Method Article
כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים לב אנושי רלוונטיים להתפתחות (hHOs) ביעילות באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים על ידי ארגון עצמי. הפרוטוקול מסתמך על הפעלה רציפה של רמזים התפתחותיים ומייצר רקמות לב אנושיות מורכבות ורלוונטיות מאוד מבחינה תפקודית.
היכולת לחקור את התפתחות הלב האנושי בבריאות ובמחלות מוגבלת מאוד על ידי היכולת לדגמן את המורכבות של הלב האנושי במבחנה. פיתוח פלטפורמות יעילות יותר דמויי איברים שיכולות לדגמן פנוטיפים מורכבים ב- vivo , כגון organoids ואיברים על שבב, ישפר את היכולת לחקור התפתחות הלב האנושי ומחלות. מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת אורגנוידים מורכבים מאוד של הלב האנושי (hHOs) על ידי ארגון עצמי באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והפעלה של מסלול התפתחותי צעד באמצעות מעכבי מולקולות קטנות. גופים עובריים (EBs) נוצרים בצלחת 96 באר עם בארות התקשרות עגולות, אולטרה נמוכות, המקלה על תרבות ההשעיה של מבנים בודדים.
ה- EBs עוברים בידול ל- hHOs על ידי אסטרטגיית אפנון איתות Wnt בת שלושה שלבים, הכוללת הפעלת מסלול Wnt ראשונית כדי לגרום לגורל mesoderm לב, צעד שני של עיכוב Wnt כדי ליצור שושלות לב מוחלטות, וצעד הפעלה Wnt שלישי כדי לגרום לרקמות איברים פרו-אפיקרדיאליים. שלבים אלה, המתבצעים בפורמט של 96 בארות, יעילים מאוד, ניתנים לשחזור ומייצרים כמויות גדולות של אורגנוידים לריצה. ניתוח על ידי הדמיית immunofluorescence מהיום 3 ליום 11 של בידול מגלה מפרט שדה הלב הראשון והשני ורקמות מורכבות מאוד בתוך hHOs ביום 15, כולל רקמת שריר הלב עם אזורים של cardiomyocytes פרזדורים וחדריים, כמו גם תאים פנימיים מרופדים ברקמת אנדוקרדית. האורגנוידים מציגים גם רשת כלי דם מורכבת בכל המבנה ובטנה חיצונית של רקמה אפיקרדיאלית. מנקודת מבט פונקציונלית, hHOs להכות בחוזקה ולהציג פעילות סידן נורמלית כפי שנקבע על ידי Fluo-4 הדמיה חיה. בסך הכל, פרוטוקול זה מהווה פלטפורמה מוצקה למחקרי במבחנה ברקמות לב דמויי איברים אנושיים.
מומים מולדים בלב (CHDs) הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם מולד בבני אדם ומשפיעים על כ -1% מכלל הלידות החיות1,2,3. ברוב הנסיבות, הסיבות ל- CHDs עדיין אינן ידועות. היכולת ליצור מודלים של לב אנושי במעבדה הדומים מאוד ללב האנושי המתפתח מהווה צעד משמעותי קדימה כדי לחקור ישירות את הגורמים הבסיסיים של CHDs בבני אדם ולא במודלים של בעלי חיים פונדקאיים.
התגלמות מודלים של רקמות שגודלו במעבדה הם אורגנוידים, מבני תאים תלת-ממדיים הדומים לאיבר בעל עניין בהרכב התא ובתפקוד הפיזיולוגי. אורגנואידים נגזרים לעתים קרובות מתאי גזע או מתאי אבות ונעשה בהם שימוש מוצלח לדגמן איברים רבים כגון המוח4,5, כליות6,7, מעיים8,9, ריאה10,11, כבד12,13 ולבלב14,15 רק כדי להזכיר כמה., מחקרים אחרונים הופיעו מדגים את ההיתכנות של יצירת organoids לב להרכיב עצמית ללמוד התפתחות הלב במבחנה. מודלים אלה כוללים שימוש בתאי גזע עובריים של עכבר (mESCs) כדי לדגמן פיתוח לב מוקדם16,17 עד מפרט atrioventricular18 ותאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים (hPSCs) כדי ליצור organoids לב-אנדודרם שכבת רב-נבט19 וקרדיואידים תאיים20 עם הרכב תאי מורכב מאוד.
מאמר זה מציג פרוטוקול אפנון WNT חדשני בן 3 שלבים כדי ליצור hHOs מורכבים מאוד באופן יעיל וחסכוני. Organoids נוצרים לוחות 96-well, וכתוצאה מכך מערכת מדרגית, תפוקה גבוהה שניתן להפוך לאוטומטית בקלות. שיטה זו מסתמכת על יצירת אגרגטים hPSC והפעלת צעדים התפתחותיים של cardiogenesis, כולל היווצרות mesoderm ו mesoderm לב, מפרט שדה הלב הראשון והשני, היווצרות איברים proepicardial, מפרט atrioventricular. לאחר 15 ימים של בידול, hHOs מכילים את כל שושלות התא העיקריות שנמצאו בלב, תאים פנימיים מוגדרים היטב, תאי פרזדורים וחדריים, ורשת כלי דם ברחבי האורגנויד. מערכת אורגנויד לב מתוחכמת ורבייה זו מקובלת לחקור ניתוחים מבניים, פונקציונליים, מולקולריים ותעתיקומיים בחקר התפתחות הלב, מחלות, והקרנה פרמקולוגית.
1. תרבות ותחזוקה של hPSC
הערה: מחשבי PC המושרה האנושי (hiPSCs) או תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) צריכים להיות מתורבתים לפחות 2 מעברים רצופים לאחר הפשרה לפני השימוש כדי ליצור EBs עבור בידול או הזעקה נוספת. h hPSCs מתורבתים במדיום PSC (ראה טבלת החומרים) על מטריצה חוץ-תאית במרתף (BM-ECM) מצופה 6-בארות צלחות תרבות. בעת ביצוע שינויים בינוניים ב- hPSCs בלוחות של 6 בארות, הוסף את המדיום ישירות לצד הפנימי של הבאר ולא ישירות על גבי התאים כדי למנוע ניתוק תאים לא רצויים או מתח. משתמשים צריכים להיזהר מראש התחממות PSC מדיה כי לא צריך להיות מחומם ב 37 °C (50 °F); כל מדיית PSC המשמשת בפרוטוקול זה הייתה תרמוס-ניתנת לתרמוס.
2. דור של אורגנוידים של לב אנושי תלת-ממדי
3. ניתוח אורגנויד
כדי להשיג ארגון עצמי hHO במבחנה, שינינו ושילבנו פרוטוקולי בידול שתוארו בעבר עבור הבחנה דו-שכבתית של קרדיומיוציטים21 ותאים אפיקרדיים22 באמצעות אפננים מסלול Wnt עבור 3D אורגנוידים טרום לב16 באמצעות גורמי גדילה BMP4 ו Activin A. באמצעות לוח 96-well EB ו- hHO פרוטוקול בידול המתואר כאן ומוצג איור 1 הריכוזים ומשכי החשיפה של מפעיל מסלול Wnt CHIR99021 היו מותאמים להפקת hHOs רב-ניתן לשחזור ומורכבים ביותר שמקורם במחשבים אנושיים. hPSCs או hESCs מתורבתים ב- PSC בינוני עד 60-80% השפעה במבנה דמוי מושבה עם הבחנה מינימלית עד ללא הבחנה נראית לעין אידיאליים עבור דור EB (איור 1B).,
EBs הורשו לדגור במשך 48 שעות עם שינוי בינוני לאחר 24 שעות לפני תחילת בידול ביום 0. ביום 0, ה-EBs אמור להופיע כצבירה כדורית כהה במרכז כל באר תחת מיקרוסקופ בהיר (איור 1B). פרוטוקול הבידול מתחיל ביום 0 עם הפעלת מסלול Wnt ותוספת גורם גדילה עבור בדיוק 24 שעות. אינדוקציה זו mesoderm ואחריו אינדוקציה mesoderm לב ביום 2 באמצעות מעכב מסלול Wnt Wnt-C59 יגרום הגדלה משמעותית של organoid מ ~ 200 מיקרומטר בקוטר ל 500-800 מיקרומטר בקוטר ביום 4 ועד ככל 1 מ"מ (organoids עלול לחוות ירידה קלה בגודל ביום 15 (איור 1C)). ה- hHO יתחיל להכות כבר ביום 6 (וידאו 1), כאשר 100% מהאורגנוידים מראים מכות גלויות ביום 10 (וידאו 2) (אלא אם כן נעשה טיפול תרופתי או אם hPSCs לקוי שימשו ליצירת ה- EBs). זה נצפתה ב 5 קווי תא hPSC נפרדים23.
כדי להעריך את היכולת של hHOs לייצג שלבים שונים של ההתפתחות הפיזיולוגית של הלב, אספנו organoids בנקודות זמן שונות לאורך פרוטוקול הבידול וחיפשנו את הנוכחות ואת הביטוי התמלול של סמני שדה הלב. כתמים אימונופלואורסצנטיים עבור סמן שדה הלב הראשון (FHF), HAND1, וסמן שדה הלב השני (SHF), HAND2, חשפו את נוכחותם הגרעינית בתאי אבות הלב האלה הנובעים בסביבות היום השלישי והיום החמישי, בהתאמה (איור 3A).
הביטוי של שני הסמנים קורה באזורים של organoids כי להקטין בגודל לאחר יום 7 עבור FHF ואחרי יום 9 עבור SHF. מעניין, תמונות הגדלה גבוהה של אורגנוידים יום 7 גילו כי רוב התאים HAND1-מבטא היו cardiomyocyte במקור (כפי שמוצג על ידי סמן ספציפי cardiomyocyte TNNT2). לעומת זאת, רבים מהתאים מבטאי HAND2 לא הביעו את סמן הקרדיומיוצייט (איור 3B). תצפית זו היא בהסכמה עם organoids טרום לב נגזר ESCs עכבר מדגים את ההתפתחות של תאים שאינם myocyte מתאי האב SHF16. חשוב לציין שנתוני ריצוף הרנ"א מראים שתמלילי הרנ"א עבור HAND1 ו-HAND2 התבטאו מהיום השלישי ואילך, כאשר סמן ה-FHF בא לידי ביטוי גבוה יותר בין הימים 3-11 וסמן ה-SHF בא לידי ביטוי גבוה יותר לאחר היום ה-13 (איור 3C).
כתמי אימונופלואורסצנטיות חשפו את נוכחותם של סמנים של שושלות תאים שונות המרכיבות את הלב האנושי. רקמת שריר הלב (ניתנת לזיהוי באמצעות הסמן הספציפי לקרדיומיוציטים TNNT2) בסמוך לרקמת אפיקרדיה (המסומנת על ידי גורם התמלול הגרעיני WT1 וסמן קרום האפיתל TJP1) (איור 4A). תאים אנדוקרדיים המביעים את NFATC1 זוהו מרפדים את קירות המבנים הפנימיים דמויי התא בתוך האורגנוידים (איור 4B). ניתן לראות תאים אנדותל ברשת דמוית כלי שיט כבר ביום 13 של בידול (איור 4C). לבסוף, אנו מדווחים על נוכחות של פיברובלסטים לב מעורבבים ברחבי האורגנויד (איור 4D). סמנים מסוג תאים אלה נצפו גם בפרופילי ביטוי הגנים RNA-Seq (איור 4E). הרכב סוגי התאים באורגנוידים, כפי שהוא נמדד לפי אזור האורגנויד שהם תופסים, נמצאו כ- ~ 58% קרדיומיוציטים, כאשר השאר מורכב מתאי לב שאינם מיוציטים, כולל תאים אפיקרדיאליים (~ 15%), תאי אנדוקרדיים (~ 13%), פיברובלסטים לב (~ 12%), ותאי אנדותל (~ 1%) (איור 4F).
התפקוד האלקטרופיזיולוגי של האורגנוידים נמדד על ידי הדמיית סידן חיה של תאים בודדים באורגנוידים שלמים. עוצמת הפלואורסצנטיות של פלואו-4 משתנה עם הזמן עקב כניסת סידן ויציאה מהתא, מה שמחשוף פוטנציאל פעולה קבוע (איור 5A). מפת חום המציגה עוצמות סידן מעל אזור הגדלה גבוהה של האורגנויד מראות את העוצמה המוגברת בגלל סידן ארעי בתאים בודדים (איור 5B ו-Video 3).
איור 1: דור גוף עוברי ושלבי בידול אורגנוידים ללב. (A) (1-2) תאים מנותקים נזרעים לבארות של צלחת התקשרות אולטרה-נמוכה בעלת 96 בארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית. (3) הלוח 96-באר הוא אז צנטריפוגה, אשר מאפשר לתאים לצבור במרכז. (4) עם הזמן, בעקבות הוספת גורמי גדילה ומאפננים מסלול, הגוף העוברי מתחיל להתבדל למספר שושלות לב וליצור אוכלוסיות תאים נפרדות מרחביות ופיזיולוגיות המקיפות מיקרוצ'מברים פנימיים. (B) תמונות מייצגות של התקדמות ייצור הגוף העוברי, החל מתרבות iPSC דו-ממדית (משמאל) וכלה בגוף עוברי יום 0 (מימין); סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (C) סיכום פרוטוקול בידול אורגנויד לב האדם, כולל אפננים ומעכבי מסלול כימיים עם נקודות זמן, משכי זמן ופיתוח תמונות organoid תחת מיקרוסקופיה אור מיום 1 עד יום 15; סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הרכבה אורגנויד שלם על שקופיות להדמיה. שלבים להכנת שקופיות והרכבת אורגנוידים להדמיה. (א) מיקום חיידקים בשולי מגלשת זכוכית. (B) מכסה את החיידקים עם בינוני הרכבה. (ג) העברת organoids על השקופית בין החרוזים והסרת נוזל עודף סביב organoids. (ד) מכסה את האורגנוידים עם מדיום ניקוי/הרכבה. (ה) הצבת כיסוי על גבי השקופית עם organoids וחרוזים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שדה הלב הראשון ומפרט שדה הלב השני ב- hHOs מסכם את התפתחות הלב האנושי הפיזיולוגי. (A) תמונות אימונופלואורסצנטיות קונפוקליות של היום השלישי עד היום 11 hHOs המציגות את היווצרות FHF (HAND1, top) ו- SHF (HAND2, למטה) וקרדיומיוציטים (TNNT2) וצבע גרעיני DAPI; מוטות קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) תמונות הגדלה גבוהה של יום 7 organoids המציגים לוקליזציה משותפת של HAND1 ו HAND2 עם סמן cardiomyocyte TNNT2; סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) פרופילי ביטוי גנים RNA-Seq של סמן FHF HAND1 (אדום) וסמן SHF HAND2 (כחול) מיום 0 ועד יום 19. קיצורים: hHOs = אורגנוידים לב אנושי; FHF = שדה לב ראשון; SHF = שדה לב שני; יד = נגזרות לב ופסגה עצבית לידי ביטוי; TNNT2 = טרופונין לב T2; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: hHOs מפתחים שושלות לב. (א-ד) תמונות אימונופלואורסצנטיות קונפוקליות של יום 15 hHOs המציגות היווצרות של קרדיומיוציטים (TNNT2) וכתמים עם DAPI צבע גרעיני בתאי לב שאינם מיוציטים. (A) אורגנויד שלם והגדלה גבוהה של סמן אפיקרדיאלי WT1 (ירוק) וסמן קרום אפיתל TJP1 (לבן) מראה תאים אפיקרדיאליים ממוצא אפיתל על גבי ובסמוך לרקמת שריר הלב; סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר, כניסה = 50 מיקרומטר. (B) סמן אנדוקרדי NFATC1 (ירוק) ביטוי על בטנה של תאים; סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (C) רשת כלי אנדותל ב hHOs המוצגת על ידי PECAM1 (ירוק). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (D) סמני פיברובלסטים לבאיים THY1 ו- VIM המוצגים בירוק ולבן, בהתאמה, מופצים ברחבי האורגנויד. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (E) פרופילי ביטוי גנים RNA-Seq של סוגי התאים העיקריים הקיימים ב- hHOs מימים 0 עד 19 של בידול. קיצורים: hHOs = אורגנוידים לב אנושי; TNNT2 = טרופונין לב T2; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול; WT1 = גורם התמלול של וילם-1; NFATC1 = גורם גרעיני ציטופלסמי של תא T מופעל; PECAM1 = מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות דם-1; VIM = vimentin. (ו) תרשים עוגה של הרכב סוג הרקמה הממוצע ב- hHOs, המחושב כאזור האחוז עם סמן התא המתאים על פני אורגנויד שלם על ידי כתמים גרעיניים על פני שלושה z-מישורים ברחבי organoid באמצעות ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: Fluo-4 הקלטות חולפות סידן חי באורגנוידים חיים של לב אנושי. (A) הקלטות חולפות סידן מייצגות של קרדיומיוציטים בודדים בתוך organoids שלם. (B) מפת חום המציגה רמות סידן נמוכות ופסגות בין פוטנציאל פעולה כפי שנקבע על ידי עוצמת Fluo-4; סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: הדמיה חיה של אורגנויד מייצג המופק hPSCs ביום 6 של בידול תחת מיקרוסקופיה קלה בטמפרטורת החדר. קיצור: hPSC = תא גזע פלוריפוטנטי אנושי. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו 2: הדמיה חיה של אורגנויד מייצג המופק hPSCs ביום 15 של בידול תחת מיקרוסקופיה קלה בטמפרטורת החדר. קיצור: hPSC = תא גזע פלוריפוטנטי אנושי. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו 3: הקלטה חיה של יום 10 organoid מראה מפת חום של ארעי סידן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
ההתקדמות האחרונה בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע אנושיים ובתאים אחרים ממוצא לבבי שימשו למודל התפתחות הלב האנושי22,24,25 ומחלות26,27,28 וכלים לבדיקת טיפולים29,30 וסוכנים רעילים31,32 . כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול קל ליישום, רב לשחזור כדי ליצור ולהבדיל EBs לתוך hHOs מורכב מאוד. פרוטוקול זה הצליח בשורות תאים מרובות, כולל hPSCs ו- hESCs23, המציגים תדרי פעימה עקביים וארגון סוג תא. פרוטוקול זה שואב היבטים מפרוטוקולים שתוארו בעבר עבור בידול קרדיומיוציטים24, בידול תאים אפיקרדיאלי22, ואורגנוידים טרום לב הנגזרים מ- ESCs16 עכבר ומייעל את אפנון הצעדים של איתות WNT קנוני באמצעות מעכבים כימיים וגורמי גדילה במדיום מוגדר במלואו. מספר מתודולוגיות אופטימיזציה הופעלו ביצירת פרוטוקול זה.
ראשית, ריכוזי מעכב כימי ומשכי חשיפה, כמו גם תוספת של גורמי גדילה, עברו אופטימיזציה לסביבה 3D והם נדונים בעבודה קודמת23. אלה היו ממוטבים כדי להדגיש מבנים עם מורכבות פיזיולוגית וייצוג של הלב האנושי in vivo , עם הרכב פיזיולוגי ויחסים של cardiomyocytes לסוגי תאי לב שאינם מיוציטים (תאים אפיקרדיים, פיברובלסטים לב). שנית, אסטרטגיית השינוי הבינוני של שני שלישים מאפשרת תסיסה מינימלית של EBs / organoids, כפי שהם יושבים בהשעיה ליד החלק התחתון של הבאר, תוך גם להקל על חשיפה הדרגתית מעכבים כימיים וגורמי גדילה כאשר המדיום מתרענן. השילוב של בידול mesoderm לב באמצעות הפעלת מסלול Wnt, ואחריו עיכוב24, ואת האינדוקציה הבאה של מפרט פרו-אפיקרדיאלי באמצעות הפעלת מסלול Wnt שני22, מאפשר פרוטוקול יחיד להניב hHOs מורכב מאוד. האורגנוידים גדלים עד 1 מ"מ לאחר 15 ימים של בידול וניתן להעביר אותם בקלות עבור ניתוחים ובוחות חיים או קבועים. שלישית, בהתחשב בגודל הגדול של organoids, השימוש microbeads או מבנים דומים אחרים כדי לשמור על רווח בין השקופית כיסוי נמצא כדי לשמר טוב יותר את המבנה 3D של organoids ולשפר את תהליך ההדמיה.
מודל לב אנושי מתפתח זה מאפשר גישה לשלבים בלתי נגישים אחרים של התפתחות הלב, כגון מפרט שדה הלב הראשון והשני מוקדם והשני- נצפה בין ימים 3 ו -9 של בידול - וארגון לתאי אבות לב המעוררים רקמות לב, כולל שריר הלב, אנדוקרדיום, אפיקרדיום, vasculature אנדותל, ותמיכה פיברובלסטים לב, אשר נצפו ביום 15 של בידול. סוגי הרקמות הנמצאים באורגנוידים של הלב הנגזרים מפרוטוקול זה מייצגים מאוד את הלב העוברי האנושי הן בקומפוזיציה33 והן בפרופיל התמלול23,34. לכן הם יכולים להקל על רקמת רקמות ואינטראקציות מסדר גבוה יותר של תאי תא הדומה לזה של הלב in vivo. פרוטוקול זה היה יעיל מאוד ושחזור על פני ניסויים וקווי תאים, מניב organoids המרכיבים בעיקר של cardiomyocytes וכוללים תאי לב שאינם myocyte, כגון תאים epicardial, תאי אנדוקרדיים, פיברובלסטים לב, ותאי אנדותל, המייצגים את הרכב פיזיולוגי23,33,35.
ניתוחים של ההשמדה האולטרה-מבנית של הקרדיומיוציטים היוצרים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור ופיתוח תאים ורשת כלי דם באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית והדמיה קונפוצלית נדונים בפירוט בעבודה הקודמת23. יתרון גדול של פרוטוקול organoid לב זה על פרוטוקולים קיימים אחרים שפורסמו לאחרונה17,18,19,20,36,37 הוא היווצרות חזקה של רשת אנדותל ברחבי organoid, המאפשר את היכולת לחקור התפתחות כלי דם ומחלות בלב האדם המוקדם, ללא צורך אינדוקציה חיצונית נוספת לפרוטוקול. לבסוף, ניתוח פונקציונלי של organoids הלב הוא בר השגה באמצעות גישות שונות, כולל שימוש בצבע רגיש לסידן כדי לעקוב אחר החולף סידן בקרדיומיוציטים על פני organoid. באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, רשמנו את עוצמת הפלואורסצנטיות של סידן הנכנס ויוצא מתאים ונצפו בפוטנציאל פעולה מייצג מאוד. שיטות ניתוח פונקציונליות אפשריות אחרות כוללות שימוש בקו מהונדס עם מחוון רגיש לסידן או הקלטה ישירה באמצעות מערך microelectrode23.
האורגנוידים הלב המתוארים כאן הם recapitulative של הלב העוברי המתפתח, אך מוגבלים בהדגמת תכונות בוגרות יותר, כמו מבוגר. פרוטוקולים עתידיים עשויים לבנות על הפרוטוקול המתואר כאן כדי לגרום להבשלה באורגנוידים אלה ולהניב מבנים שמדגמים טוב יותר את הלב הבוגר. יתר על כן, פרוטוקול זה נועד ליצור מודלים זעירים של הלב האנושי ומוגבל למחקרים על התפתחות הלב ומחלות או לבדיקת תרופות וייתכן שאינו מתאים כאמצעי להתערבות קלינית כגון החלפת רקמת לב באמצעות השתלה. בסך הכל, אנו מתארים כאן פרוטוקול קל למעקב וחסכוני ליצירת אורגנוידים לב אנושיים ניתנים לשחזור ומתוחכם ביותר שיכולים להקל על מחקרים בהתפתחות הלב האנושי, אטיולוגיה של מחלות והקרנה פרמקולוגית.
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
עבודה זו נתמכה על ידי מכון הלב, הריאות והדם הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרסים K01HL135464 ו- R01HL151505 ועל ידי איגוד הלב האמריקאי תחת פרס מספר 19IPLOI3660342. אנו מבקשים להודות לליבת המיקרוסקופיה המתקדמת של MSU וד"ר ויליאם ג'קסון במחלקת MSU לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה על גישה למיקרוסקופים קונפוקליים, לליבת המיקרוסקופיה של IQ ולליבה הגנומית של MSU עבור שירותי רצף. אנו גם רוצים להודות לכל חברי מעבדת אגירה על הערותיהם ועצותיהם החשובות.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
Media and Reagents | |||
Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
Other | |||
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
ImageJ | NIH | Image processing software | |
Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
Thermal Mixer | ThermoFisher Scientific | 13-687-717 | |
Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved