הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.

טכניקות מימדי תרביות רקמה (2D) היה חיוני להבנת ביולוגיה של התא הבסיסי. עם זאת, היעדר מערכות התרבות המסורתית של רקמות 2D מטריצה תלת מימדי (3D), וכתוצאה מכך משמעותי נתק בין תוצאות נאסף במבחנה ו vivo בתוך. כדי לטפל מגבלה זו, החוקרים היה לתכנן פלטפורמות תרביות רקמה הידרוג תלת-ממד שיכולים לחקות את המאפיינים הביוכימי ו ביופיזיקלי של microenvironment תא ויוו . מחקר זה הניעה את הצורך לפתח פלטפורמות גשמי התומכים תא 3D כימוס של מבחני הביוכימי במורד הזרם. חלבון רקומביננטי הנדסה מציעה ערכת כלים ייחודיים הידרוג תלת-ממד גשמי עיצוב ופיתוח על-ידי מתן שליטה מסוימת של חלבון רצף ולכן, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני תוצאות מטריקס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly אלסטין, כמו חלבון (ELP), אשר יכול לשמש כדי hydrogels טופס עם תכונות מכניות באופן עצמאי tunable וריכוז ליגנד תא-דבק. בהמשך אנו מציגים מתודולוגיה תא אנקפסולציה בתוך אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels ומוטבעים מכתים immunofluorescent עוקבות של תאים עבור ניתוח במורד הזרם כמת.

במהלך המאה האחרונה, מימדי תרביות רקמה (2D) התפתחה כלים אינטגרלי ללמוד תא יסוד ביולוגיה במבחנה. בנוסף, הפרוטוקולים יחסית נמוכים ופשוטים לקבלת תרבית תאים 2D הובילו האימוץ שלה על פני תחומים רבים ביולוגי ורפואי. עם זאת, מחקרים שנעשו בעבר הראו כי פלטפורמות 2D מסורתי עשוי להוביל לתוצאות כי לסטות בצורה ניכרת האלה שנאספו ויוו, גורם זמן יקר ומימון מבוזבז עבור מחקר קליני מונחה^{1,2, 3}. אנחנו ואחרים משערים כי אי-התאמה זו לייחס חוסר רמזים הביוכימי, biophysical יליד מסופקים על התאים תרבותי על משטחים 2D, אשר יכול להיות הכרחי עבור הפצת אופטימלית, ההבשלה של סוגי תאים שונים.

כדי לטפל אלה גשר מגבלות ולעזור הפער בין 2D מחקרים במבחנה , ויוו , חוקרים יש פלטפורמות מפותחת הידרוג תלת מימדי (3D) התא-כימוס^{1,4,5 ,6}. Hydrogels הם חומרים אידיאלי כדי לסכם את microenvironment אנדוגני של ה מטריצה חוץ-תאית (ECM) ויוו עקב שלהם תכונות מכניות רקמה דמוית ומבנה נפוחות-מים המאפשרת מעבר מהיר של חומרים מזינים, איתות גורמים^7,8. יתר על כן, 3D hydrogels ניתן לעצב יש שליטה עצמאית על מאפייני מכני וביוכימי לגרדום. מטריקס מכניקה^9,10,11,12 והן תא-דבק ליגנדים^13,14,15 ידועים להשפיע על התא התנהגות במבחנה , ויוו. לפיכך, hydrogels 3D עם מאפיינים tunable מציעים פלטפורמה כדי לחקור את היחסים סיבתי בין תאים microenvironment שלהם. קריטריונים עבור מטריצה הידרוג 3D אידיאלי כוללים תא פשוט, שאינו-ציטוטוקסיות-כימוס, כמו גם tunability עצמאית של תכונות מכניות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, מחקה של מוטיבים תא-דבק מקורית.

שניהם סינתטיים (למשל., פוליאתילן גליקול, חומצה polylactic, פוליפוני (חומצה גליקולית)), נגזר באופן טבעי (למשל., alginate, קולגן, Matrigel) hydrogels יש יתרונות על פני 2D in vitro לקשרי תרבות פלטפורמות; עם זאת, יש להם גם חסרונות משמעותיים אשר להגביל את התחולה שלהם. הראשון, פלטפורמות רבות סינטתיים, נגזר באופן טבעי לדרוש תנאים קשים crosslinking יכול להיות רעיל לתאים בתרבית של, מה שהוביל ירדה תא הכדאיות⁷. בנוסף, פלטפורמות סינתטיים רבים חוסר אתריים מקורית ויש צורך להיות functionalized דרך משני תגובות כימיות, אשר יכול להוסיף את העלות והמורכבות מוגברת¹⁶. לבסוף, בעוד חומרים באופן טבעי-derived מכילים בדרך כלל מהותי בתחומים ביו-אקטיביות, הם לעיתים קרובות מוטרדים על ידי השתנות אצווה-כדי-אצווה גבוהה, לעיתים קרובות מוגבלות ויוצרים ג'לים חלשה יחסית^7,17.

חלבון רקומביננטי הנדסה מציג ערכת כלים ייחודיים לעיצוב חומרים על-ידי מתן שליטה מפורשת על חלבון רצף, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני הידרוג הסופי לגרדום¹⁸. בנוסף, באמצעות מינוף המנגנון הביולוגי הידוע של Escherichia coli (e. coli) לבטא חלבונים, חומרים יכול להיות מיוצר באופן חסכוני ועקבי עם השתנות מוגבל אינטר - ו אינטרה-אצווה. החלבון כמו אלסטין (ELP) המוצג כאן יש שלושה תחומים מהונדסים: (1) T7 ו His6 תג מאפשר תיוג ויה fluorescently מתויג נוגדנים, (2) אזור 'אלסטין דמוי' מקנה תכונות מכניות אלסטית ומאפשרת עבור חומר כימי crosslinking, ו- (3) אזור 'ביו-אקטיבי' מקודד עבור התא-דבק מוטיבים.

באזורנו אלסטין דמוי מבוסס על רצף הקנוני של אלסטין₅ (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) שבו ארבעה מתוך 'Xaa' חומצת אמינו באתרים איזולאוצין (Ile), אבל יכול להיות מתוכנן להיות כל חומצה אמינית פרט פרולין. רצף זה מעניק ELPs רקומביננטי עם התחתון התנהגות טמפרטורה (LCST) פתרון קריטי שעלולים להיות מנוצלים לרעה לביטוי שלאחר טיהור פשוטה באמצעות תרמית רכיבה על אופניים^19,20. בית מלון LCST זה ניתן לכוונן אותו תרמית צבירה בטמפרטורות שונות על-ידי שינוי של חוות 'Xaa' שאריות^21,22.

כאן, עמדה 'Xaa' על אחד חוזר כמו אלסטין חמש הוחלף את הצגת amine ליזין (Lys) חומצת אמינו, אשר מנוצל עבור הידרוג crosslinking. העבודות הקודמות שלנו הראו crosslinking הלא-ציטוטוקסיות וחזק באמצעות תגובה עם כלוריד (THPC)²³phosphonium tetrakis (hydroxymethyl) crosslinker אמין-ריאקטיבי. מאת בדרגות שונות הכוללת חלבון התוכן crosslinker ריכוז, אנו מסוגלים לייצר hydrogels זה ניתן לכוונן אותו span של נוקשות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית טווח (~0.5-50 kPa)^9,23,24. בנוסף כוונון תכונות מכניות, התא אדהזיה בתוצאות הידרוג מן השילוב של תחומים תא-דבק קאנונית בתוך עמוד השדרה של החלבון אמרסון, לייק ופאלמר. לדוגמה, שילוב של מורחבים נגזר fibronectin 'RGDS' חומצת אמינו הרצף מאפשר תא הידבקות וגמישות הסתגלותי, ואילו מקושקשות, מחייב 'RDGS' משתנה מגבילה את תא-מטריקס אדהזיה²⁴. מאת להתכוונן על היחס של התא-דבק חלבונים ללא דבק, כמו גם ריכוז החלבון הכולל, אנו מסוגלים לייצר ביעילות hydrogels שיימתחו מגוון רחב של ליגנד ריכוז. . Resultantly, פיתחנו פלטפורמה הידרוג עם decoupled נכסים הביוכימי, biophysical, אשר ניתן לכוונן באופן עצמאי לתרבות 3D אופטימלית של סוגי תאים שונים.

בנוסף נוקשות מטריקס וליגנד דבק tunability, hydrogels רקומביננטי מציעים את היכולת פרופילים ספציפיים השפלה גשמי עיצוב, אשר הכרחי תא התפשטות, התפשטות של הגירה בתוך ההקשר 3D^{4 , 9}. את ההשפלה הזו המוענקת על ידי הפרשת תא פרוטאזות שמתמקדים 'RGDS' מורחבת⁹ או רצף אלסטין דמוי²⁵. אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels יש גם הוכח כדי לתמוך את מבחני הביוכימי עוקבות הדרושים ללימוד תא הכדאיות ותפקוד כולל immunocytochemistry, כמו גם מיצוי DNA/RNA/חלבון עבור הפוכה כמותיים תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) והמערבית כתם⁹. אמרסון, לייק ופאלמר משתנים גם השתמשו במספר דגמים ויוו , ידועים להיות נסבל היטב על ידי המערכת החיסונית²⁶.

יחדיו, אמרסון, לייק ופאלמר כמו פלטפורמה גשמי ללימודי תא-כימוס מציע מגוון רחב של יתרונות בהשוואה פלטפורמות חומרים סינתטיים או נגזר באופן טבעי, אשר לעתים קרובות חוסר באותה מידה של tunability הביוכימי, הביו-פיסיקלי ו הפארמצבטית. בנוסף, פשוטה-ציטוטוקסיות לשימוש של אמרסון, לייק ופאלמר עם מגוון רחב של סוגי תאים (למשל., צ'יק העזוב שורש הגרעינים^14,24, מאתר קדמון עצבית תאים⁹,²⁷, שור תאי גזע אנושי mesenchymal neonatal chondrocytes²⁸, האדם אנדותל תאים^29,30) מאפשר מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית של ECM 3D אנדוגני בהשוואה תרבית תאים 2D. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly, ELPs לשימוש כפלטפורמה הידרוג tunable 3D תא אנקפסולציה. בהמשך נציג את המתודולוגיה תיוג פלורסנט למטה-stream, מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים שעברו אנקפסולציה.

1. לשכנו ביטוי בפרוטוקול

1. יום 1: גידול המושבה starter
   1. להכין פלטות אגר אמפיצילין, כלורמפניקול מאת autoclaving 25 גר' לוריא ציר 15 גרם של אגר לכל 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. ברגע הפתרון הוא מקורר עד ~ 60 ° C, להוסיף 1 מ"ל של מניות אמפיצילין (100 מ"ג/מ"ל מים הנדסה גנטית) ו- 1 מ"ל כלורמפניקול מניות (34 מ"ג/מ"ל אתנול 70%) 1 ליטר של אגר לפתרון הסופי ריכוזי µg 100/mL µg 34/mL , בהתאמה. 20 מ של הפתרון הסופי להעביר צלחות פטרי 10 ס מ עם פיפטה סרולוגית ולאפשר את אגר לגבש. לעטוף את צלחות פטרי עם מצלמות-מיקרוסקופים וחנות ב 4 º C.
      הערה: צלחות פטרי שניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבועיים.
   2. פסים מדגם קטן של BL21 (DE3) pLysS e. coli מן מניה חיידקי מוכנות מראש שמכיל וקטור pET15b קידוד של אמרסון, לייק ופאלמר עניין על צלחת אגר אמפיצילין, כלורמפניקול.
      הערה: בחר אמפיצילין, כלורמפניקול לחיידקים המכילים וקטורים הן pET15b והן pLysS, בהתאמה.
   3. למקם את הצלחת מרוחים במהופך בתוך אינקובטור ב 37 º C. לאפשר מושבות חיידקים לגדול בין לילה.
      הערה: לא דגירה הלוחות יותר מ 16 h כפי אמפיצילין תגרע והוא המושבות שאין עליו אמפיצילין ההתנגדות יכול ליצור.
2. יום 2: הכנה של המדיה והתרבות ביטוי starter
   1. הסר את התרבות החיידק החממה. מצלמות-מיקרוסקופים הצלחת וחנות לתקופה מקסימלית של 4 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.
   2. להכין בקבוקון תרבות המתנע (250 מ"ל), הביטוי תרבות מבחנות (12 x 1 L) אוטוקלב. עבור 1 ליטר של אמצעי ביטוי, להוסיף 1 ליטר של מים הנדסה גנטית בבקבוקון תרבות במבוכה 2 L g 47.6 מרק נהדר ו- 4 מ"ל של גליצרול, קאפ ברדיד אלומיניום.
      הערה: התשואות טיפוסי הם 60-100 mg/L חלבון אמצעי ביטוי.
   3. לטעון המתנע בלוק לתוך החממה חזק מראש ומחוממת, של 37 ° C, דגירה בלי עצבנות.
   4. להוסיף µL 250 סטרילי-מסוננים (מסנן מיקרומטר 0.22) אמפיצילין מניות (100 מ"ג/מ"ל מים הנדסה גנטית) תרבות starter של ריכוז סופי של 100 µg/mL. מיד מתחילים לזעזע את התרבות starter-250 סל"ד.
      הערה: כלורמפניקול משמש רק עבור המושבה הבחירה על פלטות אגר, איננה כלולה במחיר בעבור תרבויות נוזלי.
   5. לחסן את התרבות starter על-ידי הוספת לשכנו פלסמיד המכיל e. coli שמושבה בודדת מהצלחת מרוחים ולאפשר את התרבות starter לרעוד ב 37 ° C עבור 16 h.
   6. למקם את המדיה תרבות ביטוי מבחנות לתוך מראש להתחמם, 37 ° C רועד חממות, דגירה בין לילה בלי עצבנות כך המבחנות מוכנים לחסן למחרת בבוקר.
3. יום 3: גרימת ביטוי חלבון ב e. coli
   1. להפוך את המניות אמפיצילין טריים, סטרילי-מסוננים (100 מ"ג/מ"ל מים הנדסה גנטית). להוסיף 1 מ"ל של מניות אמפיצילין את הבקבוק כל אמצעי הביטוי עבור ריכוז סופי של 100 µg/mL.
   2. מתחילים לזעזע התקשורת ביטוי ב 250 סל"ד.
   3. לקחת דגימה 2 מ"ל של אמצעי התקשורת מן הבקבוק כל ביטוי ולהוסיף cuvette ריקים צפיפות אופטית קורא 600 nm (OD₆₀₀).
   4. לאחר השלמת 16 h starter תרבות דגירה, לחסן את הבקבוק. ביטוי לכל על ידי העברת 20 מ"ל של התרבות starter בכל הבקבוק ביטוי באמצעות פיפטה סרולוגית.
   5. לאחר השלמת 1 h עצבנות, למדוד את יתר₆₀₀ באחת המבחנות הביטוי. לאחר שלב זה, למדוד את יתר₆₀₀ כל 20 דקות, בודקים בקבוקון שונה בכל פעם.
   6. בבית יתר₆₀₀ של 0.6, להפחית את הטמפרטורה של כלי המכיל המבחנות ביטוי ל 32 מעלות צלזיוס.
   7. בדוק את יתר₆₀₀ כל 10 דקות. בבית יתר₆₀₀ של 0.8, זירוז הביטוי על-ידי הוספת 1 מ"ל של 1 מ', סטרילי-מסוננים β-איזופרופיל thiogalactoside (IPTG) במים הנדסה גנטית כדי הבקבוק כל ביטוי.
   8. לאפשר את e. coli ב ביטוי מבחנות לבטא במשך 7 שעות.
   9. 20 דקות לפני הסוף של הביטוי, מראש מגניב צנטריפוגה רצפות גדולים עד 4 ° C.
   10. לאסוף את כל 12 L של הביטוי מדיה לתוך צנטריפוגה בודדים מכולות ואיזון.
   11. Centrifuge התקשורת ביטוי-> g 12,000 x למשך 15 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגה קומה.
   12. יוצקים את תגובת שיקוע של כל מיכל צנטריפוגה. בעזרת מרית, לאסוף את כדורי תא לתוך שקית נעילת מיקוד שנשקל מראש.
   13. מחדש להשעות את צניפה במאגר סטרילי-מסוננים עשר (100 מ של מאגר לכל 25 גר' גלולה), להסיר את כל הבועות אוויר עודף על ידי עיסוי בגדר. עבור 1 ליטר של מאגר עשר, להוסיף 5.8 גר' נתרן כלורי, 1.21 g של טריס הבסיס ו- 0.37 גרם ethylenediamine tetraacetic חומצה (EDTA) ניתרן מלח וגופרית והרכבו 900 מ ל מים הנדסה גנטית. להתאים את ה-pH ל 8.0 ולהביא 1 ל' בשלב זה, חומציות מספיקים.
   14. מניחים את השקית נעל-zip המכיל בגדר תא מושעה מחדש לתוך מכולה משני ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. יום 4-6: פקיעת הקיר תא החיידק באמצעות הפשרת ההקפאה מחזורים
   1. להסיר בגדר קפוא מהמקפיא, לאפשר לו להפשיר באיטיות ב 4 ° C עם עצבנות עדין משתמש של תפקודי לב / נשימה.
   2. לאפשר בגדר להפשיר עד כמה נוזל קיים. להוסיף ~ 30-40 מ ג של deoxyribonuclease (DNase) כדי יודע lysate. בנוסף, להוסיף 1 מ"ל של 100 מ מ phenylmethylsulphonyl פלואוריד (PMSF; מעכב פרוטאז) אלכוהול איזופרופיל לכל 100 מ של תא lysate. אפשר את lysate לנער בן לילה.
      הערה: הוספת DNase ו PMSF נחוץ רק עבור מחזור הפשרת ההקפאה הראשונה.
      התראה: PMSF הוא רעיל אם נשאף. מסיכת פנים אמור לשמש בעת טיפול אבקת PMSF.
   3. ברגע lysate התא מופשר הוא לחלוטין, להקפיא את lysate ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד קפוא לגמרי.
   4. חזור על הליך ההקפאה-הפשרה בסך הכל בשלושה מחזורים. להשאיר את lysate הקרת ב 4 ° C לאחר ההפשרה אחרונה ההקפאה. חנות µL 100 של raw lysate לניתוח נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) בסיומו של טיהור.
   5. לאחר ההפשרה האחרון, להתאים את רמת החומציות של המופשרים lysate כדי 9.0 באמצעות 1 M NaOH. בשלב זה, חומציות מספיקים. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה (בן לילה הוא המתאים) על תפקודי לב / נשימה.
5. יום 7-9: לשכנו טיהור באמצעות אופניים תרמי ספין קרים וחמים
   1. מגניב לצנטריפוגה קומה 4 מעלות 20 דקות לפני צנטריפוגה.
   2. Aliquot ואיזון המופשרים lysate לתוך צנטריפוגה מיכלים.
   3. Centrifuge את הדגימות-> g 15,000 x עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. חנות µL 100 של תגובת שיקוע לניתוח מרחביות-דף לאחר השלמתו של טיהור.
      הערה: לאחר, צריך שתוציאו החלבון לשכנו יישאר בבית תגובת שיקוע עקב מסיסות גבוהה שלה במים בטמפרטורה שמתחת LCST שלה (< 32 ° C).
   4. להעביר את תגובת שיקוע מכולות צנטריפוגה חדש ולאזן כראוי.
   5. להוסיף נתרן כלורי (NaCl) בשלושה חלקים ריכוז סופי של 1 מ' (5.84 g של NaCl עבור כל 100 מ של תגובת שיקוע). לוודא NaCl מתווספת בשלושה חלקים כדי לאפשר פירוק מספיקות.
   6. להתסיס עבור h 3 ב 37 ° C-250 סל"ד ב חממה חזק.
   7. h 1 לפני סוף עצבנות, לחמם צנטריפוגה קומה עד 37 מעלות צלזיוס.
   8. צנטריפוגה > g 15,000 x עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. חנות µL 100 של תגובת שיקוע לניתוח מרחביות-דף לאחר השלמתו של טיהור וזורקים את תגובת שיקוע הנותרים.
      הערה: לאחר, צריך שתוציאו החלבון בילדיו צריך להיות מגורען עקב שלה מסיסות נמוכה במים בטמפרטורות מעל LCST שלה (> 32 ° C).
   9. מחדש להשעות את צניפה על-ידי הוספת 10 מ"ל מים בלוק, הנדסה גנטית לאדם 1g של גלולה. להשתמש במרית מתכת מועכים בגדר כדי לסייע פירוק החלבון.
   10. התאם את רמת החומציות של המופשרים lysate כדי 9.0 באמצעות 1 M NaOH. בשלב זה, חומציות מספיקים.
   11. להתסיס בן לילה-4 מעלות צלזיוס על תפקודי לב / נשימה.
   12. חזור על הפעולות אופניים תרמי ספין קרים וחמים עבור סכום של שלושה מחזורי (כלומר., חזור על שלבים 1.5.1 דרך 1.5.11 שלושה מחזורים סה כ).
6. יום 10-15: לשכנו דיאליזה, lyophilization
   1. Centrifuge בגדר תנאי מחדש ומפרידה טרום מקורר-> g 15,000 x עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. חנות µL 100 של תגובת שיקוע לניתוח מרחביות-דף לאחר השלמתו של טיהור.
   2. Desalt הפתרון חלבונים על-ידי dialyzing את תגובת שיקוע הנותרים קרום דיאליזה 3.5 kDa נגד 4 ליטרים של מים הנדסה גנטית טרום מקורר-4 מעלות צלזיוס. להחליף את המים דיאליזה פעמיים ביום עבור סכום כולל של 6 פעמים מעל 3 ימים.
      הערה: כרכים supernatant טיפוסי הם בין 5 ל 30 מ"ל.
   3. Centrifuge הפתרון dialyzed ומפרידה טרום מקורר-> g 15,000 x עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. חנות µL 100 של תגובת שיקוע לניתוח מרחביות-דף בסוף הטיהור.
   4. להקפיא וכתוצאה מכך supernatant ב-80 מעלות צלזיוס צינורות חרוט שנשקל מראש.
   5. Lyophilize הפתרון קפוא במשך 3 ימים והמסה המוצר הסופי כדי לקבוע את התשואה חלבון.
   6. מצלמות-מיקרוסקופים הצינורות המכילים הסופי lyophilized החנות והמוצרים לשכנו ב 4 º C.
   7. לפעול למען חברה דמוקרטית-דף כדי לקבוע את הטוהר של החלבון.
      הערה: פרוטוקולים עבור מרחביות-דף ישתנו בהתבסס על תנאים ג'ל agarose ספציפיים. לניסויים שלנו, חלבון lyophilized הסופי היה התפרקה על ריכוז של 0.5 מ"ג/מ"ל מים יונים, לרוץ במהירות 140 V 70-100 דקות בג'ל אקרילאמיד 12% (w/v) תחת תנאים denaturing.

2. התא כימוס ב- 3D אלסטין, כמו חלבון Hydrogels

1. הכנת תבניות סיליקון
   1. השתמש אגרוף ביופסיה לקוטר הרצוי כדי ליצור חורים בסדין סיליקון בעובי 0.5 מ מ, לגזור ריבוע סביב כל חור. חזור עבור מספר תבניות הרצוי.
      הערה: קוטר ועובי של התבניות יכול להיות מותאם כדי להפוך את יישום מסוים התנאים התרבות תאים. בפועל, עבור תרביות תאים של 50 10⁶ תאים למ"ל, תבניות בעובי 0.5 מ מ עם 4 מ"מ ו 5 מ מ קטרים מומלצים עבור ה-DNA/RNA מספיק והפקת חלבונים, בהתאמה. עבור immunostaining, אגרוף ביופסיה 2 מ מ יכול לשמש במקום ליצור שלושה חורים סמוך לכל עובש מרובע כך משכפל שלוש יכול להיות צבעונית לכל טוב.
   2. הסר ניילון נצמד בכל צד של העובש בודדים עם פינצטה.
      הערה: יש להימנע ממגע עם משטח סיליקון חשוף כמו זיהום יכול להפחית בעתיד פלזמה מליטה יעילות.
   3. באמצעות פינצטה, סדר את אותו מספר של תבניות סיליקון חשופות, coverslips זכוכית דקה (מס ' 1, בקוטר 12 מ מ) לסירוגין שורות על המכסה הפוך של צלחת 48-. טוב. עם סיום, לכסות את המכסה של לוח 48-טוב כדי למנוע זיהום.
   4. חמצן פלזמה מתייחסים המכסה כל צלחת 48-טוב (כלומר., בתבניות ושקופיות זכוכית). מיד לאחר מכן, השתמש מלקחיים להיפוך כייר סיליקון על גבי coverslip זכוכית סמוכים. לחץ בחוזקה על העובש כדי להבטיח מליטה. תן התבניות דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
      הערה: משך הטיפול פלזמה חמצן משתנה בהתאם לכלי המשמש. תנאים אופייני לכלי שלנו הם חלון הפעלה של לחץ גז בין 0.3-4 mbar, זרימת גז חמצן-20 ס מ³/min, וחשיפה מדגם פלזמה עבור s 10-20.
   5. לעקר את התבניות על-ידי autoclaving. לאחסן התבניות בטמפרטורת החדר בסביבה סטרילית עד השימוש.
      הערה: התבניות שבהן ניתן לאחסן בשלב זה ללא הגבלת זמן.
2. הכנה של פתרון מניות אלסטין, כמו חלבון
   1. הסר בילדיו lyophilized אחסון 4 ° C. חם החלבון לטמפרטורת החדר לפני פתיחת צינור כדי להבטיח עיבוי לא בונה על החלבון על פני שימוש חוזר.
   2. להמיס בילדיו באגירה פוספט תמיסת מלח של Dulbecco (DPBS) ב 4 ° C עם עצבנות מתמדת (כלומר., המסתובבים) בין לילה.
      הערה: ריכוז פתרון מניות לשכנו עוד יותר לדלל אותו עם התוספת של פתרון crosslinker יחס נפח על-ידי המשתמש. לדוגמה, עבור 3% (w/v) הסופי ריכוז לשכנו, להכין 3.75% (w/v) לשכנו מניות פתרון זה להיות מדולל ביחס 4:1 הנפחי של אמרסון, לייק ופאלמר פתרון: crosslinker פתרון. התאם את הריכוז ככל הדרוש עבור היישום הרצוי.
   3. מסנן סטרילי לשכנו הפתרון מניות באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. לאחסן לשכנו על הקרח כאשר אינו בשימוש.
3. ב אבטחה הקבינט, להעביר את התבניות סטרילי באמצעות פינצטה סטרילי אל צלחת 24-ובכן רקמות-תרבות.
4. הכנה של פתרון מניות THPC
   1. לדלל THPC, DPBS מוקדמת פשוט לשימוש. התאם את ריכוז THPC פתרון על פי ריכוז לשכנו הסופי הרצוי crosslinking יחס.
      הערה: עבור הפרוטוקול, ריכוז לשכנו הסופי של 3% (w/v) ייעשה על ידי ערבוב הפתרון מניות לשכנו עם הפתרון THPC ביחס נפח של 4:1. להתאים לפי הצורך.
   2. להוסיף µL 2.6 בפתרון THPC (80% במים) µL 997.4 של DPBS.
      הערה: בריכוז זה של THPC מקביל יחס 1:1 stoichiometric של קבוצות מתיל הידרוקסי THPC ו אמינים העיקרי על חלבון לשכנו בעת ערבוב פתרונות-היחס הנפחי 4:1 שתואר עבור הידרוג לשכנו הסופי 3% (w/v). הפתרון THPC צמיגה, טיפות של פתרון עשוי להישאר בצד של קצה פיפטה. עבור ריכוזים מדויק, להימנע טיפות כאלה כאשר דילול לתוך DPBS. ניקוי המכולה מניות THPC עם גז חנקן למניעת חמצון של פוספין איון של crosslinker.
   3. מערבולת הפתרון לערבב ולשמור על קרח.
   4. מסנן סטרילי THPC במניה הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. לדלל את THPC מניות פתרון נוסף עם DPBS סטרילי כדי להשיג יחס stoichiometric crosslinking התחתון (למשל-, 0.5:1 או 0.75:1).
      הערה: THPC הוא רגיש חמצן, הפתרון מדולל אמור לשמש בתוך מספר שעות לאחר ההכנה.
5. מביצועם התאים על ידי דגירה עם טריפסין-EDTA להשעיה תא בודד, גלולה התאים, ולספור את התאים מחדש מושעה בינוני באמצעות hemocytometer.
   הערה: פרוטוקולים המדויק עבור שלב זה יהיה תלוי בכבדות סוג התא הרצוי ויישום. עבור התאים העצביים קדמון בשימוש בכל רחבי פרוטוקול זה, נערך דגירה טריפסין-EDTA 0.025% בטמפרטורת החדר למשך דקות 1.5. התאים היו מגורען ב g x 200 למשך 2 דקות. עבור תאים מוגברת הכדאיות, תאים המחבוש בתנאים נורמליים בינוני. צפיפויות תא אופייני המשמש תא כימוס נע בין 1-50 10⁶ תאים למ"ל נפח הידרוג הסופי. להתאים לפי הצורך.
6. Aliquot מספר תאים לתוך שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 סטרילי הרצוי.
7. Centrifuge התאים ב- g x ~ 200 עבור 3 מינימלית בקפידה, וארוקן את תגובת שיקוע ולשמור בגדר תא על קרח.
   הערה: חיוני לרוקן לחלוטין את כל תגובת שיקוע כדי להמתיק דילול נוסף אמרסון, לייק ופאלמר, THPC crosslinker. מהירות צנטריפוגה ספציפית משתנה עם סוג התא.
8. להשעות מחדש בגדר תא בפתרון מניות לשכנו, כך שאמצעי האחסון 80% נפח סופי (בהנחה יחס של 4:1 של אמרסון, לייק ופאלמר פתרון: THPC פתרון). פיפטה מיקס 20 - 25 פעמים כדי ליצור תערובת הומוגנית של תאים אמרסון, לייק ופאלמר.
   הערה: להימנע כשתפסת התחתון של צינור כדי להמתיק בטמפרטורה של מעבר פאזה עוקבות של אמרסון, לייק ופאלמר. כל עובש 2 מ מ עם משכפל שלוש דורש µL 7.5 נפח סופי (כלומר., 6 µL של אמרסון, לייק ופאלמר פתרון מניות ו- 1.5 µL של פתרון מניות THPC) מחולק באופן שווה לתוך החורים 3 (כלומר., 2.5 µL נפח סופי לכל חור). עבור התבניות 4 ו- 5 מ"מ, נפח סופי של 7.5 µL ו- 15.5 µL נדרש, בהתאמה.
9. להוסיף פתרון מניות THPC התליה תא/לשכנו עבור אמצעי האחסון האחרון 20% הנותרים. פיפטה מיקס 20 - 25 פעמים כדי ליצור תערובת הומוגנית.
10. מיד pipette את אמצעי האחסון הסופית המתאימה של תערובת תא/בילדיו/THPC לתוך כל עובש על ידי תנועה מעגלית. חזור על כל תבניות.
11. דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ואחריו דגירה נוספים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    הערה: תקופת הדגירה הראשון תסייע להקל crosslinking הראשונית של הידרוג לפני הגדלת הטמפרטורה לזו מעל LCST של ELP וגרימת סגרגציה השלב התרמי שלו.
12. לאט לאט להוסיף µL 750 תא חם תרבות בינוני מכל קידוח של צלחת 24-ובכן, הימנעות לשבש את ג'ל.
13. דגירה של hydrogels ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים.
    הערה: מלא בינוני שינויים מומלצים בכל 1-2 ימים בהתאם לסוג התא. כדי להגביל את הלחץ על הג'ל, השתמש בכוס פסטר פיפטה מודבקת עם טיפ פיפטה µL 200 כאשר כ רפה בעברית בינוני מן הבאר.

3. Immunocytochemistry של תאים ב- 3D בילדיו Hydrogels

1. הכן את הפתרון קיבעון על ידי ערבוב 10 מ ל 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA) 30 של mL DPBS. לחמם את הפתרון 37 מעלות צלזיוס.
2. האחות המדיום מהצלחת 24-ובכן, לשטוף בעדינות עם 1 מ"ל של DPBS.
3. להוסיף µL 750 של הפתרון קיבוע מכל קידוח, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אל תשתמש החממה תרביות רקמה כדי למנוע זיהום של תרבויות אחרות עם אדי מחברים.
4. בזהירות תשאף הפתרון קיבוע מכל קידוח, השמטת את מחברים לגורם המכיל פסולת מסוכנת המתאים.
   התראה: חשיפה PFA יכול לגרום לגירוי העור, העיניים. כפפות/בטיחות משקפיים ולעבוד בשכונה fume כימי.
5. להוסיף 1 מ"ל של DPBS כל דגימה. מיד וארוקן את DPBS וזורקים לתוך פח אשפה מחברים.
6. לשטוף את הדגימות פעמיים עם 1 מ"ל של DPBS 10 דקות כל אחד.
   הערה: הדוגמאות שניתן לאחסן ב DPBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע לאחר שחתמת את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים.
7. Permeabilize כל דגימה עם 750 µL של פתרון permeabilization (100 מ של DPBS ו 0.25 mL של טריטון X-100; PBST) לשעה בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה-15 סל ד.
8. מחוק לגמרי את PBST ומוסיפים µL 750 של חסימת פתרון (95 מ"ל ל- PBS, 5 g של אלבומין שור (BSA), 5 מ של סרום ו- 0.5 מ של טריטון X-100) על כל דגימה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות על כיסא נדנדה-15 סל ד.
   הערה: הפתרון חסימה צריך להכיל סרום מן המינים מארח בו גידלו את הנוגדנים משני (למשל., עז, חמור) וסינון סטרילי-מסוננים דרך 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
9. להכין את הפתרון דילול נוגדנים (97 מ של DPBS, 2.5 g של BSA, 2.5 מ של נסיוב (מתוך מאותו המין המארח כמו שלב 3.8) ו- 0.5 מ של טריטון X-100). לדלל נוגדן ראשוני באמצעות הפתרון דילול נוגדן ולהוסיף 500 µL של הפתרון כל דגימה. לאטום את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים, דגירה בין לילה-4 מעלות צלזיוס על כיסא נדנדה.
   הערה: Nestin נוגדנים ראשי Sox2 היו 1:400 מדולל בפתרון דילול נוגדן של התרכזות מקוריים היצרנים.
10. תשאף הפתרון נוגדן של כל מדגם ולשטוף את הדגימות עם PBST עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה-סל ד 15. חזור על השלב שטיפת 3 פעמים.
11. לדלל משני הנוגדנים ו- 5 מ"ג/מ"ל המניה דאפי (1:2, 000) באמצעות הפתרון דילול נוגדן ולהוסיף 500 µL של הפתרון כל דגימה. מכסה את הצלחת 24-היטב ברדיד אלומיניום, דגירה בין לילה-4 מעלות צלזיוס על כיסא נדנדה.
    הערה: כמו נוגדנים משניים הם רגיש אור, הדגימות חייבת להיות מוגנת מ photobleaching עבור כל השלבים הבאים. עז עז של עכבר אנטי אנטי-ארנב משני נוגדנים היו שבערך מדולל בפתרון דילול נוגדן של התרכזות מקוריים היצרנים.
12. תשאף הפתרון נוגדן של כל מדגם ולשטוף את הדגימות עם PBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על הנדנדה. חזור על השלב שטיפת 3 פעמים.
13. הצב טיפת hard-set הרכבה בינונית על גבי המשטח של שקופית מזכוכית. באמצעות מלקחיים, להסיר עודפי פתרון העובש מאת בקלילות סופג את הקצה של העובש על מגבת נייר. בזהירות המקום כייר במהופך על המדיום הרכבה ולהימנע היכרות עם בועות.
14. לאפשר המדיום הרכבה להקשיח במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר. לאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר או 4 ° C. לאפשר המדיום הרכבה להגדיר באופן מלא במשך 48 שעות לפני הדימות כפי מקדם שבירה של המדיום ישתנה במהלך התקשות. חותם את הדגימות אל השקופית כיסוי זכוכית עם לק ברור להפחתת זיהום או דגימת תנועה.
15. תמונה הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

ELPs בשימוש פרוטוקול זה המורכב מעובדים חמישה אזורים: תג T7 His6 תג, אתר פצילות enterokinase (EK), אזור ביו-אקטיביות, אזור כמו אלסטין (איור 1). T7 ותגי His6 מאפשרים זיהוי קל באמצעות טכניקות תספיג סטנדרטי. מבוא של אתר המחשוף EK מאפשר הסרת אנזימטי של האזור תג, במידת הצורך. האזור ביו-אקטיבי מקודד עבור המורחבת, נגזר fibronectin תא דבק ('RGDS') או רצפים ('RDGS') ללא דבק. לבסוף, חזור המרכזי של האזור, כמו אלסטין מכיל קבוצת ליזין באתר שאריות חוות המאפשרת crosslinking ויה THPC בעוד חוזר איגוף להכיל איזולאוצין כדי להשיג את LCST של ~ 32 ° C³¹.

הביטוי פוסט, למען חברה דמוקרטית-דף או תספיג ניתן להמחיש את המשקל המולקולרי, לאשר את זהותו של ELPs המכילים תגי נוגדן, כגון T7 (MASMTGGQQMG) או His6 (HHHHHH) (איור 2). ביטוי מוצלח תחת תנאים מבוקרים מניב מוצר מאוד הומוגנית מיוצג על ידי הנוכחות של להקה כהה יחיד במשקל מולקולרי משוער (~ 37 kDa) של חלבונים אלה באמצעות שני מרחביות-דף (איור 2 א), ווסטרן כתם ( איור 2B).

בתנאים בלתי מבוקרת, הנוכחות של רצועות נמוך משקל מולקולרי תספיג מרמז כי חלק השבר של החלבונים לא תורגם לחלוטין או היו מושפל אחרי הביטוי (איור 2C). באופן ספציפי, ההמונים כאן רווח אחיד על ידי kDa ~ 9 בערך המתאים המשקל של ביו-אקטיבי באזור ואחד אלסטין כמו שלושה אזורים ('חזרה'), או כ הרביעי של החלבון היעד. אלה שברים קטנים יותר של חלבון הם בדרך כלל מציגים את הביטוי מתבצע בטמפרטורה גבוהה (> 32 ° C) כמו דמות 2C. נוכחותם של חלבונים אלה משקל מולקולרי נמוך יכול להוביל תכונות מכניות בלתי צפויות. לפיכך, הקרנה רגיל ביטוי פוסט מומלץ להבטיח תוצר סופי איכותי.

ניתן לשנות את הנוקשות מכני של hydrogels מבוססי לשכנו בכך ששינה את הריכוז של אמרסון, לייק ופאלמר או היחס בין THPC קבוצות תגובתי: לשכנו העיקרי אמינים. במקביל, הריכוז של התא-דבק ליגנדים ניתן לכוונן על-ידי שינוי היחס של אמרסון, לייק ופאלמר משתנים עם התא-הדבק (RGDS) אותו ללא דבק רצפים (RDGS) בתוך כל משטר נוקשות. על-ידי מניפולציה שני משתנים אלו, נוכל לייצר ג'לים בעלי קשת של תכונות מכניות וריכוזי ליגנד (איור 3).

כדי לכמס תאים בתוך hydrogels בילדיו תלת-ממד, מספר התאים הרצוי מושעה במדיום, centrifuged לייצר גלולה תא (איור 4A). המדיום הוא aspirated ברכבת התחתית, התאים הם תלויים מחדש בצורה אחידה הפתרון בילדיו של הריכוז הרצויה. בשלב הבא, THPC פתרון נוסף התליה תא/לשכנו, pipetted ביסודיות כדי ליצור תערובת הומוגנית. פתרון זה הועבר בתבניות סיליקון סטרילי בתוך צלחת 24-ובכן באמצעות פיפטה במהירות, מותר crosslink בטמפרטורת החדר ו 37 º C למשך 15 דקות כל אחד (איור 4B). לבסוף המדיום הוא הוסיף לצלחת היטב, מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס לניסוי.

צביעת חי/מת יכול לשמש להערכת הכדאיות התא, התא מוצלחת אנקפסולציה בתוך אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels. כמופיע באיור5, למבוגרים מאתר עצבית ובתאים (NPCs) מראים הכדאיות תא גבוה מעל 7 ימים בתוך הידרוג בילדיו 3% (w/v).

3D בילדיו hydrogels הוכחו בעבר כדי לתמוך NPC גזע תחזוקה נמדדת דרך הביטוי של סמני חלבונים NPC קנונית זו מדיניות (מיני קביעת אזור Y)-תיבת 2 (Sox2) ו- nestin⁹. NPCs אנקפסולציה ב- 3% (w/v) בילדיו hydrogels נמוך THPC crosslinking הצג גבוה בביטוי של Sox2 גרעיני מותאם לשפות אחרות, cytoplasmic חוטים nestin ויה immunostaining ודימות קונאפוקלית (איור 6).

איור 1 : ייצוג סכמטי של אמרסון, לייק ופאלמר, רצפי חומצות אמינו המתאימה. אמרסון, לייק ופאלמר השתמשו במחקר זה מכיל תג T7 ו His6 הדמיה נוגדן מבוסס, אזור ביואקטיביות היכרות ראשונית של תחומים תא-דבק של אזור אלסטין דמוי מקנה תכונות מכניות אלסטית ומאפשרת עבור crosslinking כימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : ביטוי חלבון המטרה הניתנים לאימות עם מרחביות-דף תספיג כדי לאשר את משקל מולקולרי והזהות של המוצר הסופי, lyophilized. ELP באורך מלא טהור עובר במשקל מולקולרי של 37 kDa כפי שדווח על ידי עמודים מרחביות (א) והן באמצעות T7 (MASMTGGQQMG) או היסטידין תספיג 6 תג (HHHHHH) (ב). (C). אצוות טהורות של אמרסון, לייק ופאלמר בשל הסטיות בפרוטוקול ביטוי לשכנו יכול להוביל הביטוי של ELPs עם משקולות מולקולרי נמוך יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: RGDS ליגנד תוכן ניתן לכוונן באופן עצמאי של תכונות מכניות בתוך אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels. 5% (w/v) ו- 3% (w/v) בילדיו hydrogels יש הטיה מודולים של ~ 800 ~ 400 ואבא הרשות הפלסטינית, בהתאמה. Hydrogels עם יחס 1:1 של THPC קבוצות תגובתי: לשכנו אמינים העיקרי היו תפור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, מחומם ל 37 ° C, ולא כדי equilibrate במשך 5 דקות לפני המדידה. הנתונים הם זאת אומרת ± ש, *p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: סכמטי תא הסגירות של אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels. (א). תאים הם בתחילה הפומבית להשעיה תא בודד בינוני, מגורען באמצעות צנטריפוגה. המדיום הוא aspirated ברכבת התחתית, ואת התאים הם מחדש מושעה בפתרון לשכנו-הריכוז הרצוי מעורבב היטב. בסופו של דבר, הפתרון crosslinking THPC הוסיף, לערבב היטב. (B)- מיד לאחר התוספת של THPC, הפתרון הוא יצוק לתוך תבנית סיליקון עם פיפטה. הפתרון מותר crosslink בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ולאחריו דגירה 15 דקות השני ב 37 º C. המדיום ואז מוסיפים התרבות היטב עבור משך הזמן של הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: עצבית ובתאים לשמור על הכדאיות גבוהה ב ELP hydrogels. תמונת הנציגה של ובתאים עצבית אנקפסולציה ב- 3% (w/v) בילדיו hydrogels עם 1:1 crosslinking (THPC קבוצות תגובתי: לשכנו העיקרי אמינים) לאחר 7 ימים בתרבות. ירוק: לחיות מכתימים (calcein-AM); אדום: המלח מכתים (אתידיום homodimer). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.

איור 6 : Hydrogels בילדיו תלת-ממד תומך קדמון עצבית תא גזע maker ביטוי. תמונה immunofluorescence של תאים עצביים קדמון לבטא Sox2 ו nestin חלבונים לאחר 7 ימים תרבות בילדיו hydrogels. תמונות להראות תאים במארז 3% (w/v) ג'לים לשכנו עם 0.5:1 crosslinking (THPC קבוצות תגובתי: לשכנו העיקרי אמינים). כחול: דאפי (גרעינים); אדום: Sox2; ירוק: nestin. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ביטוי חלבון רקומביננטי טיהור הוא כלי רב עוצמה כדי לסנתז biomaterials עם הפארמצבטית גבוהה. בעיקר בשל כניסתו של שיבוט מולקולרי ממוסחר, פלסמידים רקומביננטי מותאם אישית ניתן לרכוש מהספקים מספר, אשר מפחית באופן משמעותי את הזמן כדי לעבוד עם חומרים כמו ELPs. באופן דומה, ניתן לבקש פלסמידים ישירות מן המעבדה שמקורם כאשר העבודה המקורית נתמכה על ידי חוזה הפדרלי, העבודה העתידית תהיה לשימוש ללא כוונת רווח. הרצף המלא של חומצת אמינו לשכנו שפורסם בעבר עבור לשכנו מספר גרסאות³¹. עם זאת, הביטוי לתהליך טיהור בסופו של דבר של חומרים כוללת מספר צעדים קריטיים זה יכול להוביל בדרך כלל התשואות מופחתת או מוצר באיכות נמוכה יותר. בחלק מן הנושאים הנפוצים ביותר להכנה לשכנו עולות באחת מהאפשרויות הבאות: (1) איכות של מניות חיידקי מאוחסנות, הקפאת שיפשיר (2) מחזור לשבש את קרום החיידק, וטיהור חלבונים (3) באמצעות רכיבה על אופניים תרמי.

ההבדל גדול בין חלבון ביטוי באמצעים הלא-ביולוגיים אחרים של ייצור חומרים היא כי אנו נמצאים מינוף המנגנונים הביולוגיים של המארחים רקומביננטי לסנתז את פולימרים. לאחר מכן, טכניקה זו מגיעה עם מגבלה ייחודי: מוות תאי או נזק. מוות של תאים בדרך כלל בא לידי ביטוי כמו מספר מופחת של מושבות חיידקים אחרי שהתרוצץ צלחת או מושבות בד כ קטנות יחסית לאט לגדול. מניות חיידקי, אם נשמר בקפידה, יכול להישאר יציב במשך שנים; עם זאת, מחזורים ההקפאה רצופים-הפשרה עקב כשל חוזר ונשנה של שימוש או במקפיא ניתן להקטין את הכדאיות תא או לגרום נזק לדנ א. מניות טיפוסי של חיידקים BL21 השתמש בין 10% ל- 40% גליצרול לפי נפח מעורבב עם תאים על תנאי. המטרה של גליצרול היא לצמצם נזק הממברנה של nucleating גבישי קרח במהלך לקפוא. לכן, באמצעות ריכוזים נמוכים (< 10%) יכול להוביל קרום פרוץ, תוך ריכוז גבוה (> 40%) יכול לדכא את נקודת הקיפאון מספיק כדי איפה המניה לא קופא המוביל מוות של תאים. עם זאת, אפילו בתוך רמות גליצרול אופטימלית, מניות חיידקי לא יורשו באופן מלא הפשרה כמו שילוב של נזק הממברנה מתופעות ציטוטוקסיות, הקפאה מחדש של גליצרול יכול להוביל מופחתת הכדאיות מניות, נזק לדנ א. לכן, אם הוא ציין כי מלאי חיידקים תוצאות ספירת המושבה נמוך או כי התאים מחלקים בקצב איטי באופן עקבי (הנראית כמו קצב איטי של הרמפה₆₀₀ OD במהלך ביטוי), מחדש שינוי צורה של פלסמיד וביצוע מניה חדשה היא פשוטה הגישה הראשונה כדי לפתור את הבעיה. עם זאת, כדי להבטיח האחזקה לטווח ארוך של מניות חיידקי והתקינות של ה-DNA, עדיף לאחסן את העתקי פלסמיד שלך כמו DNA מטוהרים קפוא במים, לא בתוך התאים. אחסון ה-DNA בדרך זו תבטיח כי באירועים לא צפויים כגון מניות שנכשלו או כשל מקפיא, מקור אמין של ה-DNA המקורי יכול לשמש טרנספורמציה.

צעד קריטי נוסף לשכנו פבריקציה נוספת היא הטיהור של החלבון היעד מהמחשב המארח הביטוי. חלבון חילוץ מ- e. coli מושגת על ידי שבירת קיר התא באמצעות nucleating גבישי קרח להיווצר בכל רחבי התא על תנאי lysate על הקפאה, אשר מורכב עוד יותר עם מחזורים ההקפאה רצופים-הפשרה. יכול להיות מנוצל על פקיעת קיר התא שיטות אלטרנטיביות כגון sonication או במכונת דפוס. בפרט, רצופים ההקפאה-הפשרתו של lysate יש יתרון כפי שהיא דורשת רק מקפיא, אין ציוד מיוחדים אחרים. עם זאת, הליך זה משחרר nonspecifically DNA, RNA, חלבון מזהמים, בנוסף פרוטאזות שיש להם הפוטנציאל כדי לבזות את חלבון המטרה. לכן, כדי למנוע זיהום, מופחתת התשואה, deoxyribonuclease (DNase) ואני phenylmethanesulfonyl פלואוריד (PMSF) מתווספים אל התא lysate כדי לבזות את ה-DNA ומעכבות פרוטאזות, בהתאמה. הנוכחות של ה-DNA לפני התוספת של DNase יכול להיות שנצפו חזותית כמו מראה 'נשי' ברחבי התא מחדש על תנאי lysate בעקבות שיפשיר. DNase ונמחקות באופן פעיל את הדנ א, ובכך מפחית את צמיגות של התא lysate ובכך להקל לטהר באמצעות צנטריפוגה. לשבור אופטימלית של דנ א יכול להיות אישרו מבחינה חזותית על-ידי הבטחת כי התא lysate שנראה נוזלי לגמרי, כי מראה נשי אינה גלויה. הבחנו בפועל כי התוספת של ~0.1 מ"ג DNase בכל תא mL lysate מספיקה להשיג את הדרוש השפלה. אולם, אם עדיין נצפית הנוכחות של ה-DNA, DNase יותר ניתן להוסיף שהופעלו על ידי 2-3 שעות נוספות של עצבנות. בעיה דומה יכול להיווצר גם אם DNase נוסף בטרם עת לפני כל אחד lysate יש לו את הפוטנציאל להפשיר במידה מספקת. במקרה זה, הטמפרטורות קר יכול להגביל את היעילות של ה-DNA השפלה עקב איון מוקדמת של DNase. כדי להימנע מבעיה זו, לעתים קרובות מומלץ לאפשר בגדר תנאי מחדש להפשיר במשך כ- 8 שעות לפני הטיפול עם DNase. בנוסף, אם חלבון נמוכה התשואות מדווחות, פירוט של ה-DNA כבר מספיק, התוספת של PMSF יותר כדי לסייע לצמצם עוד יותר את פוטנציאל חלבון השפלה של פרוטאזות ייתכן שתידרש.

שיקולים נוספים להבטחת ביטוי אופטימלית של ELPs כוללים הבנה זהיר של היתרונות והמגבלות של אנטיביוטי שבחרת. כאן, וקטורים pET15b המכיל גנים עמידות של אמפיצילין שימשו עבור ביטוי חלבון. מבחינה תפקודית, הסדרה וקטור מחמד לאפשר ביטוי חלבון משמעותית ככל 50% ביטוי חלבון של חיידק המוקדש את חלבון המטרה בעקבות^32,אינדוקציה המוצלח³³. עם זאת, אמפיצילין כמו אנטיביוטיקה הבחירה מגיע עם כמה מגבלות שעלולות לפגוע בביטוי האופטימלי. ראשית, השפלה של אמפיצילין בנוכחות החיידק יכול להתרחש במהירות עקב שחרורו של בטא לקטמאז. אם כמות מספקת של אמפיצילין יורד, פלסמיד קידוד אמפיצילין (כלומר פלסמיד קידוד ELP) עלול ללכת לאיבוד לגמרי. כתוצאה מכך, כאשר הבעת ELPs עבור משכי זמן ארוכים יותר, רמות הביטוי חלבון צריך בזהירות לפקח בנקודות זמן רצופים כדי להבטיח כמות מספקת של הגן קידוד לשכנו יישאר כדי לאפשר ביטוי רצוי. שיטות אפשריות לפתרון הצטברות של בטא-lactamases כוללים במורד התרבות starter השעיית מחדש את התאים במדיום נטול אנטיביוטיקה לפני מזריקים המדיום הביטוי. תהליך זה מגביל את ההעברה של אנזימים משפיל-אנטיביוטיקה יעיל ומבטיח חלק גדול יותר של התאים מכילים הווקטור היעד חלבון-קידוד. בנוסף, אמפיצילין יש חיי מדף מוגבלים כ- 2-3 שבועות. לכן, תרבות לוחות עבור ביטוי חלבון צריך להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר שבועיים לפני השימוש. לבסוף, כדי להבטיח את היעילות של אמפיצילין בתוך התקשורת starter וביטוי, הפתרון מניות אמפיצילין צריכים להיות טריים המיוצרים מיד לפני השימוש, כמו אחסון לטווח ארוך עשוי להוביל לאנטיביוטיקה פחות יעיל.

הנוכחות של LCST מאפשר ולטיהור פשוטה ELPs באמצעות רכיבה על אופניים תרמי. באופן ספציפי, בטמפרטורה גבוהה, בנוכחות מלחים, כוחות entropic לגרום ELPs להיות פחות מסיסים ויוצרים לאחר מכן פולימרי-עשיר coacervate שלב. מצד שני, בטמפרטורות נמוכות, ELPs נשארים מסיסים, בקלות להתמוסס אל תוך הפתרון. רכיבה על אופניים בין אלה משטרים טמפרטורה שני בשילוב עם שלבים צנטריפוגה כדי לאסוף ולמחוק את השלב המכיל לשכנו במרוכז מתרכזת החלבון והקטנת בו זמנית את קיומו של הלא-ELP מזהמים.

עם זאת, ישנם מספר שלבים שבו ניתן איבד ELPs בתהליך טיהור. ראשית, לפני כל ספין קר, הפתרון המכילים חלבון זה זמן ל- pH של 9.0. ה-pH גבוה יותר זה משמש deprotonate חומצות אמינו מסוימות על עמוד השדרה חלבון, ביעילות להשאיר אותם במצב טעון ושיפור נוסף, המסיסות שלהם. כתוצאה מכך, האמור לעיל שלב זה או לא לאפשר מספיק זמן פירוק חלבון יכול להוביל לירידה התשואה כמו חלבונים שאינם solubilized מגורען במהלך צנטריפוגה ומחק.

באופן דומה, חלבונים היעד יכול להיות אבוד במהלך ההליך ספין חם כאשר אמרסון, לייק ופאלמר הוא מגורען. בתחילה, NaCl נוסף את תגובת שיקוע עשירים בחלבון כדי להפחית את המסיסות אמרסון, לייק ופאלמר. המלחים לעבוד כדי למגן אלקטרוסטאטיות בין מולקולות חלבון ומים, גורם החלבון להפריד פאזה מימית. אפקט זה הוא מוגבר על ידי חימום הפתרון, אשר, עקב תופעות entropic, בהמשך מתקלקלת כדאי שאלך 'הכלוב' שמסביב ELPs וכוחות הצבירה של החלבונים. בריכוזים נמוכים של חלבון (כלומר., על מחזור תרמי הראשון), התוספת של מלחי לבד לעיתים קרובות אינה מספיקה לגרום ההפרדה בשלב הזה. עם זאת, כמו הריכוז של חלבון מגדילה (כלומר., לאחר מכן תרמית מחזורים), ישנם פחות מזהמים משני לקיים אינטראקציה עם המלחים, ELP לזרז בקלות רבה יותר. כתוצאה מכך, אם מלחים נוספים מהר מדי, הם עשויים פיזית נלכדת בעזרת חלבונים, אשר מפחית את ריכוז המלחים של הפתרון ביעילות מגביל משקעים חלבונים נוספים. לפיכך, יש להוסיף את המלח שלוש קבוצות קטנות כדי להבטיח שיש להם מספיק זמן כדי להפיץ למשל דרך הפתרון. בתור הערה סופית, וריאציות לשדרת לשכנו, גם דרך לקדם שינויים השאריות חוות של האזור כמו אלסטין או שינויים באזור ביו-אקטיבי יכול להשפיע באופן משמעותי את ההתנהגות LCST. כתוצאה מכך, כדי להבטיח תשואות חלבון אופטימלי על פני גרסאות חלבון, זה הכרחי כדי למטב את ה-pH, ריכוז המלחים וסוג מלח (למשל., monovalent או כלט) עבור הסחרחורות קרים וחמים.

פועל למען חברה דמוקרטית-דף עם סיום פרוטוקול, מומלץ כמו זה יכול לשמש בקלות לקבוע אם לאובדן משמעותי של אמרסון, לייק ופאלמר מתרחשת במהלך כל אחד מהשלבים טיהור. בקיצור, אם תגובת שיקוע בעקבות סיבוב חם זוהה לשכנו, ואז החלבון לא ביעילות שכספי. באופן דומה, אם ELPs מזוהים במדגם של solubilized צנפה בעקבות סיבוב קר, אז החלבון הוא לא להיות ביעילות מומס.

אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels מציעים יתרונות רבים על פני חומרים סינתטיים או נגזר באופן טבעי. באופן ספציפי, השימוש crosslinker אמין-תגובתי THPC מעניק נמוכים, פשוט tunable מנגנון של חלבון crosslinking. עם זאת, קיימות מגבלות שונות בתוך פרוטוקול crosslinking יש לציין. THPC חמצן רגיש, אם מאוחסנים בתנאים לא תקין, זה יכול להישחק במהירות התגובה יעילות. בנוסף, בשל התגובה שלה עם ראשי אמינים, THPC עשוי להגיב עם סביב חלבונים מדיה או אלה על פני תאים עשירים אמינים. לכן, כאשר ויוצרים בילדיו hydrogels, מומלץ להימנע מדיה בזיהום בגדר תא להפחית אשיג אפשרי חלבון אקסוגני, וכך ירידה crosslinking יעילות. לבסוף מנגנון crosslinking זה מונע את רצף ביו-אקטיבי באזור לאלה המכילים ללא שאריות ליזין, לפיכך, מגביל את פוטנציאל קליטת כמה מוטיבים תא-דבק (למשל., IKVAV³⁴). כדי לטפל מגבלות אלו, שינויים לשדרת לשכנו עם ו bicyclononyne (BCN) שותפים התגובה מאפשר crosslinking ביו-אנכיים, כמו שתואר לעיל²⁷.

יצוין, כי ההתנהגות בילדיו LCST ממלא תפקיד חשוב ב הכתבת הידרוג מיקרו. -טמפרטורה במשטרים מעל LCST ELPs לזרז מתוך פתרון שמוביל היווצרות של שלבים, עשירים בחלבון, חלבון לקויה יכולים להשפיע על מטריצה נקבוביות והיעילות crosslinking של מטריקס⁹. כי רוב תא תרבות מתבצעות בטמפרטורות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית (~ 37 ° C) מעל LCST אמרסון, לייק ופאלמר, יש לקחת בחשבון אפקטים אלה. Hydrogels crosslink ביעילות, טופס רשת חלבון מחוברים, אמין העיקרי של פי ליזין חייב להיות נגיש פיזית crosslinker THPC. אם הצבירה לשכנו מתרחשת לפני שהגיע crosslinking מספיק, ELPs לכוד בתוך השלב עשירים בחלבון עשוי להיות לא נגיש ובכך מסוגל להשתתף crosslinking. כדי לטפל מגבלה זו, הפרוטוקול שלנו דורש תקופת crosslinking הראשונית 15 דקות בטמפרטורת החדר, המאפשר crosslinking ראשוני של הידרוג לפני אמרסון, לייק ופאלמר עובר מעבר פאזה התרמי שלו. הדגירה בטמפרטורת החדר הזה ואחריו של דגירה נוספים 15 דקות ב 37 ° C כדי לסיים את הידרוג crosslinking. הליך זה הוא קריטי עבור crosslinking מספיקות ו gelation חזקות, לשחזור של החומר אמרסון, לייק ופאלמר.

לסיכום, hydrogels חלבון רקומביננטי מפוברק באמצעות לשכנו מציעים tunability יוצא דופן של הרצף חלבון ולכן את microenvironment תא תלת-ממד. אמרסון, לייק ופאלמר פולימרים כבר שמוצג להיות expressible של התשואות גבוהות, מטוהרים בקלות בשל התנהגותם LCST, ו מסתיימים מגוון רחב של מערכות במבחנה וויוו . השימוש של e. coli כמחשב מארח רקומביננטי מספק הליך פשוט וזול שנותן עלייה עד סמוך שליטה מושלמת משקל מולקולרי פולימר ופונקציונליות. בשילוב, טכניקה זו מאפשרת tunability חזקים הפארמצבטית של פלטפורמת הידרוג המאפשרות התרבות של מגוון רחב של סוגי תאים ב- 3D. לבסוף, הפלטפורמה הידרוג לשכנו היא נוטה מבחני במורד הזרם ביוכימיים רבים כולל לרביעיית-PCR, תספיג, מיצוי ה-DNA של התא immunostaining⁹.

המחברים אין לחשוף.

המחברים תודה פאלמר, ה באבו (סטנפורד נוירוכירורגיה) למתן מאתר באמנות NPCs. וקטור באיור 4 בשימוש ומותאמים מאמנות רפואי שרת תחת יצירתי של מלאי ייחוס 3.0 רישיון (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). חלק מעבודה זו בוצעה ב סטנפורד ננו משותפים מתקנים (SNSF), הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת פרס מרכזים לגיל הרך-1542152. N.A.S. מאשר תמיכה מן הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים (32GM 008412). ובין מאשר תמיכה של NRSA NIH מראש דוקטורט (F31 EB020502), חוקרים לגשת לתוכנית של Siebel. S.C.H. מאשר תמיכה של מכוני הבריאות הלאומיים (U19 AI116484 ו- R21 EB018407), הקרן הלאומית למדע (DMR 1508006), מכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית (RT3-07948). מחקר זה קיבל מימון הברית עבור הדרכה (AR³T), ומחקר השיקום רגנרטיבית נתמך על ידי יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי הילד לבריאות והתפתחות האדם (NICHD), המכון הלאומי הפרעות נוירולוגיות שבץ (NINDS) ו המכון הלאומי של הדמיה ביו, בביו-הנדסה (NIBIB) של המכונים הלאומיים לבריאות תחת P2CHD086843 מספר פרס. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים של מכוני הבריאות הלאומיים.