Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Dieses Protokoll beschreibt die Tubulinreinigung aus kleinen/mittleren Quellen wie kultivierten Zellen oder Gehirnen mit einer Maus unter Verwendung von Polymerisations- und Depolymerisationszyklen. Das gereinigte Tubulin ist in bestimmten Isotypen angereichert oder hat spezifische posttranslationale Modifikationen und kann in In-vitro-Rekonstitutions-Assays zur Untersuchung der Mikrotubuli-Dynamik und -Wechselwirkungen verwendet werden.
Ein wichtiger Aspekt der Untersuchungen des Mikrotubuli-Zytoskeletts ist die Untersuchung des Mikrotubuli-Verhaltens in In-vitro-Rekonstitutionsexperimenten. Sie ermöglichen die Analyse der intrinsischen Eigenschaften von Mikrotubuli, wie dynamik, und ihrer Wechselwirkungen mit mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs). Der "Tubulin-Code" ist ein neu entstehendes Konzept, das auf verschiedene Tubulin-Isotypen und verschiedene posttranslationale Modifikationen (PTMs) als Regulatoren von Mikrotubuli-Eigenschaften und -Funktionen verweist. Um die molekularen Mechanismen des Tubulin-Codes zu erforschen, ist es entscheidend, In-vitro-Rekonstitutionsexperimente mit gereinigtem Tubulin mit spezifischen Isotypen und PTMs durchzuführen.
Bis heute war dies technisch eine Herausforderung als Gehirn Tubulin, das weit verbreitet in In-vitro-Experimente verwendet wird, beherbergt viele PTMs und hat eine definierte Isotypzusammensetzung. Daher haben wir dieses Protokoll entwickelt, um Tubulin aus verschiedenen Quellen und mit unterschiedlichen Isotypzusammensetzungen und kontrollierten PTMs zu reinigen, wobei der klassische Ansatz von Polymerisations- und Depolymerisationszyklen verwendet wird. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, die auf der Affinitätsreinigung basieren, ergibt dieser Ansatz reines, polymerisationskompetentes Tubulin, da Tubulin, das gegen Polymerisation oder Depolymerisation resistent ist, während der aufeinanderfolgenden Reinigungsschritte verworfen wird.
Wir beschreiben die Reinigung von Tubulin aus Zelllinien, die entweder in Suspension oder als anhantibe Kulturen angebaut werden, und von einzelnen Mausgehirnen. Das Verfahren beschreibt zunächst die Erzeugung von Zellmasse sowohl in Suspensions- als auch in Hafteinstellungen, dem Lyseschritt, gefolgt von den aufeinanderfolgenden Stadien der Tubulinreinigung durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen. Unsere Methode liefert Tubulin, das in Experimenten verwendet werden kann, die sich mit dem Einfluss des Tubulin-Codes auf die intrinsischen Eigenschaften von Mikrotubuli und Mikrotubuli-Wechselwirkungen mit assoziierten Proteinen befassen.
Mikrotubuli spielen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle. Sie geben Zellen ihre Form, bauen meiotische und mitotische Spindeln für die Chromosomensegregation und dienen als Spuren für den intrazellulären Transport. Um diese vielfältigen Funktionen auszuführen, organisieren sich Mikrotubuli auf unterschiedliche Weise. Eine der faszinierendsten Fragen auf diesem Gebiet ist es, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die es den strukturell und evolutionär konservierten Mikrotubuli ermöglichen, sich an diese Fülle von Organisationen und Funktionen anzupassen. Ein potenzieller Mechanismus ist die Diversifizierung der Mikrotubuli, die durch das Konzept definiert wird, das als "Tubulin-Code"1,2,3" bekannt ist. Der Tubulin-Code umfasst zwei Hauptkomponenten: die Differentialintegration von α- und β-Tubulin-Genprodukten (Tubulin-Isotypen) in die Mikrotubuli und Tubulin-Posttranslationalmodifikationen (PTMs).
Seit den 1970er Jahren haben In-vitro-Rekonstitutionsexperimente, kombiniert mit sich entwickelnden Lichtmikroskopie-Techniken, den Weg für wichtige Entdeckungen über die Eigenschaften von Mikrotubuli geebnet: dynamische Instabilität4 und Laufband5,und ihre anderen Mechanismen und Funktionen6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Fast alle bisher durchgeführten In-vitro-Experimente basierten auf Tubulin, das aus Hirngewebe mit wiederholten Zyklen der Polymerisation und Depolymerisation16,17gereinigt wurde. Obwohl die Reinigung aus dem Hirngewebe den Vorteil der Gewinnung von hochwertigem Tubulin in großen Mengen (in der Regel Grammmengen) verleiht, ist ein wichtiger Nachteil die Heterogenität, da Tubulin, das aus Hirngewebe gereinigt wird, eine Mischung aus verschiedenen Tubulin-Isotypen ist und mit vielen Tubulin-PTMs angereichert ist. Diese Heterogenität macht es unmöglich, die Rolle eines bestimmten Tubulin-PTM oder Isotyps bei der Kontrolle von Mikrotubuli-Eigenschaften und -Funktionen abzustecken. Daher ist die Herstellung von Montage-kompetentem Tubulin mit kontrollierten Tubulin-PTMs und homogener Isotypzusammensetzung unerlässlich, um die molekularen Mechanismen des Tubulincodes anzugehen.
Kürzlich wurde ein Ansatz zur Reinigung von Tubulin durch Affinitätschromatographie mit der mikrotubulienbindenden TOG-Domäne (Tumor-überexprimiertes Gen) der Hefe Stu2pentwickelt. Bei dieser Methode wird Tubulin in rohen Lysaten von Zellen oder Geweben durch eine Säule geleitet, wo es an die matriximmobilisierte TOG-Domäne bindet, die die Analyse des gesamten Tubulinpools einer bestimmten, sogar sehr kleinen Probe ermöglicht. Ein lang erwarteter Ansatz zur Reinigung des rekombinanten Tubulins wurde in den letzten Jahren ebenfalls beschrieben. Es basiert auf dem Baculovirus-System, in dem ein bi-cistronischer Vektor, der α- und β-Tubulin-Gene enthält, in Insektenzellen19exprimiert wird. Diese Methode ist jedoch sehr umständlich und zeitaufwändig und wird daher hauptsächlich zur Untersuchung der Auswirkungen der Tubulinmutationen20 und der Tubulin-Isotypen21,22,23 in vitro verwendet.
Im aktuellen Protokoll beschreiben wir eine Methode, die den etablierten und weit verbreiteten Polymerisations-Depolymerisationsansatz als Blaupause verwendet, um Tubulin mit unterschiedlichen Modifikationsstufen entweder aus Zelllinien oder aus Maushirngewebe zu erzeugen24. Bei diesem Verfahren wird Tubulin zwischen dem löslichen (Tubulin-Dimer bei 4 °C) und der polymerisierten Form (Mikrotubuli bei 30 °C in Gegenwart von Guanosin 5'-Triphosphat [GTP]) geradelt. Jede Form wird durch aufeinander folgende Zentrifugationsschritte getrennt: Tubulin-Dimere bleiben nach einer Erkältung (4 °C) im Überstand, während Mikrotubuli bei 30 °C pelletiert werden. Darüber hinaus wird ein Polymerisationsschritt bei hoherPiperazin-N-Bis(2-Ethansulfonsäure) (PIPES) Konzentration durchgeführt, die die Entfernung von mikrotubuli-assoziierten Proteinen aus den Mikrotubuli und damit aus dem schließlich gereinigten Tubuli ermöglicht. Tubulin gereinigt aus HeLa S3 Zellen als Suspension oder anhantibe Kulturen gewachsen ist praktisch frei von jedem Tubulin PTM und wurde in den jüngsten In-vitro-Rekonstitutionsexperimente25,26,27,28verwendet. Wir haben die Methode zur Reinigung von Tubulin von einzelnen Mausgehirnen weiter angepasst, die für eine große Anzahl von Mausmodellen mit Änderungen in Tubulin-Isotypen und PTMs verwendet werden können.
Im Protokoll beschreiben wir zunächst die Erzeugung des Ausgangsmaterials (Zellmasse oder Hirngewebe), seine Lyse (Abbildung 1A), gefolgt von den aufeinanderfolgenden Schritten der Tubulinpolymerisation und Depolymerisation zur Reinigung des Tubulins (Abbildung 1B). Wir beschreiben ferner das Verfahren zur Beurteilung der Reinheit (Abbildung 2A,B) und der Menge (Abbildung 3A,B) des gereinigten Tubulins. Das Verfahren kann angepasst werden, um Tubulin zu produzieren, das mit einem ausgewählten PTM angereichert ist, indem ein modifizierendes Enzym in Zellen vor der Tubulinreinigung überexzessiert wird (Abbildung 4B). Alternativ können Tubulin-modifizierende Enzyme während des Reinigungsprozesses dem Tubulizuz hinzugefügt werden. Schließlich können wir Tubulin ohne spezifische Isotypen oder PTMs aus dem Gehirn von Mäusen reinigen, die einen Mangel an den entsprechenden Tubulin-modifizierenden Enzymen aufweisen (Abbildung 4B)29.
Die Methode, die wir hier beschreiben, hat zwei Hauptvorteile: (i) es ermöglicht die Produktion ausreichend großer Mengen Tubulin in relativ kurzer Zeit, und (ii) es erzeugt hochwertiges, reines Tubulin, entweder mit spezifischer Tubulin-Isotypzusammensetzung oder PTMs. Im zugehörigen Video dieses Manuskripts heben wir einige der kritischen Schritte dieses Verfahrens hervor.
Die Tierpflege und -verwendung für diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Gemeinschaft (2010/63/UE) durchgeführt. Experimentelle Verfahren wurden von der Ethikkommission des Institut Curie CEEA-IC #118 (Genehmigungnr. 04395.03 von der nationalen Behörde) in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien ausdrücklich genehmigt.
1. Herstellung von Reagenzien zur Tubulinreinigung
HINWEIS: Alle Puffer, die für die Tubulinreinigung verwendet werden, sollten Kaliumsalze und NICHT Natriumsalzeenthalten 30.
2. Amplifikations- und Erntequellen von Tubulin
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden drei Tubulinquellen verwendet: (i) Zellen (HeLa S3 und HEK-293), die als Suspensionskulturen angebaut werden; ii) Zellen, die als Anhantibe Kulturen angebaut werden (HEK-293, HeLa und U2 OS); und (iii) Maus-Hirngewebe. Dieses Protokoll betrachtet den Tag der Tubulinreinigung als "Tag 0" und dementsprechend wurden andere Schritte relativ zu Tag 0 beschrieben.
3. Lyse von Zellen oder Hirngewebe
4. Reinigung von Tubulin
Das Hauptziel dieser Methode ist die Herstellung von hochwertigem, montagekompetentem Tubulin in Mengen, die für wiederholte In-vitro-Experimente mit den gereinigten Komponenten ausreichen. Aus diesem Tubulin zusammengesetzte Mikrotubuli können in Rekonstitutionstests verwendet werden, die auf der gesamten internen Reflexionsfluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) mit dynamischen oder stabilen Mikrotubuli basieren, in Experimenten, die Mikrotubulidynamik, Wechselwirkungen mit MAPs oder molekularen Motoren und die Krafterzeugung durch die Motoren25testen. Sie können auch in microtubule-MAP Co-Pelleting Assays und Festkörper-NMR-Spektroskopie28verwendet werden.
Die Anreicherung und Reinheit von Tubulin während des gesamten Reinigungsprozesses kann mit einem Coomassie-gebeizten SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)-Gel, vorzugsweise den "TUB" SDS-PAGE Gelen, überwacht werden, die die Trennung von α- und β-Tubulinen ermöglichen, die als einzelnes Band in klassischen Gelen mitmigrieren32. Lysate, die in verschiedenen Schritten gesammelt werden (mit Ausnahme der allerletzten Depolymerisation, siehe Protokoll), werden in vergleichbaren Mengen auf das Gel geladen, um den Erfolg der Tubulinreinigung zu bewerten (Abbildung 2A)24. Die letzte Tubulinprobe, die sehr kostbar ist, wird nur zur Bestimmung der Tubulinkonzentration auf das Gel geladen. Es ist normal, etwas Tubulin im Prozess der wiederholten Zyklen der Polymerisation und Depolymerisation zu verlieren. Eine niedrigere ausbeutete des endgültigen gereinigten Tubulins kann entweder (i) auf eine unvollständige Depolymerisation von Mikrotubuli zurückzuführen sein, visualisiert durch das Vorhandensein einer großen Menge Tubulin in den Fraktionen P3, P5 und P7, oder (ii) eine ineffiziente Tubulinpolymerisation in Mikrotubuli, in diesem Fall ist eine geringere Menge tubulin in den Fraktionen P2, P4 und P6 und höher in den Fraktionen SN2, SN4 und SN6 vorhanden (Abbildung 2B). Wenn das Tubulin während der Polymerisationsschritte verloren geht (niedrigere Mengen an P2 und P4) (i) eine ausreichende Tubulinkonzentration während der Polymerisation (ii) verwenden Sie ein frisches Aliquot von GTP, und/oder (iii) die Temperatur der Polymerisationsreaktion bestätigen. Wenn das Tubulin während der Depolymerisationsschritte verloren geht (niedrigere Mengen an SN3 und SN5), erhöhen Sie die Zeit sowie die Pipettierung der Mischung auf Eis.
Für die Quantifizierung von gereinigtem Tubulin führen Sie die Proben zusammen mit den bekannten Mengen an Rinderserumalbumin (BSA, 0,5 g – 1 g – 2 g – 4 g)(Abbildung 3A) auf SDS-PAGE aus. Gele sind mit Coomassie brillant blau gefärbt, gescannt, und die Intensitäten von BSA und Tubulin-Bänder werden durch quantitative Densitometrie gemessen (Abbildung 3B) wie in https://openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ beschrieben. Bitte beachten Sie, dass die gleiche Analyse in Fidschi durchgeführt werden kann, eine aktualisierte Version von ImageJ33. Werte aus den BSA-Bändern wurden verwendet, um die lineare Regressionsgleichung zu bestimmen, die verwendet wurde, um die Proteinmenge in den Tubulinbändern zu berechnen. Zur Bestimmung der Tubulinkonzentration werden nur Tubulinbandintensitäten im Bereich der BSA-Kurve verwendet. Basierend auf der berechneten Tubulinkonzentration werden Aliquots der gewünschten Tubulinmengen hergestellt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. Wir erhalten in der Regel etwa 2 mg Tubulin aus vier Spinnerflaschen mit HeLa S3 Suspensionskulturen (15 g Zellen), 250 g Tubulin aus zehn Gerichten mit einem Durchmesser von 15 cm (1,2 g Zellen) und 1 mg Tubulin aus 1 g Maushirngewebe.
Zur Bestätigung der Anreicherung eines bestimmten Tubulin-Isotyps oder einer Modifikation kann mit den entsprechenden Antikörpern34,35die Anreicherung eines bestimmten Tubulin-Isotyps oder eine Modifikation bestätigt werden. Die Kontrolle Tubulin variiert je nach Tubulin von Interesse. Für Tubulin modifiziert in vitro mit einem modifizierenden Enzym, verwenden Sie unbehandeltes Tubulin als Kontrolle. Für Tubulin, das in Cellulo durch die Überexpression eines modifizierenden Enzyms modifiziert wird, verwenden Sie Tubulin, das von Zellen gereinigt wird, die das Enzym nicht als Kontrolle ausdrücken (Abbildung 4A). Kontrolle Tubulin für Tubulin gereinigt von Knockout-Maus Gehirne werden Tubulin von wilden Typ Mäuse sein (Abbildung 4B). In allen Immunoblot-Analysen wird eine gleiche Tubulinbelastung mit einem PTM-unabhängigen Anti-α-Tubulin-Antikörper (12G10) überprüft.
Abbildung 1: Tubulinreinigung aus verschiedenen Quellen mit Polymerisations-Depolymerisationszyklen. (A) Verschiedene Tubulinquellen werden mit spezifischen Strategien lysiert. HeLa S3 Zellen in Suspension kultiviert werden mit einer französischen Presse lysiert; HEK-293-Zellen werden durch repetitive Pipetten lysiert. Anhaftete Zellen wurden mit kurzen Pulsen der Beschallung und Maus-Hirngewebe mit einem Gewebe homogenisator lysiert. (B) Schematische Darstellung der aufeinanderfolgenden Schritte des Tubulinreinigungsprotokolls unter Verwendung von Zyklen der Kaltdepolymerisation und Warmpolymerisation. Nach Lyse- und Lysatklärung werden Mikrotubuli polymerisiert und pelletiert. Mikrotubuli werden dann depolymerisiert und anschließend in einem Hochmolaritätspuffer polymerisiert, wodurch eine Kosedimentation des mikrotubuli-assoziierten Proteins (MAP) mit den Mikrotubuli verhindert wird. MAP-freie Mikrotubuli werden dann depolymerisiert und können einem dritten Zyklus der Polymerisations-Depolymerisation unterzogen werden, um Spuren mengen des Hochmolaritätspuffers zu entfernen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bewertung des Erfolgs der Tubulinreinigung. Proben, die in verschiedenen Schritten des Tubulin-Reinigungsprotokolls gesammelt wurden, wurden auf einem "TUB"-Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE)-Gel (siehe Protokoll für Details) ausgeführt und mit Coomassie-Brillantblau gebeizt. (A) Bei einer erfolgreichen Tubulinreinigung werden α- und β-Tubuline während des gesamten Prozesses schrittweise angereichert. Nach der zweiten Polymerisation ist das Mikrotubulipellet (P4) praktisch frei von Verunreinigungen durch andere Proteine oder mikrotubulieassoziierte Proteine (MAPs). Beachten Sie, dass es normal ist, etwas Tubulin während des Eingriffs zu verlieren. (B) Bei einer erfolglosen Tubulinreinigung ist die endgültige Tubulinausbeute gering, und Tubulin verbleibt entweder im Pellet nach der Depolymerisation oder im Überstand nach Polymerisation (rote Felder). Im hier gezeigten Beispiel polymerisiert Tubulin in beiden Polymerisationsschritten nicht effizient. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung des gereinigten Tubulins mit Coomassie-gebeiztem Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Gele und Densitometrie. (A) Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel mit bekannten Mengen Rinderserumalbumin (BSA; 0,5, 1, 2 und 4 g, graue Gradientenlinie) und verschiedenen Volumina (0,5 bzw. 1 l, helle bzw. dunkle Farben) von gereinigtem Tubulin. Im gezeigten Beispiel wurden tyrosiniertes Tubulin (HeLa S3 Tubulin, helles und dunkles Orange) und detyrosiniertes Tubulin (HeLa S3 Tubulin behandelt mit Carboxypeptidase A, hell und dunkelblau) auf das Gel geladen. (B) BSA-Bänder von (A) wurden mit ImageJ (in beliebigen Einheiten, AU) quantifiziert und gegen die Menge des geladenen Proteins (graue bis schwarze Punkte) geplottet. Diese Punkte wurden verwendet, um die lineare Regressionslinie (die graue Gradientenlinie) und die Gleichung zu berechnen, die verwendet wurden, um die Proteinmengen in den Tubulinproben (helle und dunkle orange und blaue Punkte) zu berechnen, die auf das Gel geladen wurden. Dies erleichterte die Berechnung der Konzentration der Tubulinproben. Beachten Sie, dass die Punkte, die über die BSA-Standardkurve hinausgehen, nicht zur Bestimmung der Konzentration verwendet werden sollten (dunkelorange und blaue Punkte). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Immunoblot-Analyse von gereinigtem Tubulin mit verschiedenen PTMs. (A) Tubuline, die aus HEK-293-Zellen gereinigt wurden: Wildtyp oder Zellen, die TTLL5 oder TTLL7 überexzättigten, wurden mit dem GT335-Antikörper auf die spezifische Anreicherung der Polyglutamylierung untersucht. Während die TTLL5-Überexpression die Polyglutamylierung auf α- und β-Tubulin erhöht, bereichert die TTLL7-Überexpression speziell β-Tubulin-Glutamylierung. (B) Tubulin gereinigt aus Gehirngeweben wilden Typs und ttll1-/- Mäuse wurden auf Muster der Glutamylierung analysiert. Beachten Sie die starke Reduktion der Polyglutamylierung von Tubulin von ttll1-/- Mäusen, denen die Haupthirnglutamylase TTLL136fehlt. "TUB"-Gelwurden verwendet, um α- und β-Tubulin zu trennen. Eine gleiche Menge an Tubulinbelastung wurde durch 12G10, einen Anti-α-Tubulin-Antikörper, bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die hier beschriebene Methode bietet eine Plattform, um schnell hochwertiges, montagekompetentes Tubulin in mittelgroßen Mengen aus Zelllinien und einzelnen Mausgehirnen zu erzeugen. Es basiert auf dem Gold-Standard-Protokoll der Tubulinreinigung von Rinderhirnen, die seit vielen Jahren im Feld verwendet werden16,17. Ein besonderer Vorteil des Ansatzes ist die Verwendung von Suspensionskulturen von HeLa S3-Zellen, die, sobald sie etabliert sind, große Mengen an Zellen ergeben, während sie wenig Praktische Zeit benötigen. Dies macht das Protokoll relativ einfach in jedem Zellbiologielabor durchzuführen, während andere Tubulinreinigungsmethoden18,19,32,37 spezifische Ausrüstung und Know-how erfordern und daher meist von Laboratorien mit einem starken Hintergrund in der Proteinreinigung verwendet werden. Bei der Herstellung kleinerer Mengen tubulin aus anhaftenden Zelllinien kann eine Vielzahl von Zelllinien verwendet werden. Wir haben Tubulin erfolgreich aus HeLa-, U-2 OS- und HEK-293-Zellen gereinigt. Wenn eine größere Reinigung erforderlich ist, können geerntete Zellen oder Gehirne im Lysepuffer eingefroren und bei -80 °C gespeichert werden, und mehrere Zellpellets oder Gehirne können zusammengepoolt werden, um größere Mengen Tubulin zu reinigen.
Tubulin, gereinigt aus Zelllinien, ist praktisch frei von Tubulin-PTMs. Dieses Tyr-Tubulin kann leicht in einem einzigen einfachen Schritt25in detyrosiniertes (deTyr-) Tubulin umgewandelt werden. Um Tubulin mit anderen PTMs zu produzieren, können spezifische Tubulin-modifizierende Enzyme in Zellen vor der Tubulinreinigung überexprimiert werden. Darüber hinaus hilft die Verwendung von Zelllinien menschlichen Ursprungs als Materialquelle, mögliche artenübergreifende Probleme bei der Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Mikrotubuli und menschlichen MAPs zu vermeiden. Darüber hinaus kann Tubulin aus untransformierten (wie HEK293) oder transformierten (wie HeLa) Zellen Informationen über die Auswirkungen von mikrotubuliegerichteten Medikamenten (z. B. Taxane) auf normal- vs. Tumorzellmikrotubuli liefern.
Schließlich erleichtert unser Protokoll die Reinigung von Tubulin von einzelnen Mausgehirnen. Da immer mehr Mausmodelle von Tubulinmutationen und Modifikationen erzeugt werden, ermöglicht dieses Protokoll eine direkte Analyse der Eigenschaften und Wechselwirkungen von Mikrotubuli mit veränderter Tubulin-Isotypzusammensetzung38,39,40 oder Tubulin-PTMs31,41.
Der Ansatz basiert auf Zyklen der Polymerisation und Depolymerisation. So können spezifische Tubulin-Isotypen oder Tubulin mit bestimmten PTMs, die die Montage- und Demontageeigenschaften von Mikrotubuli beeinflussen, zu einem unverhältnismäßigen Verlust oder einer Verringerung solcher Tubulinformen während des Reinigungsprozesses führen. Nichtsdestotrotz haben wir gezeigt, dass wichtige Tubulin-PTMs, wie Acetylierung, Detyrosinierung, Glutamylierung und Glykolation, während des gesamten Tubulinreinigungsprozesses auf den Mikrotubuli zurückgehalten werden24. Es sollte jedoch beachtet werden, dass für quantitative Analysen der Tubulinzusammensetzung in Zellen oder Geweben der TOG-Spalten-basierte Tubulinreinigungsansatz besser geeignet ist, da er eine unvoreingenommene, polymerisationsunabhängige Tubulinreinigung ermöglichen würde18. Trotz seiner Einschränkung bietet unser Protokoll einen großen Vorteil bei der Erzeugung großer Mengen an hochwertigem Tubulin, das in sorgfältigen In-vitro-Rekonstitutionsexperimenten verwendet werden kann. Insbesondere erleichtert es die Verwendung von PTM-reichem Hirntubulin in Routineexperimenten.
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den ANR-10-IDEX-0001-02, den LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 und das Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. Cj wird vom Institut Curie, der französischen National Research Agency (ANR) vergeben ANR-12-BSV2-0007 und ANR-17-CE13-0021, dem Institut National du Cancer (INCA) Grant 2014-PL BIO-11-ICR-1 und der Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) Grant DEQ2017036756. MMM wird durch das Fondation Vaincre Alzheimer Stipendium FR-16055p und durch das France Alzheimer Grant AAP SM 2019 n°2023 unterstützt. JAS wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skodowska-Curie-Zuschussvereinbarung Nr. 675737 und des FRM-Zuschusses FDT201904008210 unterstützt. SB wurde durch den FRM-Zuschuss FDT201805005465 unterstützt.
Wir danken allen Mitgliedern des Janke-Labors, insbesondere J. Souphron, sowie G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) und A. Gautreau (Ecole Polytechnique) für die Hilfe bei der Erstellung des Protokolls. Wir danken der Tieranlage des Institut Curie für die Hilfe bei der Mauszucht und -pflege.
Der von J. Frankel und M. Nelson entwickelte Antikörper 12G10 wurde von der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen, die unter der Schirmherrschaft der NICHD entwickelt und von der University of Iowa gepflegt wurde.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
1-L cell culture vessels | Techne F7610 | Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells. | |
1.5- and 2-ml tubes | |||
14-ml round-bottom tubes | |||
15-cm-diameter sterile culture dishes | |||
15-ml screw-cap tubes | |||
2-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood. |
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride | Sigma | #A8456 | |
40% Acrylamide | Bio-Rad | #161-0140 | |
5-, 10- 20-ml syringes | |||
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes | |||
50-ml screw-cap tubes | |||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma | #A3678 | |
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 | Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa | dilution: 1/500 | |
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | dilution: 1/20,000 |
Aprotinin | Sigma | #A1153 | |
Balance (0.1 – 10 g) | |||
Beckman 1-l polypropylene bottles | For collecting spinner cultures | ||
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge | For collecting spinner cultures | ||
Biological stirrer | Techne MCS-104L | Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells | |
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide | Bio-Rad | #161-0201 | |
Blender IKA Ultra-Turrax® | For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice. | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
Bromophenol blue | Sigma | #1.08122 | |
Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentration: 1.7 U/µl |
Cell culture hood | |||
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2 | |||
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection. |
DMEM medium | Life Technologies | #41965062 | |
DTT, DL-Dithiothreitol | Sigma | #D9779 | |
EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
EGTA | Sigma | #E3889 | |
Ethanol absolute | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F7524 | |
French pressure cell press | Thermo electron corporation | #FA-078A | with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber). |
Glycerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
Glycine | Sigma | #G8898 | |
GTP | Sigma | #G8877 | |
Heating block | Stuart | #SBH130D | |
Hela cells | ATCC® CCL-2™ | ||
Hela S3 cells | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
Hydrochloric acid (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
Inverted microscope | With fluorescence if cell transfection is to be verified | ||
Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
jetPEI | Polyplus | #101 | |
JLA-8.1000 rotor | For collecting spinner cultures | ||
KOH | Sigma | #P1767 | KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection. |
L-Glutamine | Life Technologies | #25030123 | |
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes | Sigma | 4-16 K | |
Leupeptin | Sigma | #L2884 | |
Liquid nitrogen | |||
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips | |||
Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
Mouse brain tissue | Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines. | ||
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm | Terumo | #18G | |
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
Parafilm | |||
PBS | Life Technologies | #14190169 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140130 | |
pH-meter | |||
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions. |
PIPES | Sigma | #P6757 | |
Pipette-boy | |||
Rotors | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55 | ||
SDS-PAGE electrophoresis equipment | Bio-Rad | #1658001FC | |
SDS, Sodium dodecyl sulphate | VWR | #442444H | For preparing Laemmeli buffer |
SDS, Sodium dodecyl sulphate | Sigma | #L5750 | For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels |
Sonicator | Branson | #101-148-070 | Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used. |
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes | Eppendorf | 5417R | |
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma | #9281 | |
Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
Trizma base (Tris) | Sigma | #T1503 | |
Trypsin | Life Technologies | #15090046 | |
Ultracentrifuge rotors | TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | #357448 | for using with TLA-55 rotor |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | #349622 | for using with TLA-100.3 rotor |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | #355631 | for using with 70.1 Ti rotor |
Ultracentrifuges | Beckman | Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment |
Vortex mixer | |||
Water bath equipped with floaters or tube holders | Set at 30°C |
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