פרוטוקול זה מתאים את מדידות מחזור התא לשימוש בפלטפורמת ציטומטריית מסה. עם היכולות מרובות הפרמטרים של ציטומטריית מסה, מדידה ישירה של שילוב יוד מאפשרת זיהוי תאים בפאזה S בעוד סמני מחזור תוך תאיים מאפשרים אפיון של כל מצב מחזור תא במגוון תנאי ניסוי.

ויסות שלב מחזור התא הוא היבט חשוב של התפשטות התא והומאוסטזיס. שיבוש מנגנוני הבקרה השולטים במחזור התא הוא מאפיין של מספר מחלות, כולל סרטן. חקר מחזור התא מחייב את היכולת להגדיר את מספר התאים בכל חלק של התקדמות מחזור התא, כמו גם לתחום בבירור בין כל שלב במחזור התא. הופעתה של ציטומטריית מסה (MCM) מספקת פוטנציאל עצום לאנליזה של תא בודד בתפוקה גבוהה באמצעות מדידות ישירות של איזוטופים יסודיים, ופיתוח שיטה למדידת מצב מחזור התא על ידי MCM מרחיב עוד יותר את התועלת של MCM. כאן אנו מתארים שיטה המודדת ישירות 5-יודו-2′-דאוקסיורידין (IdU), בדומה ל-5-ברומו-2'-דאוקסיורידין (BrdU), במערכת MCM. השימוש ב-MCM מבוסס IdU זה מספק מספר יתרונות. ראשית, IdU משולב במהירות בדנ"א במהלך הסינתזה שלו, ומאפשר מדידה אמינה של תאים בשלב S עם דגירות קצרות של 10-15 דקות. שנית, IdU נמדד ללא צורך בנוגדנים משניים או צורך בפירוק DNA. שלישית, ניתן לשלב צביעת IdU בקלות עם מדידה של ציקלין B1, חלבון רטינובלסטומה פוספורילציה (pRb) והיסטון H3 פוספורילציה (pHH3), אשר ביחד מספקים תיחום ברור של חמשת שלבי מחזור התא. שילוב של סמני מחזור תאים אלה עם מספר הפרמטרים הגבוה האפשרי עם MCM מאפשר שילוב עם מדדים רבים אחרים.

ציטומטריית מסה מאפשרת זיהוי של כ-40 פרמטרים תוך ניצול הרזולוציה הגבוהה והאופי הכמותי של ספקטרוסקופיית מסות. נוגדנים המסומנים במתכת משמשים במקום נוגדנים מצומדים פלואורופורים המאפשרים מספר גבוה יותר של ערוצים ומייצרים זליגה מינימלית ^1,2. ל-MCM יתרונות וחסרונות ביחס לניתוח מחזור התא בהשוואה לציטומטריית זרימה. אחד היתרונות העיקריים של MCM הוא שמספר הפרמטרים הגדול מאפשר מדידה סימולטנית של מצב מחזור התא על פני מספר רב של סוגי תאי T אימונופנוטיפיים שונים בדגימות הטרוגניות מאוד. MCM שימש בהצלחה למדידת מצב מחזור התא במהלך המטופויזיס נורמלי במח עצם^{אנושי 3} ומודלים מורינים טרנסגניים של מחסור בטלומראז⁴. ניתוח מצב מחזור התא בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) הראה כי מחזור התא מתואם עם תגובות ידועות לטיפולים קליניים, ומספק תובנה in vivo לגבי מאפיינים תפקודיים שיכולים לסייע בבחירת טיפול⁵. יתרון שני של ניתוח מחזור תא ציטומטרי מסה הוא היכולת למדוד מספר רב של סמנים פונקציונליים אחרים שעשויים להיות מתואמים עם מצב מחזור התא. עבודות אחרונות הצליחו לקשר בין סינתזת חלבונים ורנ"א לבין מצב מחזור התא באמצעות שימוש בנוגדנים מתויגים ב-IdU ובמתכת ל-BRU ול-rRNA⁶. סוג זה של ניתוח פרמטרי ביותר המודד את מצב מחזור התא על פני אוכלוסיות רבות ברצף של התמיינות יהיה כמעט בלתי אפשרי עם טכנולוגיית ציטומטריית הזרימה הנוכחית. החיסרון העיקרי של MCM הוא היעדר כתמי DNA או RNA דומים לאלה המשמשים בציטומטריית זרימה פלואורסצנטית (למשל, DAPI, Hoechst, Pyronin Y וכו '). צבעים פלואורסצנטיים יכולים לתת מדידות מדויקות יחסית של תכולת הדנ"א והרנ"א, אך דיוק זה אפשרי רק בשל השינויים בתכונות הפלואורסצנטיות של צבעים אלה המתרחשים באינטרקלציה בין בסיסי נוקלאוטידים. לפיכך, ניתוח MCM אינו מסוגל למדוד את תכולת הדנ"א או הרנ"א בדיוק דומה. במקום זאת, ניתוח מחזור תא ציטומטרי מסה מסתמך על מדידות של חלבונים הקשורים למצב מחזור התא כגון ציקלין B1, חלבון רטינובלסטומה פוספורילציה (pRb), והיסטון H3 פוספורילציה (pHH3) בשילוב עם מדידה ישירה של אטום היוד משילוב IdU בתאים בשלב S. שתי גישות מדידה אלה מניבות תוצאות דומות מאוד במהלך התרבות תאית רגילה, אך עלולות להיות צורמות כאשר התקדמות מחזור התא משתבשת.

מדידת מספר התאים בכל שלב במחזור התא חשובה להבנת התפתחות תקינה של מחזור התא, כמו גם הפרעה במחזור התא, אשר נצפתה בדרך כלל בסרטן ובמחלות אימונולוגיות. MCM מספק מדידה אמינה של גורמים חוץ-תאיים ותוך-תאיים באמצעות נוגדנים מתויגים מתכתית; עם זאת, מדידת פאזת S הייתה מוגבלת מכיוון שאינטרקלטור הדנ"א המבוסס על אירידיום לא היה מסוגל להבדיל בין דנ"א 2N לדנ"א 4N. על מנת להגדיר את שלבי מחזור התא, פיתח בהבהאני שיטה המשתמשת ב-IdU בעל מסה של 127, הנמצאת בטווח של ציטומטר המסה ומאפשרת מדידה ישירה של תאים בשלב S³. מדידה ישירה זו עוקפת את הצורך בנוגדנים משניים או בשימוש בחומרים דנטורינג DNA כגון חומצה או DNase. בשילוב עם סמני מחזור תוך תאיים, הוא מאפשר רזולוציה גבוהה של התפלגות מחזור התא במודלים ניסיוניים.

פרוטוקול זה מתאים מדידות מחזור תא מפרוטוקולי ציטומטריית זרימה נפוצים עבור MCM. השיטות שלנו מספקות דרך נוחה ופשוטה לכלול פרמטרים של מחזור התא. שילוב IdU של דגימות חוץ גופיות דורש רק 10 עד 15 דקות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, שהוא קצר יותר מרוב פרוטוקולי צביעת BrdU הממליצים על זמני דגירה של מספר שעות ^3,7. ניתן לתקן דגימות משולבות של IdU ו- BrdU באמצעות מייצב פרוטאומי ולאחר מכן לאחסן אותן למשך זמן מה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. הדבר מאפשר לאחסן מספר גדול של דגימות מוכתמות ב-IdU לצורך ניתוח אצווה ללא ירידה באיכות הדגימה.

ד"ר Behbehani מקבל תמיכה נסיעות מ Fluidigm. Fluidigm רכשה גם ריאגנטים וחומרים לשימוש במעבדה.