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Hidrogeles de ingeniería de la proteína recombinantes son ventajosos para el cultivo celular 3D ya que permiten completa afinabilidad de la espina dorsal del polímero y por lo tanto, el microambiente de la célula. Aquí, describimos el proceso de purificación de proteína recombinante como elastina y su aplicación en la encapsulación de la célula de hidrogel 3D.
Técnicas bidimensionales (2D) cultivo de tejidos han sido esenciales para nuestra comprensión de la biología de la célula fundamental. Sin embargo, la falta de sistemas de cultura de tejido tradicional 2D una matriz (3D) tridimensional, dando como resultado una importante desconexión entre resultados obtenida in vitro e in vivo. Para solucionar esta limitación, los investigadores han diseñado plataformas de cultivo de tejidos de hidrogel 3D que pueden imitar las propiedades bioquímicas y biofísicas del microambiente de la célula en vivo . Esta investigación ha motivado la necesidad de desarrollar plataformas de material que soportan encapsulación celular 3D y posteriores ensayos bioquímicos. Ingeniería de proteínas recombinantes ofrece un único conjunto de herramientas para desarrollo y diseño de material de hidrogel 3D por lo que permite el control específico de la secuencia de la proteína y por lo tanto, por extensión, las propiedades mecánicas y bioquímicas potenciales de la resultante matriz. Aquí, presentamos un protocolo para la expresión de derivados por vía recombinante como elastina proteína (ELP), que puede utilizarse para forma hidrogeles con propiedades mecánicas independientemente ajustables y la concentración de ligando adhesivo celular. Además presentamos una metodología para la encapsulación de la célula en hidrogeles ELP y posterior tinción inmunofluorescente de encajado las células para posteriores análisis y cuantificación.
Durante el siglo pasado, cultivo de tejidos de dos dimensiones (2D) se ha convertido en un conjunto de herramientas integral para el estudio de biología fundamental de la célula en vitro. Además, los protocolos relativamente barato y simple para el cultivo celular 2D han conducido a su adopción a través de muchas disciplinas biológicas y médicas. Sin embargo, más allá de la investigación ha demostrado que las plataformas 2D tradicionales pueden conducir a resultados que se desvían marcadamente de los recogidos en vivo, causando tiempo precioso y financiación en vano para la investigación clínico1,2, 3. Nosotros y otros presumen que esta discrepancia puede ser atribuida a la falta de nativos señales bioquímicas y biofísicas a las células cultivadas en las superficies de la 2D, que pueden ser necesarias para la óptima proliferación y maduración de diversos tipos celulares.
Para hacer frente a estas limitaciones y ayuda el puente de la brecha entre 2D estudios in vitro e in vivo , los investigadores tienen plataformas de hidrogel (3D) tridimensional desarrollado para la encapsulación de la célula1,4,5 ,6. Los hidrogeles son materiales ideales para recapitular el microambiente endógeno de la matriz extracelular (ECM) en vivo debido a sus propiedades mecánicas como de tejido y estructura hinchada de agua que permite el rápido transporte de nutrientes y señalización de factores de7,8. Además, 3D hidrogeles pueden diseñarse para tener control independiente sobre las propiedades mecánicas y bioquímicas del andamio. Matriz mecánica9,10,11,12 y ligandos de células adhesivas13,14,15 son bien sabido para influir en la célula comportamiento en vitro y en vivo. Así, los hidrogeles 3D con propiedades ajustables ofrecen una plataforma para estudiar las relaciones de causalidad entre las células y su microambiente. Criterios para una matriz hidrogel 3D ideal incluyen encapsulación de células simple, no citotóxica como independiente afinabilidad de fisiológicamente relevantes propiedades mecánicas e imitadores de motivos adhesivo celular nativos.
Tanto sintético (e.g., polietilenglicol, ácido poliláctico, poli (ácido glicólico)) y origen natural (por ej., alginato, colágeno, Matrigel) hidrogeles tienen ventajas sobre las plataformas de cultura 2D en vitro ; sin embargo, también tienen importantes deficiencias que limitan su aplicabilidad. Primero, muchas plataformas sintéticas y de origen natural requieren condiciones de reticulación áspero que pueden ser potencialmente tóxicas para las células mamíferas, conduce a disminución de la viabilidad de la célula7. Además, muchas plataformas sintéticas carecen de actividad biológica nativa y deban ser funcionalizados mediante reacciones químicas secundarias, que pueden agregar mayor complejidad y costo16. Finalmente, mientras que los materiales de origen natural contienen típicamente intrínsecos dominios bio-activo, a menudo se ven afectadas por la alta variabilidad de lote a lote y a menudo se limitan a formar geles relativamente débil7,17.
Ingeniería de proteínas recombinantes presenta un conjunto único de herramientas para el diseño de materiales por lo que permite el control explícito de secuencia de la proteína y, por extensión, las propiedades mecánicas y bioquímicas potenciales de hidrogel final andamio18. Además, aprovechando la maquinaria biológica conocida de Escherichia coli (e. coli) para expresar proteínas materiales pueden producir rentable y consistente con variabilidad limitada inter y intra-lote. La proteína elastina-como (ELP) presentada aquí tiene tres dominios modificados: (1) una etiqueta T7 y His6 que permite mediante fluorescencia de etiquetado etiquetado anticuerpos, (2) una región de 'elastina-como' que le confiere propiedades mecánicas elásticas y permite para química reticulación y (3) una región de 'bio-activo' que codifica para celular-adhesivo motivos.
Nuestra región de elastina-como se basa en la canónica (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) secuencia de elastina5 donde cuatro de lo Xaa sitios del aminoácido isoleucina (Ile), pero podrían ser diseñado para ser cualquier aminoácido, excepto prolina. Esta secuencia dota ELPs recombinantes con bajo comportamiento de temperatura (LCST) de solución crítica que pueden ser aprovechados para la expresión posterior purificación simple vía termal ciclismo19,20. Esta propiedad LCST puede ajustarse al agregado térmicamente a diferentes temperaturas modificando el huésped 'Xaa' residuo21,22.
Aquí, la posición de 'Xaa' en una de las cinco repeticiones de elastina-como ha sido reemplazada con el presentación de Amina lisina (Lys) aminoácido, que se utiliza para la reticulación de hidrogel. Nuestro trabajo previo ha demostrado no citotóxico y robusto reticulación vía la reacción con los reactivos amina crosslinker tetrakis (hidroximetil) fosfonio cloruro (THPC)23. Variables proteína contenido y crosslinker concentración total, somos capaces de producir hidrogeles que pueden ajustarse para abarcar un rigidez fisiológicamente relevante gama (~0.5-50 kPa)9,23,24. Además de afinar características mecánicas, adhesión celular dentro del hidrogel resulta de la integración de dominios de células adhesivas canónicos dentro de la columna vertebral de la proteína de la ELP. Por ejemplo, la incorporación de la secuencia de aminoácidos derivados de fibronectina extendida 'RGDS' permite la adhesión celular y flexibilidad conformacional, mientras los revueltos, variante de 'RDGS' no vinculante restringe de adhesión célula-matriz24. Modulando la relación de la célula-adhesivo para proteínas no-adhesiva, así como la concentración de proteína total, somos capaces de producir efectivamente hidrogeles que abarcan una amplia gama de la concentración de ligando. Consecuencia, hemos desarrollado una plataforma de hidrogel con propiedades bioquímicas y biofísicas desconectadas, que pueden ajustarse independientemente para una óptima cultura 3D de diversos tipos celulares.
Además de rigidez de la matriz y afinabilidad ligando adhesivo, hidrogeles recombinantes ofrecen la capacidad de diseño perfiles de degradación del material específico, que es necesaria para separarse de la célula, la proliferación y la migración dentro de un contexto 3D4 , 9. esta degradación es ofrecida por secreción celular de las proteasas que dirigidas específicamente prolongado 'RGDS'9 o elastina-como secuencia25. Hidrogeles ELP también han demostrado para los posteriores ensayos bioquímicos que son necesarios para el estudio de viabilidad celular y la función incluyendo immunocytochemistry, así como la extracción de ADN/ARN/proteína para reversa cuantitativa reacción en cadena de la transcripción-polimerasa (qRT-PCR) y Western blot9. ELP variantes también se han utilizado en un número de modelos en vivo y son conocidas por ser bien tolerado por el sistema inmune26.
Tomados en conjunto, ELP como una plataforma material para estudios de encapsulación celular cuenta con una amplia variedad de ventajas en comparación con plataformas de material sintético o de origen natural, que carecen a menudo el mismo grado de afinabilidad bioquímica y Biofísica y reproducibilidad. Además, no citotóxico un de ELP uso sencillo y con una gran variedad de tipos celulares (por ej., chick raíz dorsal ganglia14,24, progenitoras neurales murinos células9,27, bovina de las células troncales mesenquimales humanas condrocitos neonatal28, human endothelial células29,30) permite que un modelo más fisiológicamente relevante del endógeno ECM 3D en comparación con el cultivo celular 2D. Adjunto, presentamos un protocolo para la expresión de derivados por vía recombinante, TEKS para el uso como plataforma de hidrogel regulables para 3D encapsulación de la célula. Además presentamos la metodología para el down-stream fluorescente etiquetado y microscopia confocal de células encapsuladas.
1. ELP expresión protocolo
2. encapsulación en hidrogeles 3D elastina-como la proteína de la célula
3. inmunocitoquímica de células en 3D ELP hidrogeles
El ELPs utilizados en este protocolo se componen de cinco regiones: una etiqueta de T7, etiqueta His6, sitio de la hendidura del enterokinase (EK), una región de bio-activos y una región de elastina-como (figura 1). Las etiquetas T7 y His6 permiten la fácil identificación mediante técnicas de Western blot estándar. Introducción del sitio de clivaje EK permite la eliminación enzimática de la región de la etiqueta, si es necesario. La región de bio-activos codifica para el extendido, derivado de fibronectina celular-adhesivo ('RGDS') o las secuencias no-adhesiva ('RDGS'). Por último, la repetición de la central de la región como elastina contiene un grupo de lisina en el sitio de residuo de huésped que permite la reticulación via THPC mientras que las repeticiones que flanquean contienen isoleucina para lograr un LCST de ~ 32 ° C31.
Expresión de post, SDS-PAGE y Western blot puede utilizarse para visualizar el peso molecular y confirmar la identidad del ELPs que contienen etiquetas de anticuerpos, como T7 (MASMTGGQQMG) o His6 (HHHHHH) (figura 2). Expresión acertada bajo condiciones controladas rinde un producto muy homogéneo representado por la presencia de una sola banda oscura en el peso molecular aproximado (~ 37 kDa) de estas proteínas usando ambos SDS-PAGE (figura 2A) y Western blot) Figura 2B).
En condiciones incontroladas, la presencia de bandas de peso molecular más bajos en un Western blot sugiere que una fracción de las proteínas no fue completamente traducido o fueron degradados después de la expresión (figura 2). Específicamente, las masas aquí están espaciadas uniformemente por ~ 9 kDa, que se corresponde aproximadamente con el peso de una región de bio-activos y tres regiones de elastina-como (una repetición), o aproximadamente una cuarta parte de la proteína diana. Estos pequeños fragmentos de proteínas están generalmente presentes cuando la expresión se realiza a una temperatura más alta (> 32 ° C) como en la figura 2. La presencia de estas proteínas de peso molecular más bajas puede llevar a propiedades mecánicas impredecibles. Así, se recomienda screening regular expresión post para garantizar un producto final de alta calidad.
La rigidez mecánica de Hidrogeles basados en ELP puede modificarse mediante la manipulación de la concentración de ELP o la relación de aminas primarias de THPC grupos reactivos: ELP. Al mismo tiempo, la concentración de ligandos de células adhesivas puede ajustarse cambiando la proporción de variantes ELP con el adhesivo de la célula (RGDS) a las secuencias de (RDGS) no adhesiva dentro de cualquier régimen de rigidez. Mediante la manipulación de estas dos variables, podemos producir geles que poseen un espectro de propiedades mecánicas y las concentraciones de ligando (figura 3).
Para encapsular células en 3D hidrogeles ELP, el número deseado de células suspendido en el medio y se centrifugó para producir un precipitado de células (Figura 4A). El medio se aspira del tubo, y las células se resuspendió uniformemente en la solución de la ELP de la concentración deseada. A continuación, THPC solución es añadido a la suspensión de la célula/ELP y pipetea cuidadosamente para formar una mezcla homogénea. Esta solución es rápidamente transferida a los moldes de silicona estéril dentro de una placa de 24 pocillos con una pipeta y permitió a reticulación a temperatura ambiente y 37 ° C durante 15 min cada uno (Figura 4B). Por último, el medio es añadido a la placa de la pozo y se incubaron a 37 ° C en el experimento.
Live/dead tinción puede utilizarse para evaluar viabilidad celular y la encapsulación de acertado de la célula en hidrogeles ELP. Como se ilustra en la figura 5, las células progenitoras neurales murinos adultos (PNJ) Mostrar viabilidad celular alta durante 7 días dentro de un hidrogel ELP 3% (p/v).
Hidrogeles ELP 3D han demostrado previamente para apoyar el mantenimiento de la madre NPC medido a través de la expresión de marcadores de proteínas NPC canónicos SRY (sexo que determina la región Y)-caja 2 (Sox2) y nestina9. NPCs encapsuladas hidrogeles ELP 3% (p/v) con baja THPC reticulación Mostrar alta expresión de Sox2 nuclear localizada y filamentos citoplásmicos nestina mediante inmunotinción y proyección de imagen confocal (figura 6).
Figura 1 : Una representación esquemática de la ELP y de secuencias de aminoácidos correspondientes. El ELP utilizado en este estudio contiene una etiqueta T7 y His6 para la proyección de imagen basados en anticuerpos, una región bioactiva para la introducción de dominios adhesivo celular y una región como elastina que le confiere propiedades mecánicas elásticas y permite para la reticulación química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Expresión de la proteína objetivo puede validarse con SDS-PAGE y Western blot para confirmar el peso molecular y la identidad del producto liofilizado final. Puro ELP cuerpo entero funciona con un peso molecular de 37 kDa reportado por (A) de SDS-PAGE y Western blot utilizando el T7 (MASMTGGQQMG) o histidina 6 etiqueta (HHHHHH) (B). (C). lotes impuros de ELP debido a las desviaciones en el protocolo de expresión ELP pueden conducir a la expresión de ELPs con pesos moleculares más bajos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Contenido de ligando RGDS puede ajustarse independientemente de características mecánicas en hidrogeles ELP. 5% (p/v) y 3% (p/v) ELP hidrogeles tienen esquileo moduli de ~ 800 Pa y ~ 400 Pa, respectivamente. Hidrogeles con una relación 1:1 de aminas primarias de THPC grupos reactivos: ELP fueron reticulado a temperatura ambiente durante 15 minutos, calentada a 37 ° C y permitieron para equilibrar durante 5 minutos antes de la medición. Datos son medias ± d.e., *p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Esquema de encapsulación de la célula en hidrogeles ELP. (A). las células inicialmente son disociadas en una suspensión unicelular en el medio y la granulada utilizando una centrífuga. El medio se aspira del tubo, y las células se resuspendió en solución ELP en la concentración deseada y mezclar bien. Finalmente, la solución de reticulación THPC se añade y mezcla bien. (B). inmediatamente después de la adición de THPC, la solución se echa en un molde de silicona con una pipeta. La solución es permitida reticulación a temperatura ambiente durante 15 min, seguido de una segunda incubación de 15 minutos a 37 ° C. El medio se agrega entonces a la cultura para la duración del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Células progenitoras neurales mantienen alta viabilidad en hidrogeles ELP. Imagen representativa de las células progenitoras neurales había encapsulado en el 3% (p/v) ELP hidrogeles con reticulación de 1:1 (aminas primarias de grupos reactivos: ELP de THPC) después de 7 días en la cultura. Verde: viva coloración (calceína-AM); Rojo: muertos tinción (homodímero de etidio). Barra de escala = 100 μm.
Figura 6 : 3D ELP hidrogeles apoyan la expresión progenitoras neurales célula madre fabricante. Imagen de inmunofluorescencia de células progenitoras neurales expresando Sox2 y nestina proteínas después de 7 días de la cultura en hidrogeles ELP. Las imágenes muestran las células encapsuladas en geles de ELP 3% (w/v) con 0.5:1 de reticulación (aminas primarias de grupos reactivos: ELP de THPC). Azul: DAPI (núcleos); Rojo: Sox2; Verde: nestin. Barra de escala = 25 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Purificación y expresión de la proteína recombinante es una herramienta poderosa para sintetizar biomateriales con alta reproducibilidad. Debido en gran parte a la llegada de la clonación molecular comercializada, plásmidos recombinantes personalizados pueden adquirirse de varios proveedores, que reduce significativamente el tiempo para trabajar con materiales como el ELPs. Del mismo modo, plásmidos pueden solicitarse directamente en el laboratorio de origen, cuando la obra original fue respaldada por un contrato federal y la labor futura serán para uso sin fines de lucro. La secuencia de aminoácidos completa de ELP ha sido publicada previamente por varias variantes ELP31. Sin embargo, el proceso de expresión a la eventual purificación de proteínas recombinantes implica a una serie de pasos críticos que comúnmente pueden conducir a la reducción de rendimientos o un producto de calidad inferior. Algunos de los problemas más comunes para la preparación de ELP se presentan en uno de los siguientes: (1) calidad de las poblaciones bacterianas almacenadas, (2) la congelación y descongelación de primer ciclo para alterar la membrana bacteriana y (3) proteína purificación a través de ciclos térmicos.
Una diferencia importante entre la expresión de la proteína y otros medios no biológicos de producción de materiales es que estamos aprovechando la maquinaria biológica de anfitriones recombinantes para sintetizar los polímeros. Posteriormente, esta técnica viene con una única limitación: muerte celular o daño. Muerte de las células más comúnmente se manifiesta como un reducido número de colonias bacterianas después de rayar una placa o anormalmente pequeñas colonias que crecen relativamente despacio. Las poblaciones bacterianas, si mantiene cuidadosamente, pueden permanecer estables durante años; sin embargo, ciclos de congelación y descongelación sucesivas debido a la falta repetida de uso o en el congelador pueden reducir la viabilidad de las células o conducir a daños en el ADN. Típica acción de las bacterias BL21 usa entre 10% y glicerol al 40% por volumen mezclado con células suspendidas. El propósito de la glicerina es reducir el daño de la membrana de la nucleación de cristales de hielo durante la congelación. Por lo tanto, usando una concentración baja (< 10%) puede conducir a una membrana comprometida, mientras que concentraciones más altas (> 40%) puede suprimir el punto de congelación suficientemente a donde la acción nunca congela que conduce a la muerte celular. Sin embargo, incluso dentro de los niveles de glicerol óptima, las poblaciones bacterianas no se debe a totalmente deshielo como una combinación de daño de la membrana de re-congelación y citotóxicos efectos desde el glicerol puede llevar a la reducida viabilidad de población y daño de la DNA. Por lo tanto, si se observa que una población bacteriana resulta en un recuento de colonias bajo o que están dividiendo las células a un ritmo constante lento (se manifiesta como una velocidad de rampa lenta de OD600 durante la expresión), volver a transformar el plásmido y haciendo una nueva acción es un simple primera aproximación para solucionar este problema. Con esto en mente, para asegurar el mantenimiento a largo plazo de las poblaciones bacterianas y la integridad del ADN, es mejor almacenar las copias de su plásmido DNA purificado en agua y no dentro de las células congelada. Almacenamiento de DNA de esta manera se asegurará de que en acontecimientos imprevistos como un acción fallida o congelador, una fuente confiable de la DNA original puede utilizarse para la transformación.
Otro paso crítico en la fabricación de ELP es la purificación de la proteína diana desde el host de expresión. Extracción de proteínas de e. coli se logra mediante la ruptura de la pared celular mediante nucleating cristales de hielo que se forman a lo largo de la celda suspendida lisada a congelación, que se agrava aún más con la congelación y descongelación sucesivas. Métodos alternativos para la ruptura de la pared celular pueden ser utilizados como sonicación o una prensa. En particular, consecutivo hielo-deshielo del lisado es ventajoso ya que sólo requiere un congelador y ningún otro equipo de la especialidad. Sin embargo, este procedimiento libera un ADN, RNA y proteínas contaminantes, además de proteasas que tienen el potencial para degradar la proteína diana. Por lo tanto, para evitar la contaminación y reduce el rendimiento, desoxirribonucleasa (DNasa) iy phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) estamos añadidos a la celda lisada a degradar el DNA e inhiben las proteasas, respectivamente. La presencia de ADN antes de la adición de la ADNsa se observa visualmente como un aspecto 'fibroso' a lo largo de la celda suspende de nuevo lisada tras el primer deshielo. DNAsas degradan activamente este ADN y así reducen la viscosidad de la célula lisada haciéndolo más fácil de purificar mediante centrifugación. Descomponen el óptimo de la DNA se puede confirmar visualmente garantizando que el lisado celular parece ser totalmente líquido y que ya no es visible el aspecto fibroso. En la práctica hemos observado que la adición de mg ~0.1 de DNasa por lisado de célula de mL es suficiente para lograr la degradación es necesaria. Sin embargo, si aún se observa la presencia de ADN, DNasa más puede añadirse seguido por un adicional de dos a tres horas de agitación. Un problema similar también puede surgir si DNasa se agrega prematuramente antes de lisado ha tenido la posibilidad de descongelar suficientemente. En este caso, las temperaturas más frías pueden limitar la eficiencia de degradación del ADN debido a la inactivación prematura de DNasa. Para evitar este problema, es a menudo mejor práctica para permitir que el sedimento suspende de nuevo descongelar durante aproximadamente 8 horas antes del tratamiento con DNasa. Además, si se reportan rendimientos de baja proteína y la ruptura del ADN ha sido suficiente, la adición de más PMSF para ayudar a reducir aún más el potencial degradación de las proteínas de las proteasas puede ser requerida.
Consideraciones adicionales para asegurar la óptima expresión de ELPs incluyen una comprensión cuidadosa de los beneficios y limitaciones de un antibiótico elegido. Aquí, pET15b vectores que contienen un gen de resistencia a la ampicilina fueron utilizados para la expresión de la proteína. Funcionalmente, la serie vector pET permite la expresión de la proteína significativa con 50% de expresión de la proteína de la bacteria dedicada a la proteína diana tras una inducción exitosa32,33. Sin embargo, la ampicilina como un antibiótico de selección viene con algunas limitaciones que pueden interferir con la expresión óptima. En primer lugar, la degradación de la ampicilina en la presencia de e. coli puede ocurrir rápidamente debido a la liberación de beta-lactamasa. Si una cantidad suficiente de la ampicilina se degrada, el plásmido ampicilina-codificación (es decir, el plásmido de codificación de ELP) puede perderse totalmente. Como resultado, al expresar el ELPs durante períodos más largos, los niveles de expresión de la proteína deben ser supervisados cuidadosamente en momentos sucesivos para garantizar una cantidad suficiente del gene codificación de ELP permitir la expresión conveniente. Posibles métodos de solución de problemas de la acumulación de beta-lactamasas incluyen girar hacia abajo la cultura de arrancador y volver a suspender las células en medio libre de antibiótico antes de inocular el medio de expresión. Este proceso limita la transferencia de las enzimas degradantes de antibiótico eficaz y asegura una mayor parte de las células contienen el vector de codificación de la proteína objetivo. Además, la ampicilina tiene una vida útil limitada de aproximadamente dos a tres semanas. Por lo tanto, las placas de cultivo para la expresión de la proteína deben almacenarse a 4 ° C por un máximo de dos semanas previas a utilizar. Finalmente, para asegurar la eficacia de la ampicilina en el arranque y la expresión medios de comunicación, la solución ampicilina debe ser fresco producido inmediatamente antes de usar, como almacenamiento a largo plazo puede conducir a un antibiótico menos eficaz.
La presencia de un LCST permite la simple purificación de TEKS por ciclos térmicos. En concreto, en una temperatura más alta y en presencia de sales, las fuerzas entrópicas causan ELPs menos solubles y forman posteriormente una fase de polímero rico coacervate. Por el contrario, a temperaturas más bajas, TEKS permanecen solubles y fácilmente se disuelven en la solución. Ciclismo entre estos regímenes de dos temperatura juntados con pasos de centrifugación para recoger y eliminar la fase contiene de ELP no sucesivamente concentra la proteína y reduce simultáneamente la existencia de contaminantes no ELP.
Sin embargo, hay una serie de etapas donde el ELPs se pueden perder en este proceso de purificación. En primer lugar, antes de cada giro frío es alcalizada la solución que contiene la proteína a un pH de 9.0. Este pH más alto sirve para deprotonate ciertos aminoácidos en la espina dorsal de la proteína, con eficacia, dejándolos en un estado cargado y seguir mejorando su solubilidad. En consecuencia, lo anterior este paso o no, lo que permite tiempo suficiente para la disolución de proteína puede conducir a una reducción en la producción como proteínas no solubilizado se peleteado durante la centrifugación y se descarta.
Del mismo modo, las proteínas blanco puede perder durante el procedimiento de giro caliente cuando el ELP es peleteado. Inicialmente, se agrega NaCl al sobrenadante rico en proteínas para reducir la solubilidad de la ELP. Las sales de trabajan para proteger a interacciones electrostáticas entre las moléculas de proteína y agua, haciendo que la proteína de la fase acuosa. Este efecto se amplifica mediante el calentamiento de la solución, que, debido a los efectos antrópicos, además rompe la 'jaula' hidratada que rodean ELPs y obliga a la agregación de las proteínas. En concentraciones más bajas de la proteína (es decir., el primer ciclo térmico), la adición de sales solo a menudo es insuficiente para causar esta separación de fases. Sin embargo, como la concentración de proteína aumenta (es decir., después de ciclos térmicos) y hay menos contaminantes secundarios para interactuar con las sales, el ELP precipitará más fácilmente. Como resultado, si sales se añaden demasiado rápido, puede físicamente atrapadas por agregación de las proteínas, que reduce la concentración de la solución con eficacia y límites más precipitación de la proteína. Así, la sal debe agregarse en tres pequeñas cantidades para que tengan tiempo suficiente para distribuir homogéneamente a través de la solución. Como nota final, variaciones a la columna vertebral de la ELP, ya sea a través de más modificaciones en el resto de huéspedes de la región como elastina o cambios en la región de bio-activo pueden afectar significativamente el comportamiento LCST. En consecuencia, para asegurar rendimientos óptimos de la proteína a través de variantes de la proteína, es crucial optimizar el pH, concentración de sal y sal tipo (e.g., monovalentes o divalentes) de las vueltas frías y calientes.
Correr de SDS-PAGE sobre la terminación de protocolo se recomienda ya que puede ser utilizado para determinar fácilmente si pérdida significativa de ELP se produce durante alguno de los pasos de purificación. Brevemente, si ELP se detecta en el sobrenadante después de un giro caliente, entonces la proteína no es ser efectivamente precipitada. Del mismo modo, si ELPs se identifican en una muestra de pellet solubilizado tras un centrifugado en frío, entonces la proteína no es ser efectivamente disuelto.
Hidrogeles ELP ofrecen muchas ventajas sobre materiales sintéticos o de origen natural. Específicamente, el uso de la amina reactiva crosslinker THPC ofrece un mecanismo de bajo costo, simple y armonioso de la reticulación de proteínas. Sin embargo, hay diferentes limitaciones dentro del Protocolo de reticulación que debe señalarse. THPC es oxígeno sensible, y si se almacena bajo condiciones indebidas, rápidamente pueden deteriorarse en la eficiencia de la reacción. Además, debido a su reactividad con aminas primarias, THPC puede reaccionar con alrededor de proteínas en los medios de comunicación o en la superficie celular que son ricas en aminas. Por lo tanto, al formar hidrogeles ELP, se recomienda para evitar la contaminación de los medios de comunicación con el precipitado de células para reducir la reactividad cruzada posible proteína exógena y por ende, una reducción en la eficiencia de la reticulación. Por último, este mecanismo de reticulación excluye la secuencia de la región de bio-activos para los que no hay residuos de lisina y por lo tanto, limita la potencial integración de algunos motivos de células adhesivas (por ej., IKVAV34). Para enfrentar estas limitaciones, modificaciones a la red troncal ELP con azida y bicyclononyne (BCN) socios de la reacción permite el entrecruzamiento bio-ortogonales, como se describió anteriormente27.
Cabe señalar que el comportamiento LCST ELP juega un papel importante en dictar microestructura de hidrogel. A regímenes de temperatura por encima de la LCST, ELPs precipitan fuera de solución lleva a la formación de fases de proteínas y deficiencia de proteína que puede influir en la porosidad de la matriz y la eficiencia de la reticulación de la matriz9. Porque se llevan a cabo más experimentos de cultivo celular a temperaturas fisiológicamente relevantes (~ 37 ° C) por encima de la ELP LCST, estos efectos se deben considerar. Para los hidrogeles con eficacia la reticulación y forma una red interconectada de la proteína, la amina primaria de la lisina debe ser físicamente accesible para el crosslinker THPC. Si la agregación de ELP se produce antes de llegar a reticulación suficiente, TEKS atrapados dentro de la fase rica en proteínas pueden ser inaccesible y por lo tanto no puede participar en la reticulación. Para solucionar esta limitación, nuestro protocolo requiere un período de cura inicial 15 min a temperatura ambiente, que permite para la reticulación preliminar del hidrogel antes de que el ELP experimenta su transición térmica. La temperatura de incubación es seguida por una incubación adicional de 15 min a 37 ° C para finalizar reticulación de hidrogel. Este procedimiento es crítico para la reticulación suficiente y robusta y reproducible gelación del material ELP.
En conclusión, la proteína recombinante hidrogeles fabricados con ELP ofrecen excepcional afinabilidad de la secuencia de la proteína y por lo tanto el microambiente celular 3D. Polímeros ELP han demostrado ser expresable en altos rendimientos, purificados fácilmente debido a su comportamiento LCST y biocompatible en una amplia variedad de sistemas in vitro e in vivo . El uso de e. coli como huésped recombinante proporciona un procedimiento sencillo y económico que da lugar a cerca de control ideal de peso molecular de polímero y la funcionalidad. En conjunto, esta técnica permite afinabilidad robusto y reproducibilidad de la plataforma de hidrogel que permite el cultivo de una amplia gama de tipos de células en 3D. Finalmente, esta plataforma de hidrogel ELP es susceptible a muchos análisis bioquímicos posteriores incluyendo qRT-PCR, Western blot, la extracción de ADN y células immunostaining9.
Los autores no tienen nada que revelar.
Los autores agradecen T. Palmer y H. Babu (Neurocirugía de Stanford) para proporcionar murino NPCs. Vector art en la figura 4 fue utilizado y adaptado de Servier arte médico bajo licencia Creative Commons Atribución 3.0 Unported (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Parte de este trabajo fue realizado en la Stanford Nano comparte instalaciones (FNS), apoyado por la National Science Foundation bajo premio ECCS-1542152. N.A.S. agradece apoyo del Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud (32GM 008412). C.M.M. reconoce apoyo de un NIH NRSA becas predoctorales (F31 EB020502) y el programa Siebel. S.C.H. reconoce apoyo de los institutos nacionales de salud (U19 AI116484 y R21 EB018407), National Science Foundation (DMR 1508006) y el Instituto de California de medicina regenerativa (RT3-07948). Esta investigación recibió financiamiento de la Alianza para la investigación Regenerativa de rehabilitación y capacitación (AR3T), que es apoyada por la Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano (NICHD), Instituto Nacional de Desórdenes neurológicos y movimiento (NINDS) e Instituto Nacional de imágenes biomédicas y bioingeniería (NIBIB) de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P2CHD086843. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones de los institutos nacionales de salud.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
Parafilm | VWR | 52858-000 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
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