إنتاج بروتين الايلاستين مثل الهلاميات المائية للتغليف وإيمونوستينينج من الخلايا في 3D

المؤتلف الهلاميات المائية هندسة البروتين مفيدة للثقافة خلية ثلاثية الأبعاد كما أنها تسمح لألواح كاملة للعمود الفقري البوليمر، ومن ثم المكروية الخلية. هنا، نحن تصف عملية تنقية المؤتلف الايلاستين مثل البروتين وتطبيقه في تغليف خلية 3D المائية.

تقنيات زراعة الأنسجة (2D) ثنائي الأبعاد كانت أساسية لفهمنا لبيولوجيا الخلية الأساسية. ومع ذلك، جمعت الافتقار إلى نظم زراعة الأنسجة 2D التقليدية مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D)، أسفر عن كبير افصل بين النتائج في المختبر و في فيفو. لمعالجة هذا القيد، وقد هندسيا الباحثين منصات زراعة الأنسجة 3D المائية التي يمكن أن تحاكي خصائص المكروية الخلية في فيفو البيوكيميائية والفيزيائية. هذا البحث قد دافع الحاجة إلى تطوير منصات المادية التي تدعم التغليف خلية ثلاثية الأبعاد وفحوصات الكيمياء الحيوية المتلقين للمعلومات. هندسة البروتينات المؤتلف يقدم مجموعة أدوات فريدة من نوعها لتصميم المواد 3D المائية والتنمية عن طريق السماح لعنصر التحكم محددة لتسلسل البروتين، وبالتالي، استطرادا، خصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية المحتملة الناتجة عن ذلك مصفوفة. نقدم هنا، على بروتوكول للتعبير عن مثل الايلاستين المستمدة من ريكومبينانتلي البروتين (ELP)، التي يمكن استخدامها للنموذج الهلاميات المائية مع الخصائص الميكانيكية بشكل مستقل الانضباطي وتركيز يجند خلية لاصقة. كذلك نقدم منهجية لتغليف الخلايا ضمن برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت اللاحقة لتضمين الخلايا لتحليل المتلقين للمعلومات والقياس الكمي.

على مدى القرن الماضي، تطورت زراعة الأنسجة (2D) ثنائي الأبعاد إلى مجموعة أدوات متكاملة لدراسة الخلية الأساسية البيولوجيا في المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، أدت إلى اعتماده البروتوكولات نسبيا منخفضة التكلفة وبسيطة لثقافة الخلية 2D عبر العديد من التخصصات الطبية والبيولوجية. غير أن البحوث أظهرت السابقة أن منصات 2D التقليدية يمكن أن يؤدي إلى نتائج أن تنحرف كثيرا عن تلك التي تم جمعها في فيفو، مما تسبب في وقت ثمين والتمويل إهدار للبحوث سريرياً المنحى^{1،2، 3}. نحن وآخرون افترض أن هذا التناقض يمكن أن يعزى إلى عدم وجود منبهات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية الأصلية المقدمة للخلايا المزروعة في 2D السطوح، التي يمكن أن تكون ضرورية للانتشار الأمثل ونضوج مختلف أنواع الخلايا.

لمعالجة هذه القيود والتعليمات الجسر الفجوة بين 2D بالدراسات في المختبر و في فيفو ، الباحثين المنصات المتقدمة المائية (3D) ثلاثي الأبعاد لتغليف خلية^{1،4،5 ،6}. الهلاميات المائية هي مواد مثالية الخص المكروية الذاتية للمصفوفة خارج الخلية (ECM) في فيفو نظراً للخصائص الميكانيكية مثل الأنسجة وهيكل منتفخة المياه التي تمكن النقل السريع للمواد الغذائية و مما يشير إلى عوامل^7،8. وعلاوة على ذلك، يمكن تصميم 3D الهلاميات المائية على السيطرة المستقلة على الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية من السقالة. مصفوفة ميكانيكا^9،10،،من¹¹¹² وخلية لاصقة يغاندس^13،،من¹⁴¹⁵ معروفة جيدا للتأثير على الخلية السلوك في المختبر و في المجراة. وهكذا، الهلاميات المائية 3D مع خصائص الانضباطي منهاجا لدراسة العلاقات السببية بين الخلايا وبهم المكروية. تشمل معايير لمصفوفة مثالية 3D المائية تغليف خلية بسيطة وغير-السامة للخلايا، فضلا عن ألواح مستقلة من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة الخصائص الميكانيكية ويقلد من زخارف لاصقة الخلية الأصلية.

كلا الاصطناعية (مثلاً.، البولي إيثيلين جليكول، حمض اللبنيك، بولي (حمض الجليكوليك)) والمستمدة من الطبيعي (مثلاً.، الجينات، الكولاجين، ماتريجيل) الهلاميات المائية بمزايا على 2D في المختبر منابر الثقافة؛ ومع ذلك، لديهم أيضا أوجه القصور الهامة التي تحد من تطبيقها. الأولى، العديد من منصات الاصطناعية والمستمدة من طبيعة الحال تتطلب الظروف القاسية كروسلينكينج التي يمكن أن تكون محتملة السمية لخلايا الثدييات، مما يؤدي إلى تناقص خلية بقاء⁷. بالإضافة إلى ذلك، العديد من منصات الاصطناعية تفتقر إلى بيواكتيفيتي الأصلية وتحتاج إلى أن فونكتيوناليزيد عن طريق التفاعلات الكيميائية الثانوية، التي يمكن أن تضيف زيادة تكلفة وتعقيد¹⁶. وأخيراً، بينما المواد المستمدة من طبيعة الحال تحتوي عادة على المجالات الحيوية النشطة الجوهرية، أنهم غالباً ما تعاني من ارتفاع دفعة لدفعة تقلب وغالباً ما تقتصر على تشكيل الهلام ضعيفة نسبيا^7،17.

هندسة البروتينات المؤتلف ويعرض مجموعة أدوات فريدة من نوعها لتصميم مواد بالسماح بسيطرة واضحة على تسلسل البروتين، واستطراداً، سقالة الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية المحتملة للمائية النهائية¹⁸. بالإضافة إلى ذلك، بالاستفادة من الآلية البيولوجية المعروفة من الإشريكيّة القولونية (كولاي) للتعبير عن البروتينات، المواد يمكن أن تنتج فعالية من حيث التكلفة واستمرار مع تقلب محدودة في جملة-وداخل-دفعة. إيلاستين-مثل البروتين (ELP) المقدمة هنا بثلاثة مجالات الهندسة: (1) علامة T7 و His6 التي تسمح لوضع العلامات عن طريق فلوريسسينتلي معلم الأجسام المضادة، (2) في منطقة 'الايلاستين مثل' أن يمنح مرونة الخواص الميكانيكية ويسمح للمواد الكيميائية كروسلينكينج، و (3) منطقة 'الحيوية النشطة' ترميز لزخارف لاصقة الخلية.

يستند منطقتنا مثل الايلاستين المتعارف عليه (فال-برو-الغليسين-إكسا-الغليسين)₅ الايلاستين تسلسل فيها أربعة من 'إكسا' مواقع من الأحماض الأمينية آيسولوسين (إيل)، ولكن يمكن أن تكون مصممة لتكون الأحماض الأمينية أي استثناء برولين. يمنح هذا التسلسل ELPs المؤتلف مع سلوك أقل درجة الحرارة (لكست) الحل الحاسمة التي يمكن استغلالها للتعبير بعد تنقية بسيطة عبر الحرارية الدراجات^19،20. هذه الخاصية لكست يمكن ضبطها لتجميع حرارياً في درجات حرارة مختلفة عن طريق تعديل ضيف 'إكسا' بقايا^21،22.

هنا، تم استبدال موقف 'إكسا' في واحدة من يكرر إيلاستين-مثل خمسة مع الأحماض الأمينية يسين (Lys)-عرض أمين، الذي يستخدم ل crosslinking المائية. وقد أظهرت عملنا السابق crosslinking غير-السامة للخلايا وقوية عن طريق التفاعل مع رد الفعل أمين crosslinker تيتراكيس (هيدروكسيميثيل) فوسفونيوم كلوريد (تهبك)²³. متفاوتة عموما البروتين محتوى و crosslinker تركيز، نحن قادرون على إنتاج الهلاميات المائية التي يمكن ضبطها لمدى صلابة صلة فسيولوجيا نطاق (~0.5-50 الجيش الشعبي الكوري)^9،23،24. بالإضافة إلى ضبط الخصائص الميكانيكية، خلية التصاق ضمن نتائج المائية من إدماج المتعارف عليه مجالات لاصقة خلية ضمن العمود الفقري للبروتين برنامج القانون البيئي. على سبيل المثال، إدراج تسلسل الأحماض الأمينية 'رجدس' فيبرونيكتين-مشتقة موسعة تسمح بالتصاق الخلايا وكونفورماشونال من المرونة، بينما سارعت، المتغير 'ردجس' غير ملزم يقيد التصاق الخلية-مصفوفة²⁴. بتحوير نسبة لاصقة الخلية البروتينات غير لاصقة، فضلا عن تركيز البروتين الكلي، نحن قادرون على إنتاج فعالية الهلاميات المائية التي تغطي مجموعة واسعة من تركيز يجند. ريسولتانتلي، قمنا بتطوير منصة المائية مع decoupled الخصائص البيوكيميائية والفيزيائية، والتي يمكن ضبطها بشكل مستقل للثقافة 3D الأمثل لمختلف أنواع الخلايا.

بالإضافة إلى تصلب مصفوفة وألواح يجند لاصقة، المؤتلف الهلاميات المائية توفر القدرة على تصميم التدهور المادي محددة الملامح، وهو أمر ضروري لنشر خلية والانتشار والهجرة ضمن سياق 3D^{4 , 9}-هذا التدهور هو توفرها إفراز الخلية من البروتياز التي تستهدف على وجه التحديد الموسع 'رجدس'⁹ أو تسلسل الايلاستين مثل²⁵. الهلاميات المائية ELP أظهرت أيضا دعم فحوصات الكيمياء الحيوية اللاحقة التي ضرورية لدراسة الجدوى الخلية ووظيفة بما في ذلك إيمونوسيتوتشيميستري، فضلا عن استخراج الحمض النووي/رنا/البروتين لعكس الكمية النسخ-البلمرة المتسلسل (قرت-PCR) والغربية لطخة⁹. كما استخدمت في عدد من النماذج في فيفو متغيرات برنامج القانون البيئي ومعروفة جيدا يسمح ب الجهاز المناعي²⁶.

أخذت معا، تبدأ كمنهاج الدراسات الخلية-تغليف مواد يضم مجموعة واسعة من المزايا مقارنة بمنصات المواد الاصطناعية أو المستمدة من طبيعة الحال، غالباً ما تفتقر إلى نفس الدرجة من ألواح البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية و إمكانية تكرار نتائج. بالإضافة إلى ذلك، بسيطة وغير-السامة للخلايا استخدامها في برنامج القانون البيئي مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا (على سبيل المثال-، خلايا الفرخ الجذرية الظهرية ganglia^14،24، السلف العصبية موريني⁹، والخلايا الجذعية الوسيطة البشرية²⁷، الأبقار تشوندروسيتيس حديثي الولادة²⁸، الإنسان غشائي الخلايا^29،30) يسمح لنموذج ذات صلة أكثر من الناحية الفسيولوجية للمحتوى 3D الذاتية مقارنة بثقافة الخلية 2D. هنا، نقدم بروتوكولا للتعبير عن المشتقة من ريكومبينانتلي، ELPs لاستخدامها كمنصة المائية الانضباطي ل 3D الخلية التغليف. كذلك نقدم منهجية تيار أسفل العلامات الفلورية والفحص المجهري [كنفوكل] من الخلايا مغلفة.

1-برنامج القانون البيئي التعبير البروتوكول

1. يوم 1: تزايد مستعمرة كاتب
   1. إعداد لوحات أجار الأمبيسلّين والكلورامفينيكول بالتعقيم 25 غ لوريا مرق و 15 غرام من أجار الواحدة 1 لتر الماء عالي النقاوة. بمجرد قد بردت الحل إلى ~ 60 درجة مئوية، إضافة 1 مل الأمبيسلّين المخزون (100 ملغ/مل في الماء عالي النقاوة) و 1 مل من الأسهم كلورامفينيكول (34 ملغ/مل في الإيثانول 70%) 1 لتر حل أجار للتركيزات النهائية من 100 ميكروغرام/مل و 34 ميكروغرام/مل ، على التوالي. نقل 20 مل حل النهائي لاطباق بيتري 10 سم مع ماصة مصلية والسماح لاجار ترسيخ. التفاف أطباق بيتري مع بارافيلم ومخزن في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين أطباق بيتري عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
   2. خط عينة صغيرة من BL21 (DE3) بليس كولاي من مخزون بكتيرية مسبقة صنع التي تحتوي على ناقل pET15b ترميز برنامج القانون البيئي للفائدة على صفيحة أجار الأمبيسلّين والكلورامفينيكول.
      ملاحظة: حدد الأمبيسلّين والكلورامفينيكول للبكتيريا التي تحتوي على نواقل بليس و pET15b، على التوالي.
   3. ضع لوحة ستريكيد رأسا في حاضنة في 37 درجة مئوية. السماح للمستعمرات البكتيرية في النمو بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: لا احتضان لوحات لمدة أطول من ح 16 كما سوف تتحلل الأمبيسلّين ويمكن أن تشكل المستعمرات التي لا تحمل المقاومة الأمبيسلّين.
2. يوم 2: إعداد وسائل الإعلام الثقافة والتعبير كاتب
   1. إزالة ثقافة كولاي من الحاضنة. بارافيلم اللوحة ومخزن لمدة أقصاها 4 أيام في 4 درجات مئوية.
   2. تعد قارورة ثقافة كاتب (250 مل) وقوارير ثقافة التعبير (12 × 1 لتر) والاوتوكلاف. 1 لتر وسائط التعبير، إضافة ز 47.6 من مرق رائع ومل 4 من الجلسرين إلى 1 لتر الماء عالي النقاوة في قارورة ثقافة حيرة ل 2، وكاب مع رقائق الألومنيوم.
      ملاحظة: غلة النموذجية هي البروتين 60-100 مغ/لتر من وسائط التعبير.
   3. تحميل كاتب يعقم في حاضنة تهز 37 درجة مئوية قبل دافئة، واحتضان دون إثارة الشغب.
   4. إضافة 250 ميليلتر العقيمة تصفية المخزون الأمبيسلّين (0.22 ميكرون فلتر) (100 ملغ/مل في الماء عالي النقاوة) لثقافة كاتب لتركيز نهائي من 100 ميكروغرام/مل. تبدأ على الفور التحريض ثقافة كاتب 250 لفة في الدقيقة.
      ملاحظة: يستخدم فقط لاختيار مستعمرة على لوحات أجار الكلورامفينيكول ولا يتم تضمين للثقافات السائل.
   5. تلقيح ثقافة كاتب بإضافة مستعمرة كولاي المحتوية على بلازميد تبدأ واحدة من لوحة ستريكيد وتسمح ثقافة كاتب لهزة في 37 درجة مئوية ح 16.
   6. وضع وسائل الإعلام ثقافة التعبير قوارير إلى قبل تسخينها، 37 درجة مئوية تهز حاضنات واحتضان بين عشية وضحاها دون الانفعالات حيث تكون قوارير جاهزة تلقيح في صباح اليوم التالي.
3. يوم 3: حمل التعبير البروتين في كولاي
   1. جعل الأسهم الأمبيسلّين الطازجة والعقيمة التي تمت تصفيتها (100 ملغ/مل في الماء عالي النقاوة). أضف 1 مل أسهم الأمبيسلّين لكل قارورة من وسائط التعبير عن تركيز نهائي من 100 ميكروغرام/مل.
   2. يبدأ التحريض في وسائل الإعلام التعبير 250 لفة في الدقيقة.
   3. يأخذ عينة 2 مل من وسائل الإعلام من أي قارورة التعبير وإضافة إلى ومبومو فارغة لكثافة بصرية القراءة في 600 نانومتر (OD₆₀₀).
   4. بعد انتهاء احتضان ثقافة كاتب ح 16، تطعيم كل قارورة التعبير بنقل 20 مل ثقافة كاتب لكل قارورة التعبير عن طريق ماصة مصلية.
   5. بعد انتهاء الانفعالات ح 1، قياس OD₆₀₀ واحد من قوارير التعبير. وفي أعقاب هذه الخطوة، قياس OD₆₀₀ كل 20 دقيقة، التحقق من قارورة مختلفة في كل مرة.
   6. OD₆₀₀ من 0.6، خفض درجة حرارة الهزازات التي تحتوي على قوارير التعبير إلى 32 درجة مئوية.
   7. تحقق OD₆₀₀ كل 10 دقيقة. OD₆₀₀ من 0.8، الحث التعبير بإضافة 1 مل من 1 م، ثيوجالاكتوسيدي β-الأيزوبروبيل العقيمة التي تمت تصفيتها (إيبتج) في المياه عالي النقاوة لكل قارورة التعبير.
   8. تسمح كولاي في قوارير التعبير عن على ح 7.
   9. 20 دقيقة قبل نهاية التعبير، بارد مسبقاً الطرد مركزي الكلمة كبيرة إلى 4 درجات مئوية.
   10. جمع جميع ل 12 من وسائط التعبير في حاويات الطرد الفردي والتوازن.
   11. الطرد المركزي وسائط التعبير في > ز س 12,000 لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية باستخدام أجهزة الطرد مركزي في الطابق.
   12. من أجل إيقاف المادة طافية من كل حاوية أجهزة الطرد المركزي. باستخدام ملعقة، جمع الكريات خلية داخل كيس قفل الرمز بريدي قبل موزون.
   13. إعادة تعليق بيليه في المخزن عشر العقيمة التي تمت تصفيتها (100 مل من المخزن المؤقت كل 25 جرام بيليه) وإزالة أي فقاعات الهواء الزائدة بتلفيق بيليه. 1 لتر من المخزن المؤقت لعشر، لإضافة 5.8 غ كلوريد الصوديوم وز 1.21 من قاعدة تريس 0.37 ز من الإيثيلنديامين tetraacetic acid (يدتا) ثنائية الصوديوم ملح ثنائي هيدرات إلى 900 مل من الماء عالي النقاوة. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 وتقديمهم للأم 1 لهذه الخطوة، تكفي شرائح الأس الهيدروجيني.
   14. ضع الرمز البريدي قفل كيس يحتوي على بيليه إعادة تعليق خلية في حاوية ثانوية وتجميد في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
4. يوم 4-6: يمزق جدار الخلية البكتيرية عن طريق دورات تجميد أذاب
   1. إزالة بيليه المجمدة من الثلاجة والسماح له بالتحسن ببطء في 4 درجات مئوية بالانفعالات لطيف باستخدام شاكر مداري.
   2. تسمح بيليه لذوبان الجليد حتى بعض سائل موجود. إضافة ~ 30-40 ملغ من ديوكسيريبونوكليسي الأول (الدناز) لإذابة ليستي. بالإضافة إلى ذلك، إضافة 1 مل فلوريد فينيلميثيلسولفونيل 100 مم (بمسف؛ مثبط البروتياز) في الايزوبروبانول في 100 مل خلية ليستي. تسمح يهز بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: إضافة الدناز وبمسف اللازمة لتجميد أذاب الدورة الأولى فقط.
      تنبيه: بمسف السمية إذا استنشق. وينبغي استخدام قناع لوجه عند التعامل مع مسحوق بمسف.
   3. حالما يتم إذابة الخلية ليستي تماما، تجميد في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها، أو حتى تجمد تماما.
   4. كرر هذا الإجراء تجميد أذاب لما مجموعة ثلاث دورات. ترك مذاب في 4 درجات مئوية بعد التجميد أذاب الأخير. تخزين 100 ميليلتر من الخام للصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide جل التحليل الكهربي (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) في ختام تنقية.
   5. بعد ذوبان الماضي، ضبط الأس الهيدروجيني المذابة ليساتي إلى 9.0 استخدام هيدروكسيد الصوديوم م 1. لهذه الخطوة، تكفي شرائح الأس الهيدروجيني. احتضانها في 4 درجات مئوية على الأقل 1 ح (بين عشية وضحاها هو ملائم) على شاكر مداري.
5. يوم 7-9: تنقية برنامج القانون البيئي عن طريق ركوب الدراجات الحرارية تدور الباردة والساخنة
   1. بارد النابذة الكلمة إلى 4 درجة مئوية 20 دقيقة قبل استخدام الطرد المركزي.
   2. قاسمة والتوازن المذابة في حاويات أجهزة الطرد المركزي.
   3. الطرد المركزي في العينات > س 15,000 ز ح 1 في 4 درجات مئوية. تخزين 100 ميليلتر من المادة طافية للحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل بعد انتهاء تنقية.
      ملاحظة: بعد سينتريفوجينج، البروتين برنامج القانون البيئي ينبغي أن تظل في المادة طافية سبب إمكانية ذوبانه المرتفعة في الماء عند درجات حرارة أقل في لكست (< 32 درجة مئوية).
   4. نقل المادة طافية على حاويات أجهزة الطرد المركزي الجديدة والتوازن على نحو ملائم.
   5. إضافة كلوريد الصوديوم (NaCl) في ثلاثة أجزاء لتركيز نهائي 1 م (5.84 غ من كلوريد الصوديوم لكل 100 مل من المادة طافية). ضمان أن يتم إضافة كلوريد الصوديوم في ثلاثة أجزاء للسماح لانحلال كافية.
   6. تحرض على ح 3 في 37 درجة مئوية في 250 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز.
   7. ح 1 قبل نهاية الانفعالات، قبل الحارة الطرد مركزي الكلمة إلى 37 درجة مئوية.
   8. الطرد المركزي في > س 15,000 ز ح 1 في 37 درجة مئوية. تخزين 100 ميليلتر من المادة طافية للحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل بعد انتهاء تنقية وتجاهل المادة طافية المتبقية.
      ملاحظة: بعد سينتريفوجينج، البروتين برنامج القانون البيئي ينبغي أن يكون القريبون سبب في انخفاض معدلي الذوبان في الماء في درجة حرارة تزيد عن لكست (> 32 درجة مئوية).
   9. إعادة تعليق بيليه بإضافة 10 مل الماء عالي النقاوة، ويعقم كل 1 غرام بيليه. تستخدم ملعقة معدنية الهريس بيليه للمساعدة في حل البروتين.
   10. ضبط الأس الهيدروجيني المذابة إلى 9.0 استخدام هيدروكسيد الصوديوم م 1. لهذه الخطوة، تكفي شرائح الأس الهيدروجيني.
   11. تحرض بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر مداري.
   12. كرر الإجراء الدراجات الحرارية تدور الباردة والساخنة لما مجموعة ثلاث دورات (أي.، كرر الخطوات 1.5.1 عن طريق 1.5.11 لثلاث دورات الكلية).
6. 10-15 يوم: تبدأ الغسيل الكلوي وليوفيليزيشن
   1. الطرد المركزي بيليه إعادة معلقة في أجهزة الطرد مركزي مبردة مسبقاً في > س 15,000 ز ح 1 في 4 درجات مئوية. تخزين 100 ميليلتر من المادة طافية للحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل بعد انتهاء تنقية.
   2. تحلية الحل البروتين التي دياليزينج المادة طافية المتبقية في غشاء الديال كاتشين 3.5 ضد 4 لتر ماء عالي النقاوة مبردة مسبقاً عند 4 درجة مئوية. تغيير مياه الغسيل الكلوي مرتين يوميا لما مجموعة 6 مرات ما يزيد على 3 أيام.
      ملاحظة: وحدات التخزين طافية النموذجية بين 5 و 30 مل.
   3. الطرد المركزي الحل دياليزيد في أجهزة الطرد مركزي قبل تبريد في > س 15,000 ز ح 1 في 4 درجات مئوية. تخزين 100 ميليلتر من المادة طافية لتحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة في نهاية التنقية.
   4. تجميد الناتجة طافية في-80 درجة مئوية في الأنابيب المخروطية قبل موزون.
   5. ليوفيليزي الحل مجمدة لمدة 3 أيام وكتلة المنتج النهائي لتحديد العائد البروتين.
   6. بارافيلم الأنابيب التي تحتوي على النهائي المجففة بالتبريد المنتج برنامج القانون البيئي ومخزن في 4 درجات مئوية.
   7. قم بتشغيل الصفحة الحزب الديمقراطي الصربي لتحديد نقاء البروتين.
      ملاحظة: تتنوع البروتوكولات للحزب الديمقراطي الصربي صفحة استناداً إلى شروط محددة [اغروس] هلام. لتجاربنا، حلت بتركيز 0.5 ملغ/مل في المياه. البروتين المجففة بالتبريد النهائي وتشغيلها في 140 الخامس لدقيقة 70-100 في هلام اكريلاميد 12% (w/v) تحت ظروف يشوه.

2-خلية التغليف في 3D الايلاستين مثل البروتين الهلاميات المائية

1. إعداد قوالب السيليكون
   1. استخدام لكمه خزعة مع القطر المطلوب لخلق ثقوب في ورقة سيليكون سميك 0.5 مم وقطع مربعا حول كل فتحه. كرر هذه العملية لعدد قوالب المرجوة.
      ملاحظة: يمكن تعديل قطر وسمك قوالب لتطبيق معين وظروف ثقافة الخلية. في الممارسة العملية، للثقافات الخلية من 50 10⁶ خلايا/مل، قوالب 0.5 مم سميكة مع 4 ملم و 5 ملم بأقطار ينصح للحمض النووي كافية/الجيش الملكي النيبالي واستخراج البروتين، على التوالي. إيمونوستينينج، يمكن استخدام لكمه خزعة 2 مم بدلاً من ذلك إنشاء ثلاثة ثقوب متجاورة كل قالب مربع بحيث يمكن الملون replicates ثلاثة كل بئر.
   2. قم بإزالة غلاف بلاستيكي على كل جانب من العفن الفردية مع ملاقط.
      ملاحظة: تجنب الاتصال مع سطح السيليكون مكشوفة كما يمكنك تقليل تلوث بلازما المستقبل الترابط والكفاءة.
   3. استخدام الملقط، ترتيب نفس العدد من قوالب السيليكون العارية والزجاج كوفيرسليبس (رقم 1)، قطرها 12 مم) في الصفوف على غطاء المقلوب للوحة 48-جيدا بالتناوب. وبمجرد الانتهاء، تغطي غطاء لوحة 48-جيدا لتجنب التلوث.
   4. بلازما الأوكسجين علاج غطاء كامل 48-كذلك لوحة (أي.، قوالب والشرائح الزجاجية). مباشرة بعد استخدام الملقط لعكس العفن سيليكون على ساترة زجاجية المتاخمة. اضغط بحزم على القالب لضمان الترابط. تسمح قوالب احتضانها في درجة حرارة الغرفة ح 1.
      ملاحظة: سوف تختلف مدة العلاج البلازما الأكسجين تبعاً للأداة المستخدمة. الشروط النموذجية لأداتنا نافذة ضغط تشغيل بغاز بين 0.3-4 [مبر]، تدفق غاز الأكسجين في 20 سم³دور/دقيقة، وتعرض العينة للبلازما ل s 10-20.
   5. تعقيم في القوالب من التعقيم. تخزين القوالب في درجة حرارة الغرفة في بيئة معقمة حتى الاستخدام.
      ملاحظة: القوالب يمكن تخزينها في هذه المرحلة إلى أجل غير مسمى.
2. إعداد الحل بروتين الايلاستين مثل الأسهم
   1. إزالة برنامج القانون البيئي المجففة بالتبريد من مخزن 4 درجات مئوية. الحارة البروتين إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح أنبوب لضمان لا التكثيف يبني على البروتين على مدى الاستخدام المتكرر.
   2. حل برنامج القانون البيئي في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) في 4 درجات مئوية مع التحريض المستمر (أي.، الغزل) بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: تبدأ حل الأسهم التركيز سوف كذلك إضعاف بالإضافة إلى حل كروسلينكير بنسبة حجمية المعرفة من قبل المستخدم. على سبيل المثال، لتركيز برنامج القانون البيئي نهائي 3% (w/v)، إعداد برنامج القانون البيئي 3.75% (w/v) حل أسهم التي سوف تضعف بنسبة 4:1 حجمي للحل الحل: كروسلينكير برنامج القانون البيئي. ضبط تركيز اللازمة للتطبيق المطلوب.
   3. تصفية العقيمة حل مخزون برنامج القانون البيئي باستخدام عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر. تخزين برنامج القانون البيئي على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
3. في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، نقل قوالب عقيمة باستخدام ملاقط معقمة لصفيحة 24-جيدا-زراعة أنسجة.
4. إعداد تهبك الحل الأسهم
   1. تمييع تهبك في دببس السابقة فقط لاستخدام. ضبط تركيز تهبك الحل وفقا لتركيز برنامج القانون البيئي النهائي ونسبة crosslinking المرجوة.
      ملاحظة: للبروتوكول، سيجري تركيز برنامج القانون البيئي نهائي 3% (w/v) بمزج الحل تبدأ الأسهم مع الحل تهبك حجمي بنسبة 4:1. ضبط حسب الضرورة.
   2. إضافة 2.6 ميليلتر من محلول تهبك (80% في الماء) إلى 997.4 ميليلتر من دببس.
      ملاحظة: هذا التركيز تهبك يناظر نسبة 1:1 المقايسة مجموعات الميثيل هيدروكسي على تهبك والامينات الأولية على البروتين تبدأ عند خلط الحلول في وصف نسبة 4:1 الحجمي لنهائي 3% (w/v) ELP المائية. تهبك الحل لزج وقد عصا قطرات حل إلى الجانب من طرف ماصة. للتركيزات الدقيقة، تجنب مثل هذه القطرات عند تمييع في دببس. إزالة الحاوية تهبك الأسهم مع غاز النيتروجين لمنع أكسدة الفوسفين والمنظمة من كروسلينكير.
   3. دوامة الحل لخلط والحفاظ على الجليد.
   4. الأسهم تصفية العقيمة تهبك الحل باستخدام عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر. تمييع تهبك الأسهم الحل كذلك مع دببس العقيمة لتحقيق نسب crosslinking المقايسة أقل (على سبيل المثال-، 0.5:1 أو 0.75:1).
      ملاحظة: تهبك حساسة للأكسجين، وينبغي أن تستخدم الحل المخفف في غضون ساعات قليلة بعد إعداد.
5. فصل الخلايا بالحضانة مع التربسين أدتا إلى تعليق خلية واحدة وبيليه الخلايا عد الخلايا إعادة علقت في المتوسطة باستخدام هيموسيتوميتير.
   ملاحظة: البروتوكولات الدقيق لهذه الخطوة سوف تعتمد على نوع من الخلايا المطلوبة والتطبيق. وأجرى للخلايا العصبية السلف المستخدمة في جميع أنحاء هذا البروتوكول، حضانة يدتا التربسين 0.025% عند درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة 1.5. كانت القريبون الخلايا في 200 غ س ل 2 دقيقة. لبقاء الخلية زيادة، ينبغي تعليق الخلايا في ظروف عادية متوسطة. كثافة الخلية النموذجية المستخدمة للخلية تغليف تتراوح بين 1-50 10⁶ خلايا/مل من الحجم النهائي المائية. ضبط حسب الضرورة.
6. قاسمة العدد المطلوب من الخلايا في أنبوب معقم 1.5 مل أجهزة الطرد مركزي.
7. الطرد المركزي الخلايا في ز ~ 200 x للحد الأدنى 3 بعناية ونضح المادة طافية وإبقاء بيليه الخلية على الجليد.
   ملاحظة: من المهم لنضح تماما جميع المادة طافية للتخفيف من زيادة إضعاف crosslinker برنامج القانون البيئي وتهبك. وسوف تختلف سرعة الطرد المركزي الخاصة مع نوع الخلية.
8. إعادة تعليق بيليه الخلية في حل الأسهم برنامج القانون البيئي أن وحدة التخزين هي 80 في المائة حجم النهائي (على افتراض نسبة 4:1 لبرنامج القانون البيئي الحل: تهبك الحل). "الماصة؛" ميكس 20-25 مرة لإنتاج خليط متجانس من الخلايا وبرنامج القانون البيئي.
   ملاحظة: تجنب تجتاح الجزء السفلي من أنبوب للتخفيف من ارتفاع درجة الحرارة وانتقال المرحلة اللاحقة من برنامج القانون البيئي. يتطلب كل العفن 2 مم مع ثلاثة replicates ميليلتر 7.5 من الحجم النهائي (أي.، 6 ميليلتر حل مخزون برنامج القانون البيئي وميليلتر 1.5 تهبك الحل الأسهم) التساوي في الثقوب 3 (أي.، 2.5 ميليلتر الحجم النهائي لثقب). لقوالب مم 4 و 5، وحدة تخزين نهائي ميليلتر 7.5 وميليلتر 15.5 مطلوب، على التوالي.
9. إضافة حل تهبك الأسهم إلى تعليق خلية/برنامج القانون البيئي لوحدة التخزين النهائي 20 في المائة المتبقية. "الماصة؛" ميكس 20-25 مرة لإنتاج خليط متجانس.
10. فورا "الماصة؛" وحدات التخزين النهائي المقابلة الخليط خلية/برنامج القانون البيئي/تهبك إلى كل العفن بحركة دائرية. كرر كافة قوالب.
11. احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، متبوعاً حضانة إضافية في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: فترة الحضانة الأولى سيساعد في تسهيل كروسلينكينج الأولية للمائية قبل زيادة درجة الحرارة إلى أن أعلاه لكست لبرنامج القانون البيئي وتحريض، العزل الحراري المرحلة.
12. أضف ببطء 750 ميليلتر من مستنبت الخلية الحارة لكل بئر من لوحة 24-جيدا، وتجنب الإخلال بالمواد الهلامية.
13. احتضان الهلاميات المائية في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
    ملاحظة: كامل المتوسطة تغييرات ينصح كل 1-2 أيام تبعاً لنوع الخلية. للحد من الضغط على الهلام، استخدام زجاج ماصة باستور الملصقة مع 200 ميليلتر ماصة تلميح عندما يسفط المتوسطة من البئر.

3-إيمونوسيتوتشيميستري خلايا في الهلاميات المائية 3D برنامج القانون البيئي

1. تحضير تثبيت الحل بخلط 10 مل 16% (w/v) بارافورمالدهيد (PFA) في 30 مل دببس. الحارة الحل إلى 37 درجة مئوية.
2. نضح المتوسطة من لوحة 24-جيدا وتغسل برفق مع 1 مل دببس.
3. إضافة 750 ميليلتر لتثبيت الحل لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لا تستخدم حاضنة زراعة الأنسجة لتفادي تلوث ثقافات الأخرى مع بخار منهاج عمل بيجين.
4. نضح الحل التثبيت من كل بئر، تجاهل منهاج عمل بيجين إلى حاوية نفايات الخطرة مناسبة بعناية.
   تحذير: يمكن أن يسبب التعرض لمنهاج عمل بيجين تهيج الجلد والعيون. ارتداء قفازات/سلامة النظارات والعمل في غطاء الأبخرة كيميائية.
5. أضف 1 مل دببس لكل عينة. نضح دببس على الفور وتجاهل في حاوية النفايات في منهاج عمل بيجين.
6. تغسل العينات مرتين مع 1 مل دببس لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: يمكن تخزين العينات في دببس عند 4 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع بعد إغلاق اللوحة مع بارافيلم.
7. بيرميبيليزي كل عينة مع 750 ميليلتر لحل بيرميبيليزيشن (100 مل دببس و 0.25 مل من Triton X-100؛ ببست) ح 1 في درجة حرارة الغرفة على الروك 15 لفة في الدقيقة.
8. نضح في ببست وإضافة 750 ميليلتر من عرقلة الحل (مل 95 من برنامج تلفزيوني و 5 غ من ألبومين المصل البقري (BSA)، 5 مل من المصل و 0.5 مل من Triton X-100) لكل عينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 3 عن الروك 15 لفة في الدقيقة.
   ملاحظة: ينبغي أن يتضمن الحل حظر المصل من الأنواع المضيفة التي أثيرت فيها الأجسام المضادة الثانوية (مثلاً.، الماعز، والحمير) والعقيمة تصفيتها عن طريق 0.22 ميكرومتر تصفية قبل الاستخدام.
9. إعداد الحل تمييع جسم (97 مل دببس و 2.5 g لجيش صرب البوسنة، 2.5 مل من المصل (من الأنواع المضيفة نفسها كما في الخطوة 3، 8) و 0.5 مل من Triton X-100). تضعف جسم الأولية باستخدام الحل تمييع جسم وإضافة 500 ميليلتر من الحل لكل عينة. ختم اللوحة مع بارافيلم واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على الروك.
   ملاحظة: نيستين والأجسام المضادة Sox2 الأولية كانت المخفف 1: 400 في جسم تمييع الحل من تركيز الشركات المصنعة الأصلية.
10. نضح الحل الضد من كل عينة وغسل العينات مع ببست لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك 15 لفة في الدقيقة. كرر الخطوة يغسل 3 مرات.
11. تمييع الأسهم الأجسام المضادة و 5 ملغ/مل الثانوية DAPI (1:2، 000) باستخدام الحل تمييع جسم وإضافة 500 ميليلتر من الحل لكل عينة. تغطية لوحة 24-جيدا مع رقائق الألومنيوم واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على الروك.
    ملاحظة: كما الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء، ويجب حماية العينات من فوتوبليتشينج لجميع الخطوات اللاحقة. كانت الماعز الماوس المضادة والماعز الأرنب المضادة أضداد الثانوي المخفف 1: 500 في جسم تمييع الحل من تركيز الشركات المصنعة الأصلية.
12. نضح الحل الضد من كل عينة وغسل العينات مع ببست مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك. كرر الخطوة يغسل 3 مرات.
13. ضع قطره من تصاعد هاردسيت المتوسطة على سطح شريحة زجاجية. استخدام الملقط، إزالة الحل الزائدة من العفن باستخفاف النشاف على حافة القالب على منشفة ورقية. بدقة مكان العفن رأسا إلى المتوسطة المتصاعدة وتجنب إدخال فقاعات.
14. تسمح المتوسطة المتصاعدة لتصلّب على 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية. تسمح المتوسطة المتصاعدة لتعيين الكامل لح 48 قبل التصوير كما سيتم تغيير الانكسار المتوسطة على مدى تصلب. ختم العينات للشريحة غطاء الزجاج مع طلاء الأظافر واضحة للتخفيف من التلوث أو نموذج حركة.
15. صورة العينات باستخدام مجهر [كنفوكل].

ELPs المستخدمة في هذا البروتوكول وتتكون من خمس مناطق: علامة T7، العلامة His6، انتيروكيناسي (EK) الانقسام الموقع ومنطقة الحيوية النشطة ومنطقة مثل الايلاستين (الشكل 1). علامات T7 و His6 تسمح للكشف بسهولة عن طريق التقنيات القياسية لطخة غربية. مقدمة موقع الانقسام كرونة إستونية يسمح لإزالة الانزيمية المنطقة العلامة، إذا لزم الأمر. ترميز المنطقة الحيوية النشطة الموسعة، والمستمدة من فيبرونيكتين خلية لاصقة ('رجدس') أو تسلسلات غير لاصقة ('ردجس'). وأخيراً، تكرار وسط المنطقة مثل الايلاستين يحتوي على مجموعة يسين في موقع بقايا الضيف الذي تمكن crosslinking عبر تهبك بينما يكرر إطارية تتضمن آيسولوسين لتحقيق لكست ~ 32 درجة مئوية³¹.

يمكن استخدام وظيفة التعبير، والحزب الديمقراطي الصربي صفحة أو لطخة غربية لتصور الوزن الجزيئي وتأكيد هوية ELPs التي تحتوي على علامات جسم، مثل T7 (ماسمتجققمج) أو His6 (ههههه) (الشكل 2). التعبير ناجحة تحت ظروف خاضعة للرقابة غلة منتج متجانس جداً ممثلة بوجود عصابة مظلمة واحدة في الوزن الجزيئي التقريبي (كاتشين ~ 37) هذه البروتينات باستخدام كلا الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الشكل 2A) والغربية لطخة ( الشكل 2).

في ظروف غير المنضبط، وتقترح وجود انخفاض الوزن الجزيئي العصابات على وصمة عار غربية أن بعض جزء من البروتينات لم تترجم تماما و/أو قد تدهورت بعد التعبير (الشكل 2). على وجه التحديد، الجماهير هنا متباعدة بشكل متساو من كاتشين ~ 9 يقابل تقريبا وزن واحد من المنطقة الحيوية النشطة وثلاث مناطق مثل الايلاستين ('تكرار')، أو حوالي الساعة الرابعة من البروتين المستهدف. هذه الشظايا البروتين أصغر موجودة عادة عندما يجري التعبير عند درجة حرارة أعلى (> 32 درجة مئوية) كما في الشكل 2. يمكن أن يؤدي وجود هذه البروتينات انخفاض الوزن الجزيئي للخصائص الميكانيكية لا يمكن التنبؤ بها. ومن ثم، ينصح فحص وظيفة التعبير العادية لضمان جودة منتج نهائي.

يمكن تعديل صلابة ميكانيكية من الهلاميات المائية المستندة إلى برنامج القانون البيئي عن طريق التلاعب في تركيز برنامج القانون البيئي أو نسبة تهبك رد الفعل المجموعات: تبدأ الأمينات الأولية. وفي الوقت نفسه، يمكن ضبطها تركيز يغاندس لاصقة الخلية بتغيير نسبة المتغيرات تبدأ بالخلية-مادة لاصقة (رجدس) لغير لاصقة (ردجس) تسلسل داخل أي نظام صلابة. بالتعامل مع هذه المتغيرات اثنين، ونحن يمكن أن تنتج المواد الهلامية التي لها مجموعة من الخصائص الميكانيكية ويجند تركيزات (الشكل 3).

لتغليف الخلايا داخل 3D برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية، علقت على المديين المتوسط والعدد المطلوب من الخلايا وفصل لإنتاج بيليه خلية (الشكل 4 أ). المتوسط ويستنشق من الأنبوب، والخلايا إعادة تعليق موحد في الحل تبدأ التركيز المطلوب. المقبل، إضافة إلى تعليق خلية/برنامج القانون البيئي تهبك الحل وبيبيتيد جيدا لتكوين مزيج متجانس. هذا الحل بسرعة نقله إلى قوالب السيليكون العقيمة داخل صفيحة 24-جيدا باستخدام ماصة ويسمح التشعب في درجة حرارة الغرفة و 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة كل (الشكل 4 باء). أخيرا، إضافة إلى لوحة جيدا على المديين المتوسط والمحتضنة في 37 درجة مئوية في التجربة.

يعيش الميت تلطيخ يمكن استخدامها لتقييم جدوى الخلية وتغليف خلية ناجحة داخل برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية. كما هو موضح في الشكل 5، تظهر الخلايا السلف العصبية مورين الكبار (الشخصيات) صلاحية خلية عالية على مدى 7 أيام داخل المائية تبدأ 3% (w/v).

3D برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية قد ثبت سابقا لدعم صيانة الجذعية نواب يقاس من خلال التعبير عن المتعارف عليه علامات البروتين نواب جمهورية يوغوسﻻفيا (الجنس تحديد المنطقة Y)-المربع 2 (Sox2) و نيستين⁹. الشخصيات مغلفة في الهلاميات المائية تبدأ 3% (w/v) مع انخفاض تهبك crosslinking إظهار التعبير عالية Sox2 النووية المترجمة وخيوط نيستين هيولى عبر إيمونوستينينج وتصوير [كنفوكل] (الشكل 6).

الشكل 1 : تمثيل تخطيطي لبرنامج القانون البيئي وسلاسل الأحماض الأمينية المناظرة. برنامج القانون البيئي المستخدمة في هذه الدراسة يتضمن علامة T7 و His6 للتصوير القائم على جسم ومنطقة النشطة بيولوجيا لإدخال نطاقات الخلية لاصقة في منطقة إيلاستين-مثل أن يضفي مرونة الخواص الميكانيكية ويسمح ل crosslinking الكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : يمكن أن يتم التحقق من صحة التعبير البروتين الهدف مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ووصمة عار الغربية التأكد من الوزن الجزيئي وهوية للمنتج النهائي المجففة بالتبريد. تبدأ كامل طول النقي يعمل في وزن الجزيئي من كاتشين 37 كما أفاد كل من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (A) ووصمة عار الغربية استخدام T7 (ماسمتجققمج) أو الحامض الأميني 6 (ههههه) العلامة (ب)- (ج). يمكن أن يؤدي النجسة دفعات تبدأ بسبب الانحرافات في البروتوكول التعبير تبدأ بالتعبير عن ELPs مع الأوزان الجزيئية أقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: RGDS يجند المحتوى يمكن ضبطها بشكل مستقل من الخواص الميكانيكية داخل برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية- 5% (w/v) و 3% (w/v) ELP الهلاميات المائية قد بواقي القص من ~ 800 ~ 400 السلطة الفلسطينية والسلطة الفلسطينية، على التوالي. الهلاميات المائية بنسبة 1:1 تهبك رد الفعل المجموعات: تبدأ الأمينات الأولية كروسلينكيد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، يسخن إلى 37 درجة مئوية، وسمحت لحجته لمدة 5 دقائق قبل القياس. تكون البيانات يعني ± التنمية المستدامة، *ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

4 الرقم: التخطيطي لتغليف الخلايا في برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية- (أ). في البداية هي فصل الخلايا في تعليق خلية واحدة في المتوسط والأعلاف باستخدام أجهزة الطرد مركزي. المتوسط ويستنشق من الأنبوب، وإعادة تعليق في حل برنامج القانون البيئي في تركيز المطلوب الخلايا والمختلطة بشكل جيد. وأخيراً، أضيف الحل crosslinking تهبك والمختلطة بشكل جيد. (ب)- فور إضافة تهبك، يلقي الحل في قالب سيليكون مع ماصة. مسموح بالحل أن التشعب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة متبوعاً حضانة 15 دقيقة ثانية عند 37 درجة مئوية. ثم يتم إضافة الوسيلة للثقافة جيدا طوال فترة التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

5 الرقم: الخلايا العصبية السلف المحافظة على استمرارية عالية في برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية- صورة تمثيلية للخلايا العصبية السلف مغلفة في 3% (w/v) ELP الهلاميات المائية مع كروسلينكينج 1:1 (تهبك رد الفعل المجموعات: تبدأ الأمينات الأولية) بعد 7 أيام في الثقافة. الأخضر: العيش المصبوغة (كالسين AM)؛ الأحمر: الميت تلوين (اثيديوم هوموديمير). شريط المقياس = 100 ميكرومتر.

الرقم 6 : دعم 3D برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية السلف العصبية الخلايا الجذعية صانع التعبير. صورة الفلورة من الخلايا العصبية السلف الإعراب عن Sox2 ونيستين البروتينات بعد 7 أيام للثقافة في برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية. صور تظهر الخلايا مغلفة في 3% (w/v) ELP الجل مع 0.5:1 كروسلينكينج (تهبك رد الفعل المجموعات: تبدأ الأمينات الأولية). الأزرق: DAPI (نويات)؛ الأحمر: Sox2؛ الأخضر: نيستين. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تعبير البروتين المؤتلف وتنقية أداة قوية لتجميع المواد الحيوية مع إمكانية تكرار نتائج عالية. يرجع ذلك إلى حد كبير إلى ظهور الاستنساخ الجزيئي تجارياً، والبلازميدات المؤتلف مخصصة يمكن شراؤها من عدة موردين، مما يقلل كثيرا من الوقت للعمل مع مواد مثل ELPs. وبالمثل، يمكن طلب والبلازميدات مباشرة من المعمل الأصلي عندما أيد اتحادية عقد العمل الأصلي والأعمال المقبلة ستكون للاستخدام غير ربحية. تسلسل الأحماض الأمينية ELP الكاملة نشرت سابقا لعدة متغيرات تبدأ³¹. ومع ذلك، تنطوي العملية على من التعبير لتنقية البروتينات المؤتلف في نهاية المطاف اتخاذ عدد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن يؤدي عادة إلى انخفاض الغلال أو انخفاض جودة منتج. تنشأ بعض القضايا الأكثر شيوعاً لإعداد برنامج القانون البيئي في أحد الأمور التالية: (1) جودة المخزونات البكتيرية المخزنة، (2) أول التجميد أذاب دورة لزعزعة الأغشية البكتيرية، وتنقية البروتين (3) من خلال ركوب الدراجات الحرارية.

يوجد فرق كبير بين التعبير البروتين وغيره من الوسائل غير البيولوجية لإنتاج مواد هو أننا الاستفادة من إليه المضيفين المؤتلف توليف البوليمرات البيولوجية. وبعد ذلك، يأتي هذا الأسلوب مع وجود قيود فريدة من نوعها: الخلوية الموت أو الضرر. موت الخلية يظهر نفسه كتخفيض عدد المستعمرات البكتيرية الأكثر شيوعاً بعد streaking لوحة أو المستعمرات طبيعي الصغيرة التي تنمو ببطء نسبيا. الأرصدة البكتيرية، إذا حافظت بعناية، يمكن أن تظل مستقرة لسنوات؛ ومع ذلك، دورات تجميد أذاب المتعاقبة بسبب الفشل المتكرر في الاستخدام أو المجمد تقليل بقاء الخلية أو تؤدي إلى تلف الحمض النووي. استخدام نموذجي الأرصدة البكتيريا BL21 بين 10% و 40% والغليسيرول بحجم مختلطة مع الخلايا مع وقف التنفيذ. يهدف الجلسرين لتقليل الضرر غشاء من نوكلياتينج بلورات الثلج أثناء التجميد. ولذلك، باستخدام تركيزات منخفضة (< 10%) يمكن أن يؤدي إلى غشاء المساس بها، بينما تركيزات أعلى (> 40 ٪) يمكن قمع نقطة التجمد بما فيه الكفاية بحيث تجمد الرصيد ابدأ مما يؤدي إلى موت الخلية. ومع ذلك، حتى داخل مستويات والغليسيرول الأمثل، الأرصدة البكتيرية لا ينبغي تماما ذوبان مزيجاً من الضرر الغشاء من الآثار السامة للخلايا وإعادة التجميد من الجلسرين يمكن أن يؤدي إلى تقليص صلاحية الأسهم وتلف الحمض النووي. ولذلك، إذا لوحظ أن نتائج أسهم بكتيرية في عد مستعمرة منخفضة أو أن يتم تقسيم الخلايا بمعدل بطيء دائماً (يتبدى₆₀₀ OD بطء معدل منحدر خلال التعبير)، إعادة تحويل بلازميد وجعل مخزون جديد بسيط النهج الأول استكشاف هذه المشكلة وإصلاحها. مع هذا في الاعتبار، لضمان صيانة طويلة الأجل من مخزونات البكتيرية وسلامة الحمض النووي، فمن الأفضل لتخزين نسخ الخاص بك بلازميد تنقية الحمض النووي المجمد في الماء ولا داخل الخلايا. وسيكفل تخزين الحمض النووي بهذه الطريقة أن في الأحداث غير المتوقعة مثل الأسهم الفاشلة أو الإخفاق في الثلاجة، يمكن استخدام مصدر موثوق من الحمض النووي الأصلي للتحول.

خطوة حاسمة أخرى في تصنيع برنامج القانون البيئي هو تنقية البروتين المستهدف من المضيف التعبير. استخراج البروتين من كولاي يتحقق عن طريق كسر جدار الخلية باستخدام بلورات الثلج نوكلياتينج التي تشكل في جميع أنحاء الخلية علقت ليساتي عند التجميد، والتي تزداد مع دورات تجميد أذاب المتعاقبة. يمكن أن تستخدم أساليب بديلة لتمزيق جدار الخلية مثل سونيكيشن أو صحافة. على وجه الخصوص، على التوالي ذوبان التجميد لمفيد إلا أنه يتطلب ثلاجة ولا غيرها من المعدات المتخصصة. ومع ذلك، هذا الإجراء نونسبيسيفيكالي النشرات الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والملوثات البروتين، بالإضافة إلى البروتياز التي يحتمل أن تؤدي إلى تدهور البروتين الهدف. ولذلك، لتجنب التلوث وانخفاض الغلة، ديوكسيريبونوكليسي أنا (الدناز) وفلوريد فينيلميثانيسولفونيل (بمسف) تضاف إلى الخلية للحط من الحمض النووي وتمنع البروتياز، على التوالي. وجود الحمض النووي قبل إضافة الدناز يمكن ملاحظة بصريا كمظهر 'مفتول العضلات' في جميع أنحاء الخلية إعادة تعليق بعد ذوبان الجليد الأولى. الدناز يحط بنشاط هذا الحمض النووي، ومما يقلل من لزوجة الخلية مما يجعل من الأسهل لتنقية عن طريق الطرد المركزي. يمكن تأكيد كسر الأمثل للحمض النووي بصريا بضمان أن الخلية ليستي السائل تماما على ما يبدو وأن مظهر مفتول العضلات لم تعد مرئية. وقد لاحظنا في الممارسة أن إضافة ملغ ~0.1 من الدناز كل خلية مل ليستي كافية لتحقيق تدهور اللازمة. ومع ذلك، إذا كان لا يزال يلاحظ وجود الحمض النووي، الدناز أكثر يمكن إضافة يتبع قبل ساعتين أو ثلاث ساعات إضافية للتحريض. كما يمكن أن تنشأ مشكلة مشابهة إذا تم إضافة الدناز قبل الأوان من قبل أي من كان يحتمل أن ذوبان الجليد بما فيه الكفاية. في هذه الحالة، يمكن الحد من درجات الحرارة الأكثر برودة كفاءة تدهور الحمض النووي نظراً للمنظمة قبل الأوان من الدناز. لتجنب هذه المشكلة، هو غالباً أفضل الممارسات للسماح لبيليه إعادة مع وقف التنفيذ لذوبان الجليد لمدة 8 ساعات تقريبا قبل المعالجة مع الدناز. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان ترد الغلات منخفضة البروتين وتفكك الحمض النووي كانت كافية، قد يلزم إضافة مزيد من بمسف المساعدة في الحد من زيادة تدهور البروتين المحتملة من البروتياز.

وتشمل الاعتبارات الإضافية لضمان التعبير الأمثل عن ELPs فهم دقيق للفوائد والقيود المفروضة المضادات الحيوية المختارة. هنا، كانت تستخدم ناقلات pET15b التي تحتوي على جينات مقاومة الأمبيسلّين تعبير البروتين. وظيفيا، سلسلة ناقلات الحيوانات الأليفة تسمح للتعبير البروتين كبيرة مع ما يصل إلى 50% عن التعبير البروتين في بكتيريا مخصصة للبروتين الهدف بعد^32،توجيهي ناجح³³. ومع ذلك، يأتي الأمبيسلّين كما اختيار المضادات الحيوية مع بعض القيود التي قد تتداخل مع التعبير الأمثل. أولاً، يمكن أن يحدث تدهور الأمبيسلّين حضور كولاي سريعاً بسبب إطلاق سراح بيتا-lactamase. إذا كانت كمية كافية من الأمبيسلّين المتدهورة، بلازميد الأمبيسلّين الترميز (أي بلازميد ترميز برنامج القانون البيئي) قد تكون فقدت تماما. كنتيجة لذلك، عندما أعرب عن ELPs لمدد أطول، مستويات البروتين التعبير بعناية رصداً في نقاط زمنية متتالية لضمان قدر كاف من الجينات ترميز برنامج القانون البيئي لا يزال السماح للتعبير المرغوب فيه. وتشمل الأساليب الممكنة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها تراكم lactamases بيتا الغزل أسفل ثقافة كاتب وتعليق إعادة الخلايا في المتوسط خالية من المضادات الحيوية قبل تطعيم وسيلة التعبير. هذه العملية فعالية يحد من نقل اللاإنسانية المضادات الحيوية الإنزيمات ويضمن جزء أكبر من الخلايا تحتوي على ناقل المستهدفة-البروتين-ترميز. بالإضافة إلى ذلك، قد الأمبيسلّين فترة صلاحية محدودة لما يقرب من أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. ولذلك، يجب تخزين لوحات الثقافة للتعبير البروتين عند 4 درجة مئوية كحد أقصى لمدة أسبوعين قبل الاستخدام. أخيرا، لضمان فعالية الأمبيسلّين داخل وسائط الإعلام كاتب والتعبير، الحل الأمبيسلّين الأسهم يجب أن تكون الطازجة المنتجة فورا قبل استخدام، كما التخزين على المدى الطويل قد يؤدي إلى المضادات الحيوية أقل فعالية.

وجود لكست يسمح لتنقية ELPs بسيطة عن طريق ركوب الدراجات الحرارية. على وجه التحديد، في درجة حرارة أعلى، وفي حضور الأملاح، تسبب القوات انتروبيك ELPs يصبح أقل قابل للذوبان وتشكل فيما بعد مرحلة كواسيرفاتي الغنية البوليمر. من ناحية أخرى، تظل قابلة للذوبان ELPs عند درجات حرارة منخفضة، وسهولة يذوب في الحل. ركوب الدراجات الهوائية بين هذين النظامين هما درجة الحرارة مقترنة بخطوات استخدام الطرد المركزي لجمع وتجاهل المرحلة التي تحتوي على برنامج القانون البيئي تباعا ويركز البروتين ويقلل في نفس الوقت بوجود ملوثات غير برنامج القانون البيئي.

ومع ذلك، هناك عدد من المراحل حيث يمكن أن يضيع ELPs في عملية تنقية هذه. أولاً، قبل كل تدور الباردة، هو الكاليزيد الحل الذي يحتوي على بروتين للرقم الهيدروجيني 9.0. يخدم هذا الرقم الهيدروجيني أعلى إلى ديبروتوناتي بعض الأحماض الأمينية في البروتين العمود الفقري، فعالية تركهم في حالة مشحونة ومواصلة تعزيز هذه القابلية للذوبان. ونتيجة لذلك، ما سبق هذه الخطوة أو عدم إتاحة وقت كاف لانحلال البروتين يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في العائد البروتينات غير سولوبيليزيد سوف تكون القريبون أثناء الطرد المركزي والتخلص منها.

وبالمثل، البروتينات المستهدفة يمكن فقدان أثناء الإجراء تدور الساخنة عندما هو القريبون في برنامج القانون البيئي. في البداية، يتم إضافة كلوريد الصوديوم المادة طافية الغنية بالبروتين الحد من قابلية الذوبان لبرنامج القانون البيئي. تعمل الأملاح درع الالكتروستاتيكي التفاعلات بين جزيئات البروتين والماء، مما تسبب في البروتين لفصل من المرحلة المائية. هذا التأثير يتم تضخيمه بتدفئة الحل، التي، بسبب آثار انتروبيك، كذلك ينهار الأوبئة 'القفص' المحيطة ELPs والقوات بتجميع البروتينات. في تركيزات أقل من البروتين (أي.، أول دورة حرارية)، إضافة الأملاح وحدها غير كافية لتتسبب في هذه المرحلة فصل غالباً. ومع ذلك، كتركيز البروتين يزيد (أي.، دورات حرارية في وقت لاحق)، وهناك أقل ملوثات ثانوية للتفاعل مع الأملاح، وسوف يعجل برنامج القانون البيئي أكثر سهولة. كنتيجة لذلك، إذا تم إضافة الأملاح بسرعة كبيرة جداً، أنها قد تصبح جسديا المحاصرين بتجميع البروتينات، التي فعالية يقلل من تركيز الملح من الحل ويحد من زيادة هطول الأمطار البروتين. ومن ثم، ينبغي إضافة الملح في ثلاث دفعات صغيرة لضمان لديهم الوقت الكافي لتوزيع المتجانس من خلال الحل. وكملاحظة أخيرة، الاختلافات بالأساس برنامج القانون البيئي، أما من خلال مزيد من التعديلات على بقايا ضيف للمنطقة مثل الايلاستين أو التغييرات في المنطقة النشطة الحيوية يمكن أن يؤثر بشكل ملحوظ في سلوك لكست. ونتيجة لذلك، لضمان إنتاج البروتين الأمثل عبر المتغيرات البروتين، من الأهمية بمكان لتحسين درجة الحموضة وتركيز الملح، ونوع الملح (مثلاً. أو الفموي الأحادي التكافؤ أو ديفالينت) ليدور الباردة والساخنة.

من المستحسن تشغيل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عند استكمال البروتوكول هو كما يمكن استخدامه لتحديد بسهولة من حدوث خسائر كبيرة في برنامج القانون البيئي خلال أي من الخطوات تنقية. باختصار، إذا تم الكشف عن برنامج القانون البيئي في المادة طافية بعد تدور ساخنة، ثم البروتين هو لا يجري فعلياً عجل. وبالمثل، إذا حددت ELPs في عينة من solubilized بيليه عقب تدور باردة، ثم البروتين هو عدم فعالية حله.

برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية تقدم العديد من المزايا عبر المواد التركيبية أو المستمدة من طبيعة الحال. على وجه التحديد، يتيح استخدام crosslinker أمين المتفاعلة تهبك إليه منخفضة التكلفة وبسيطة والانضباطي للبروتين كروسلينكينج. ومع ذلك، هناك قيود متميزة ضمن البروتوكول crosslinking تجدر الإشارة. تهبك الأكسجين حساسة، وإذا مخزنة في ظروف غير ملائمة، يمكن أن يتدهور بسرعة في رد فعل الكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، بسبب ما تفاعلية مع الأمينات الأولية، تهبك قد تتفاعل مع المحيطة بالبروتينات في وسائل الإعلام أو تلك على سطح الخلية التي غنية في الأمينات. ولذلك، عند تشكيل برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية، من المستحسن لتجنب تلوث وسائل الإعلام مع بيليه خلية لتقليل البروتين خارجية ممكن ه، ومن ثم تخفيض في الكفاءة كروسلينكينج. أخيرا، هذه الآلية crosslinking ويحول دون تسلسل المنطقة الحيوية النشطة لتلك التي تحتوي على لا بقايا يسين وهكذا، يحد من إمكانية إدراج بعض زخارف لاصقة خلية (على سبيل المثال-، إيكفاف³⁴). لمعالجة هذه القيود، التعديلات بالأساس برنامج القانون البيئي بأزيد وبيسيكلونونيني (BCN) رد فعل الشركاء يسمح crosslinking متعامد الحيوية، كما هو موضح سابقا²⁷.

تجدر الإشارة إلى أن سلوك لكست برنامج القانون البيئي يلعب دوراً هاما في إملاء المجهرية المائية. في درجة حرارة الأنظمة أعلاه لكست، ELPs يعجل بالخروج من حل يؤدي إلى تشكيل المراحل الغنية بالبروتين ونقص البروتين التي يمكن أن تؤثر في مصفوفة المسامية والكفاءة كروسلينكينج ل مصفوفة⁹. نظراً لأن معظم الخلايا الثقافة التجارب في درجات حرارة فسيولوجيا ذات الصلة (~ 37 درجة مئوية) أعلى لكست برنامج القانون البيئي، ينبغي النظر هذه الآثار. الهلاميات المائية فعالية من التشعب وشكل شبكة مترابطة من بروتين، أمين الأولية من يسين يجب أن يكون موجوداً فعلياً إلى crosslinker تهبك. إذا كان التجميع برنامج القانون البيئي يحدث قبل بلوغ crosslinking كافية، قد يكون ELPs محاصرين داخل المرحلة الغنية بالبروتين وبالتالي غير قادر على المشاركة في كروسلينكينج ولا يمكن الوصول إليها. لمعالجة هذا القيد، لدينا البروتوكول يتطلب فترة crosslinking أولى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، الذي يسمح ل crosslinking الأولية للمائية قبل أن يخضع برنامج القانون البيئي المرحلة الانتقالية مرحلة الحرارية. ويعقب هذا حضانة درجة حرارة الغرفة حضانة 15 دقيقة إضافية في 37 درجة مئوية وضع اللمسات الأخيرة على كروسلينكينج المائية. هذا الإجراء ضروري لكافية crosslinking وجيلاتيون قوية واستنساخه من مواد برنامج القانون البيئي.

وفي الختام، تقدم البروتين المؤتلف الهلاميات المائية ملفقة باستخدام برنامج القانون البيئي ألواح استثنائية تسلسل البروتين، وبالتالي المكروية خلية ثلاثية الأبعاد. البوليمرات برنامج القانون البيئي قد أظهرت أن يكون تعريب في غلة عالية، تنقيتها بسهولة نظراً لسلوكهم لكست، ومتوافق حيويا في مجموعة متنوعة واسعة من النظم في المختبر و في فيفو . استخدام كولاي كمضيف المؤتلف يوفر إجراءات بسيطة وغير مكلفة التي تثير بالقرب من الكمال السيطرة على الوزن الجزيئي بوليمر والأداء الوظيفي. بالتزامن، يسمح هذا الأسلوب لألواح قوية وإمكانية تكرار نتائج منهاج المائية مما يسمح للثقافة من طائفة واسعة من أنواع الخلايا في 3D. أخيرا، من هذه المنصة المائية برنامج القانون البيئي قابلة للعديد من فحوصات الكيمياء الحيوية المتلقين للمعلومات بما في ذلك قرة-بكر، لطخة غربية واستخراج الحمض النووي وخلية إيمونوستينينج⁹.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يشكر المؤلفون "بالمر ت." ويستخدم أبو حاء (جراحة الأعصاب في جامعة ستانفورد) لتوفير مورين الشخصيات. ناقل الفن في الشكل 4 ومقتبسة من الفن الطبي Servier تحت "الإبداعي العزو 3.0 Unported الترخيص" (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). جزء من هذا العمل قد أنجز في ستانفورد نانو تقاسم مرافق (سنسف)، التي تدعمها "مؤسسة العلوم الوطنية" تحت جائزة ECCS-1542152. تسلم N.A.S. بدعم من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "المعاهد الوطنية للصحة" (32 جنرال موتورز 008412). وتسلم C.M.M. الدعم من المعاهد الوطنية للصحة الفيدرالية زمالة الدكتوراه قبل (F31 EB020502) و "برنامج الباحثين سيبيل". تسلم S.C.H. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (AI116484 آسيا تحت 19 عاماً و R21 EB018407) والمؤسسة الوطنية للعلوم (1508006 هيئة الهجرة واللاجئين)، ومعهد كاليفورنيا "الطب التجديدي" (RT3-07948). هذا البحث وتلقى تمويل من التحالف من أجل التجدد التأهيل الأبحاث والتدريب (ع³تي)، الذي يدعمه "يونيس كينيدي شرايفر الوطني معهد صحة الطفل" والتنمية البشرية (NICHD)، المعهد الوطني الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS)، والمعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية (نيبيب) من المعاهد الوطنية للصحة بموجب قرار التحكيم رقم P2CHD086843. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة آراء "المعاهد الوطنية للصحة".