Il numero di impulsi potrebbe variare a seconda del tipo di cella utilizzato per la purificazione della tubulina. Le cellule sonicanti troppo potrebbero far precipitare la tubulina e influenzeranno negativamente la resa di purificazione.
   2. Pipettare le celle su e giù sul ghiaccio ogni 5 minuti per 20 min (cinque cicli di pipettazione), utilizzando una punta p200.
   3. Prendere 1/100° volume di miscela di lisi (L) (200 μL per 20 mL di L) e aggiungere lo stesso volume di tampone 2x Laemmli, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
3. Tessuto cerebrale
   1. Liscivia il tessuto cerebrale usando un frullatore di tessuto (vedi Tabella dei materiali per le impostazioni). In alternativa, lisciviare il tessuto utilizzando un pestello a microtubo o un'attrezzatura equivalente e pipettare su e giù sul ghiaccio con una siringa da 1 ml con un ago da 18 G.
   2. Prendere 1/100° volume di miscela di lisi (L) (200 μL per 20 mL di L) e aggiungere lo stesso volume di tampone 2x Laemmli, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.

4. Purificazione della tubulina

1. Chiarimento di Lysate
   1. Sgombrato il lisato (separando il pellet e la frazione solubile della miscela di lisi) mediante centrifugazione a 150.000 × g,4 °C, 30 min. Per informazioni dettagliate sui rotori e sui tubi ultracentrifugo, vedere Table of Materials. Per gli estratti cellulari, uno strato galleggiante bianco si forma spesso dopo la centrifugazione. Non trasferire questo strato galleggiante insieme al supernatante, in quanto interferisce con la polimerizzazione della tubulina. Utilizzare una siringa di volume appropriato attaccata a un lungo ago da 20 G o 21 G per rimuovere delicatamente il supernatante senza disturbare lo strato galleggiante. Se il supernatante è ancora torbido, centrifuga a 5.000 × g, 4 °C per 10 min.
   2. Trasferire il supernatante (SN1) su un tubo ultracentrifugo e annotarne il volume. Per un pellet di celle da 10 mL, aspettatevi un volume di ~ 12 mL per SN1.
   3. Prendere 1/100° volume di SN1 (120 μL per 12 mL di SN1), e aggiungere lo stesso volume di tampone 2x Laemmli, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
   4. Resuspend il pellet (P1) in BRB80 (Table of Materials) utilizzando lo stesso volume di SN1. Prendere 1/100° volume di P1 (200 μL per 20 mL di P1), e aggiungere lo stesso volume di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
2. Prima polimerizzazione in tampone a bassa molarità
   1. Preparare la miscela di polimerizzazione combinando 1 volume di SN1 (12 mL), 1/200^th volume di 0,2 M GTP (60 μL; concentrazione finale 1 mM) e 0,5 volume di glicerolo preriscaldato (6 ml) in un tubo a vite del volume appropriato.
      NOTA: Il glicerolo è usato come agente di affollamento nelle fasi di polimerizzazione in tutto il protocollo e quindi non è considerato nei calcoli delle concentrazioni di altri componenti.
   2. Pipettare il mix su e giù, evitando delicatamente la formazione di bolle d'aria e trasferirlo agli appropriati tubi ultracentrifugo.
      NOTA: Durante il trasferimento della miscela ai tubi, regolare il peso dei tubi (in coppia). Ciò consente allo sperimentatore di procedere direttamente alla sedimentazione dei microtubuli dopo la fase di polimerizzazione. Eseguire questa procedura per tutte le fasi di polimerizzazione in tutto il protocollo.
   3. Coprire i tubi con parafilm, trasferire in un bagno d'acqua impostato a 30 °C e incubare per 20 minuti.
   4. Centrifugare i tubi a 150.000 × g, 30 °C per 30 min. Rimuovere il supernatante (SN2) e mantenere il pellet di microtubuli polimerizzati (P2).
      NOTA: Il pellet di microtubulo può essere congelato a scatto e conservato a -80 °C per un massimo di 1 anno.
   5. Prendere 1/200° volume di SN2 (90 μL per 18 mL SN2) e aggiungere lo stesso volume di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
3. Prima depolimerizzazione
   1. Depolimerizzare i microtubuli aggiungendo BRB80 ghiacciato al pellet P2, e lasciare sul ghiaccio per 5 minuti: per la tubulina dalle cellule, aggiungere 1/60^th (200 μL), e per la tubulina dal cervello, aggiungere 1/20^th (600 μL) del volume dell'SN1.
      NOTA: Il volume di BRB80 ghiacciato aggiunto al pellet durante le fasi di depolimerizzazione è sempre relativo al volume di SN1.
   2. Resuspend il pellet di microtubulo delicatamente, evitando bolle d'aria, fino a quando la soluzione è completamente omogenea. Utilizzare una punta p1000 per un paio di cicli di pipettazione seguiti da una punta p200 ogni 5 minuti, per 20 minuti (cinque cicli di pipettazione). Si tratta di un passo cruciale per il successo della purificazione della tubulina.
   3. Trasferire la soluzione su tubi ultracentrifugi appropriati e scendere a 150.000 × g, 4 °C per 20 min. Trasferire l'SN3 su un nuovo tubo ultracentrifugo da 1,5 ml. Il pellet formato dopo questa fase di centrifugazione (P3) contiene proteine precipitate (proteine associate a microtubuli o POP) e microtubuli non depolimerizzati. Il supernatante (SN3) contiene componenti solubili: dimeri di tubulina depolimerizzata e POP, che si sono staccati dai microtubuli depolimerizzati.
   4. Assumere 1-4 μL di SN3 e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
   5. Risospendare il pellet P3 in BRB80 (nello stesso volume di SN3), prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone 2x Laemmli, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C.
4. Seconda polimerizzazione (in tampone ad alta molarità)
   1. Preparare la miscela di polimerizzazione combinando 1 volume di SN3 (200 μL), 1 volume di tubi preriscaldati da 1 M (200 μL, concentrazione finale 0,5 M), 1/100° volume di 0,2 M GTP (2 μL, concentrazione finale 1 mM) e 1 volume di glicerolo preriscaldato (200 μL) in un tubo del volume appropriato.
   2. Pipettare il mix su e giù, evitando la formazione di bolle d'aria, e trasferirlo su tubi ultracentrifugo.
   3. Coprire i tubi con parafilm, trasferirli in un bagno d'acqua impostato a 30 °C e incubare per 20 minuti.
   4. Centrifugare i tubi a 150.000 × g,30 °C per 30 min. Rimuovere il supernatante (SN4) e mantenere il pellet di microtubuli polimerizzati (P4). Il pellet P4 contiene i microtubuli polimerizzati, e il supernatante SN4 contiene tubulina non polimerizzata, POP e altre proteine solubili.
      NOTA: Il pellet di microtubuli dopo la seconda fase di polimerizzazione può essere congelato a scatto e conservato a -80 °C per un massimo di 1 anno.
   5. Prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
5. Seconda depolimerizzazione
   1. Depolimerizzare i microtubuli aggiungendo BRB80 ghiacciato al pellet P4, e lasciare sul ghiaccio per 5 minuti: per la tubulina dalle cellule, aggiungere 1/100^th (120 μL), e per la tubulina dal cervello, aggiungere 1/40^th (300 μL) del volume dell'SN1.
   2. Pipetta su e giù con una punta p200 ogni 5 minuti, per 20 min (cinque cicli di pipettazione).
   3. Trasferire la soluzione su un tubo ultracentrifugo da 1,5 ml e scendere a 150.000 × g, 4 °C per 20 min. Trasferire l'SN5 su un nuovo tubo ultracentrifugo da 1,5 ml. Il pellet formato dopo questa fase di centrifugazione (P5) contiene microtubuli non depolimerizzati. Il supernatante (SN5) contiene la tubulina solubile.
   4. Prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
   5. Risospendare il pellet P5 in BRB80 (stesso volume di SN5), prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
6. Terza polimerizzazione (in tampone a bassa molarità)
   1. Preparare la miscela di polimerizzazione: 1 volume di SN5 (120 μL), 1/200° volume di 0,2 M GTP (0,6 μL, la concentrazione finale è di 1 mM) e 0,5 volume di glicerolo preriscaldato (60 μL) in un tubo del volume appropriato.
   2. Pipettare il mix su e giù, evitando delicatamente la formazione di bolle d'aria, e trasferirlo agli appropriati tubi ultracentrifugo.
   3. Coprire i tubi con parafilm, trasferirli in un bagno d'acqua impostato a 30 °C e incubare per 20 minuti.
   4. Centrifugare i tubi a 150.000 × g,30 °C per 30 min. Il pellet (P6) contiene microtubuli polimerizzati e il supernatante SN6 contiene piccole quantità di tubulina non polimerizzata.
      NOTA: I pellet di microtubuli possono essere congelati a scatto e conservati a -80 °C per un massimo di 1 anno.
   5. Prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
7. Terza depolimerizzazione
   1. Depolimerizzare i microtubuli aggiungendo BRB80 ghiacciato al pellet P6, e lasciare sul ghiaccio per 5 minuti: per la tubulina dalle cellule, aggiungere 1/100^th (120 μL), e per la tubulina dal cervello, aggiungere 1/40^th (300 μL) del volume dell'SN1.
   2. Pipetta su e giù con una punta p200 ogni 5 minuti, per 20 min (cinque cicli di pipettazione).
   3. Trasferire la soluzione nei tubi ultracentrifugo appropriati e scendere a 150.000 × g,4 °C per 20 min. Trasferire SN7 su un nuovo tubo ultracentrifugo da 1,5 ml. Il pellet (P7) contiene piccole quantità di microtubuli non depolimerizzati. Il supernatante (SN7) contiene microtubuli esclusivamente depolimerizzati (tubulina solubile).
   4. Prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
   5. Risospendare il pellet P7 in BRB80 (stesso volume di SN7), prendere 1-4 μL e aggiungere 9 volumi di tampone Laemmli 2x, far bollire per 5 minuti e conservare a -20 °C per ulteriori analisi.
   6. Quantificare la quantità di tubulina (vedere Risultati rappresentativi) e aliquota SN7 in piccoli volumi, congelare e conservare a -80 °C.

L'obiettivo principale di questo metodo è quello di produrre tubulina di alta qualità e competente per l'assemblaggio in quantità sufficienti per eseguire ripetuti esperimenti in vitro con i componenti purificati. I microtubuli assemblati da questa tubulina possono essere utilizzati in test di ricostituzione basati sulla tecnica di microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) con microtubuli dinamici o stabili, in esperimenti che testano la dinamica dei microtubuli, le interazioni con MAP o motori molecolari e la generazione di forza da parte^{dei motori 25}. Possono anche essere utilizzati nei test di co-pellettizzazione microtubuli-MAP e nella spettroscopia NMR allo stato solido²⁸.

L'arricchimento e la purezza della tubulina durante tutto il processo di purificazione possono essere monitorati utilizzando un gel di elettroforesi in gel di poliacrilammide macchiato di Coomassie (PAGE), preferibilmente i gel 'TUB' SDS-PAGE, che consentono la separazione di α e β-tubuline, che co-migrano come un'unica banda nei gel classici^32. I lysati raccolti in fasi diverse (ad eccezione dell'ultima depolimerizzazione, vedi protocollo) vengono caricati sul gel in quantità comparabili per valutare il successo della purificazione della tubulina(figura 2A)²⁴. Il campione finale di tubulina, che è molto prezioso, viene caricato solo sul gel per la determinazione della concentrazione di tubulina. È normale perdere un po 'di tubulina nel processo di ripetuti cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. Una resa inferiore al previsto della tubulina purificata finale può essere dovuta a (i) depolimerizzazione incompleta dei microtubuli, visualizzato dalla presenza di un'importante quantità di tubulina nelle frazioni P3, P5 e P7, o (ii) una polimerizzazione inefficiente della tubulina in microtubuli, nel qual caso una minore quantità di tubulina è presente nelle frazioni P2, P4 e P6 e superiore nelle frazioni SN2, SN4 e SN6(Figura 2B). Se la tubulina viene persa durante le fasi di polimerizzazione (quantità inferiori di P2 e P4) (i) garantire una concentrazione sufficiente di tubulina durante la polimerizzazione (ii) utilizzare un'aliquota fresca di GTP e/o (iii) riconfermare la temperatura della reazione di polimerizzazione. Se la tubulina viene persa durante i passaggi di depolimerizzazione (quantità inferiori di SN3 e SN5), aumentare il tempo e pipettare la miscela sul ghiaccio.

Per la quantificazione della tubulina purificata, eseguire i campioni insieme alle quantità note di albumina di siero bovino (BSA, 0,5 μg – 1 μg – 2 μg – 4 μg) (Figura 3A) su SDS-PAGE. I gel sono macchiati di blu brillante Coomassie, scansionati, e le intensità delle bande di BSA e tubulina sono misurate dalla densitometria quantitativa (Figura 3B) come descritto al https://openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ. Si prega di notare che la stessa analisi può essere eseguita in Fiji, una versione aggiornata di ImageJ³³. I valori delle bande BSA sono stati usati per determinare l'equazione di regressione lineare, che è stata utilizzata per calcolare la quantità di proteine nelle bande di tubulina. Solo le intensità della banda di tubulina nell'intervallo della curva BSA vengono utilizzate per determinare la concentrazione di tubulina. In base alla concentrazione calcolata di tubulina, le aliquote dei volumi desiderati di tubulina vengono preparate, congelate a scatto in azoto liquido e conservate a -80 °C. Di solito otteniamo circa ~ 2 mg di tubulina da quattro bottiglie spinner di colture di sospensione HeLa S3 (~ 15 g di cellule), ~ 250 μg di tubulina da dieci piatti di 15 cm di diametro (~ 1,2 g di cellule) e ~ 1 mg di tubulina da 1 g di tessuto cerebrale del topo.

Per confermare l'arricchimento di un particolare isotipo o modifica della tubulina, ~0,1 μg della tubulina purificata può essere immunoblotted^{utilizzando i rispettivi anticorpi 34,35}. La tubulina di controllo varierà a seconda della tubulina di interesse. Per la tubulina modificata in vitro con un enzima modificatore, utilizzare la tubulina non trattata come controllo. Per la tubulina modificata nel cellulo dalla sovraespressione di un enzima modificante, utilizzare la tubulina purificata da cellule che non esprimono l'enzima come controllo (Figura 4A). La tubulina di controllo per la tubulina purificata dal cervello a topo knockout sarà la tubulina dei topi di tipo selvatico (Figura 4B). In tutte le analisi immunoblot, un carico uguale di tubulina viene verificato utilizzando un anticorpo anti-α-tubulina indipendente dalla PTM (12G10).

Figura 1: Purificazione della tubulina da diverse fonti utilizzando cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione. (A) Diverse fonti di tubulina vengono lese utilizzando strategie specifiche. Le cellule HeLa S3 coltivate in sospensione vengono lese utilizzando una stampa francese; Le cellule HEK-293 vengono lisci per pipettazione ripetitiva. Le cellule aderenti sono state lese usando brevi impulsi di sonicazione e tessuto cerebrale del topo utilizzando un omogeneizzatore tissutale. (B) Rappresentazione schematica delle fasi successive del protocollo di purificazione della tubulina mediante cicli di depolimerizzazione a freddo e di polimerizzazione a caldo. Dopo la chiarificazione della llisi e del glisato, i microtubuli vengono polimerizzati e pellettizzati. I microtubuli vengono quindi depolimerizzati e successivamente autorizzati a polimerizzare in un tampone ad alta molarità, prevenendo la co-sedimentazione delle proteine associate ai microtubuli (MAP) con i microtubuli. I microtubuli senza MAP vengono quindi depolimerizzati e possono essere ulteriormente sottoposti a un terzo ciclo di polimerizzazione-depolimerizzazione per rimuovere tracce del tampone ad alta mollarità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Valutazione del successo della purificazione della tubulina. I campioni raccolti in diverse fasi del protocollo di purificazione della tubulina sono stati eseguiti su un gel di elettroforesi in gel di dodecilsolfonato di sodio -poliacrilammide (SDS-PAGE) "TUB" (vedi protocollo per i dettagli) e macchiati di blu brillante Coomassie. (A) In una corretta purificazione della tubulina, α e β vengono progressivamente arricchite durante tutto il processo. Dopo la seconda polimerizzazione, il pellet di microtubuli (P4) è praticamente privo di contaminazione da altre proteine o proteine associate a microtubuli (POP). Si noti che è normale perdere un po 'di tubulina durante la procedura. (B) In un'infruttuosa purificazione della tubulina, la resa finale di tubulina è bassa e la tubulina rimane nel pellet dopo la depolimerizzazione o nel supernatante dopo la polimerizzazione (scatole rosse). Nell'esempio mostrato qui, la tubulina non polimerizza in modo efficiente in entrambe le fasi di polimerizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Quantificazione della tubulina purificata utilizzando gel e densitometria in dodecilsolfonato di sodio macchiato di Coomassie-poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE). (A) Gel SDS-PAGE macchiato di coomassie con quantità note di albumina di siero bovino (BSA; 0,5, 1, 2 e 4 μg, linea di sfumatura grigia) e diversi volumi (rispettivamente 0,5 e 1 μL, colori chiari e scuri) di tubulina purificata. Nell'esempio mostrato, sul gel sono stati caricati tubulina tirosinata (tubulina HeLa S3, arancione chiaro e scuro) e tubulina detirosinata (tubulina HeLa S3 trattata con carbossipeptidasi A, blu chiaro e scuro). (B) Le bande BSA di (A) sono state quantificate utilizzando ImageJ (in unità arbitrarie, UA) e tracciate rispetto alla quantità di proteine caricate (punti da grigi a neri). Questi punti sono stati usati per calcolare la linea di regressione lineare (la linea del gradiente grigio) e l'equazione, che sono stati utilizzati per calcolare le quantità di proteine nei campioni di tubulina (punti arancione chiaro e scuro e blu) caricati sul gel. Ciò ha facilitato il calcolo della concentrazione dei campioni di tubulina. Si noti che i punti che si trovano oltre la curva standard BSA non devono essere utilizzati per determinare la concentrazione (punti arancione scuro e blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi immunoblot della tubulina purificata con diverse PTM. (A) I tubuloni purificati dalle cellule HEK-293: tipo selvatico o cellule che sovraesprino TTLL5 o TTLL7 sono stati analizzati per l'arricchimento specifico della poliglutamilazione utilizzando l'anticorpo GT335. Mentre l'iperespressione TTLL5 aumenta la poliglutamilazione su α e β-tubulina, l'iperespressione TTLL7 arricchisce specificamente β della glutammilazione della tubulina. (B) La tubulina purificata dai tessuti cerebrali di tipo selvatico e i topi ttll1^{-/- sono} stati analizzati per i modelli di glutamilazione. Si noti la forte riduzione della poliglutamilazione della tubulina dai topi ttll1^-/-, che mancano della glutamilasi cerebrale maggiore TTLL1³⁶. I gel "TUB" sono stati utilizzati per separare α-β-tubulina. Una quantità uguale di carico di tubulina è stata confermata da 12G10, un anticorpo anti-α-tubulina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il metodo qui descritto fornisce una piattaforma per generare rapidamente tubulina di alta qualità e competente per l'assemblaggio in quantità medio-grandi dalle linee cellulari e dal cervello di un singolo topo. Si basa sul protocollo gold-standard di purificazione della tubulina dal cervello bovino utilizzato sul campo per^{molti anni 16,17}. Un vantaggio particolare dell'approccio è l'uso di colture di sospensione delle cellule HeLa S3, che, una volta stabilite, produce grandi quantità di cellule richiedendo poco tempo pratico. Ciò rende il protocollo relativamente facile da eseguire in qualsiasi laboratorio di biologia cellulare, mentre altri metodi di purificazione della tubulina^{18,19,32,37 richiedono attrezzature} e competenze specifiche e sono quindi utilizzati principalmente da laboratori con un forte background nella purificazione delle proteine. Quando si producono piccole quantità di tubulina dalle linee cellulari aderenti, è possibile utilizzare una varietà di linee cellulari. Abbiamo purificato con successo la tubulina dalle cellule HeLa, U-2 OS e HEK-293. Se è necessaria una purificazione su larga scala, le cellule o il cervello raccolti possono essere congelati a scatto nel tampone di lysis e conservati a -80 °C, e pellet o cervelli a più cellule possono essere raggruppati insieme per purificare maggiori quantità di tubulina.

La tubulina purificata dalle linee cellulari è praticamente priva di PLOM di tubulina. Questo Tyr-tubulina può essere facilmente convertito in tubulina detirosinata (deTyr-) in un unico passaggio^{diretto 25.} Per produrre tubulina con altre PTM, specifici enzimi che modificano la tubulina possono essere sovraespressi nelle cellule prima della purificazione della tubulina. Inoltre, l'uso delle linee cellulari di origine umana come fonte di materiale aiuta ad evitare potenziali problemi tra specie quando si studiano le interazioni tra microtubuli e POP umani. Inoltre, la tubulina proveniente da cellule non trasformate (come HEK293) o trasformate (come HeLa) può fornire informazioni sugli effetti dei farmaci diretti ai microtubuli (ad esempio, i taxani) sui microtubuli normali e tumorali.

Infine, il nostro protocollo facilita la purificazione della tubulina dal cervello di un singolo topo. Poiché viene generato un numero crescente di modelli di topi di mutazioni e modifiche della tubulina, questo protocollo consente l'analisi diretta delle proprietà e delle interazioni dei microtubuli con composizione alterata dell'isotipo di tubulina^38,39,40 o PTT di tubulina^31,41.

L'approccio si basa su cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. Pertanto, specifici isotipi di tubulina o tubulina con particolari PTM che influenzano le proprietà di assemblaggio e smontaggio dei microtubuli potrebbero comportare una perdita o una riduzione sproporzionate di tali forme di tubulina durante il processo di purificazione. Tuttavia, abbiamo dimostrato che le principali PTT di tubulina, come acetilazione, detirosinazione, glutamilazione e glicilazione, vengono trattenute sui microtubuli durante tutto il processo di purificazione della^{tubulina 24}. Tuttavia, va notato che per le analisi quantitative della composizione della tubulina nelle cellule o nei tessuti, l'approccio di purificazione della tubulina a colonna TOG è più appropriato in quanto consentirebbe una purificazione della tubulina imparziale e indipendente dalla polimerizzazione¹⁸. Nonostante la sua limitazione, il nostro protocollo offre un grande vantaggio nel generare grandi quantità di tubulina di alta qualità che può essere utilizzata in meticolosi esperimenti di ricostituzione in vitro. In particolare, facilita l'uso di tubulina cerebrale ricca di PTM negli esperimenti di routine.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato supportato dall'ANR-10-IDEX-0001-02, dal LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 e dall'Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ è sostenuta dall'Institut Curie, l'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR) assegna l'ANR-12-BSV2-0007 e l'ANR-17-CE13-0021, la sovvenzione Institut National du Cancer (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1 e la Sovvenzione Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) DEQ20170336756. MMM è supportato dalla sovvenzione Fondation Vaincre Alzheimer FR-16055p e dalla sovvenzione francese Alzheimer AAP SM 2019 n°2023. JAS è stato supportato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 675737 e della sovvenzione FRM FDT201904008210. SB è stato supportato dalla sovvenzione FRM FDT201805005465.

Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Janke, in particolare J. Souphron, nonché G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) e A. Gautreau (Ecole Polytechnique) per l'aiuto durante l'istituzione del protocollo. Vorremmo ringraziare la struttura animale dell'Institut Curie per l'aiuto nell'allevamento e nella cura dei topi.

L'anticorpo 12G10, sviluppato da J. Frankel e M. Nelson, è stato ottenuto dalla Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppata sotto gli auspici del NICHD e mantenuta dall'Università dell'Iowa.