Method Article
Le protocole fournit une méthode détaillée d’imagerie neuronale dans une tranche de cerveau à l’aide d’une méthode de nettoyage destissus, Sca l eSF. Le protocole comprend la préparation des tissus cérébraux, la clarification des tissus, la manipulation des tranches nettoyées et l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser des structures neuronales, des niveaux mésoscopiques aux niveaux microscopiques.
Un protocole détaillé est fourni ici pour visualiser les structures neuronales des niveaux mésoscopiques aux niveaux microscopiques dans les tissus cérébraux. Les structures neuronales allant des circuits neuronaux aux structures neuronales subcellulaires sont visualisées dans des tranches de cerveau de souris optiquement nettoyées avec ScaleSF. Cette méthode de nettoyage est une version modifiée de ScaleS et est une méthode de nettoyage des tissus hydrophiles pour les tranches de tissu qui permet d’obtenir une capacité de nettoyage puissante ainsi qu’un haut niveau de préservation des signaux de fluorescence et de l’intégrité structurelle. Une chambre d’imagerie tridimensionnelle (3D) personnalisable est conçue pour un montage fiable des tissus cérébraux nettoyés. Les cerveaux de souris injectés avec un vecteur viral adéno-associé porteur d’un gène de protéine fluorescente verte amélioré ont été fixés avec 4% de paraformaldéhyde et coupés en tranches de 1 mm d’épaisseur avec une trancheuse de tissu vibrante. Les tranches de cerveau ont été éliminées en suivant le protocole de nettoyage, qui comprend des incubations séquentielles dans trois solutions, à savoir la solution ScaleS0, la solution saline tampon phosphate (–) et la solution ScaleS4, pour un total de 10,5 à 14,5 h. Les tranches de cerveau nettoyées ont été montées sur la chambre d’imagerie et incorporées dans du gel d’agarose à 1,5% dissous dans la solution ScaleS4D25(0). L’acquisition d’images 3D des tranches a été réalisée à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal équipé d’une lentille d’objectif multi-immersion d’une longue distance de travail. En commençant par l’imagerie neuronale mésoscopique, nous avons réussi à visualiser de fines structures neuronales subcellulaires, telles que les épines dendritiques et les boutons axonaux, dans les tranches de cerveau optiquement dégagées. Ce protocole faciliterait la compréhension des structures neuronales des circuits aux échelles des composants subcellulaires.
Les méthodes de nettoyage des tissus ont amélioré l’imagerie indépendante de la profondeur des échantillons biologiques et cliniques avec la microscopie optique, permettant l’extraction d’informations structurelles sur des tissus intacts 1,2. Les techniques de nettoyage optique pourraient également accélérer et réduire le coût de l’analyse histologique. À l’heure actuelle, trois grandes approches de défrichage sont disponibles : les méthodeshydrophiles, hydrophobes et à base d’hydrogel 1,2. Les approches hydrophiles surpassent en préservant les signaux de fluorescence et l’intégrité des tissus et sont moins toxiques que les deux autres approches 3,4.
Une méthode de nettoyage hydrophile, ScaleS, occupe une position distinctive avec sa préservation de l’intégrité structurelle et moléculaire ainsi que sa puissante capacité de nettoyage (spectre de clairance-préservation)5. Dans une étude précédente, nous avons développé un protocole de nettoyage rapide et isométrique, ScaleSF, pour les tranches de tissu (~1 mm d’épaisseur) en modifiant la procédure de nettoyage de ScaleS6. Ce protocole de nettoyage nécessite des incubations séquentielles de tranches de cerveau dans trois solutions pendant 10,5 à 14,5 h. La méthode est dotée d’un spectre de conservation de clairance élevé, compatible même avec l’analyse par microscopie électronique (EM) (figure supplémentaire 1), permettant une imagerie tridimensionnelle (3D) haute résolution à plusieurs échelles avec une reconstruction précise du signal6. Ainsi, ScaleSF devrait être efficace en particulier dans le cerveau, où les cellules neuronales élaborent des processus exubérants d’une longueur énorme et organisent des structures subcellulaires fines spécialisées pour transmettre et recevoir des informations. L’extraction d’informations structurelles avec des échelles allant du circuit aux niveaux subcellulaires sur les cellules neuronales est très utile pour mieux comprendre les fonctions cérébrales.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour visualiser les structures neuronales avec des échelles allant du niveau mésoscopique / circuit au niveau microscopique / subcellulaire en utilisant ScaleSF. Le protocole comprend la préparation des tissus, la clarification des tissus, la manipulation des tissus nettoyés et l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) des tissus nettoyés. Notre protocole se concentre sur l’interrogation des structures neuronales des circuits aux échelles des composants subcellulaires. Pour une procédure détaillée de préparation des solutions et d’injection stéréotaxique de vecteurs du virus adéno-associé (AAV) dans le cerveau des souris, se référer à Miyawaki et al. 20167 et Okamoto et al. 20218, respectivement.
Toutes les expériences ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Juntendo (approbation n° 2021245, 2021246) et réalisées conformément aux Directives fondamentales pour la bonne conduite des expériences sur les animaux par le Conseil scientifique du Japon (2006). Ici, des souris mâles C57BL/6J injectées avec un vecteur AAV porteur du gène de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) et de la parvalbumine (PV)/myristoylation-EGFP-récepteur des lipoprotéines de basse densité C-terminal chromosome artificiel bactérien (BAC) souris transgéniques (souris PV-FGL)9 ont été utilisées. Les souris PV-FGL ont été maintenues en fond C57BL/6J. Aucune différence fondée sur le sexe n’a été observée en ce qui concerne cette étude.
1. Préparation des tissus
2. Clarification des tissus
NOTE: Les compositions des solutions ScaleS utilisées sont énumérées dans le tableau 1. Les échantillons doivent être protégés de la lumière en les recouvrant d’une feuille d’aluminium. Les étapes de compensation sont illustrées à la figure 1A.
3. Montage de tranches de cerveau
REMARQUE : Une chambre d’imagerie personnalisable est utilisée pour un montage fiable des tranches de cerveau nettoyées (Figure 2)6. La chambre se compose du cadre de la chambre et du couvercle inférieur. Les adaptateurs d’étage de microscope sont également conçus pour monter directement la chambre d’imagerie sur les étages de microscope (Figure 2A,B). Les adaptateurs de monture de chambre et d’étage de microscope peuvent être imprimés en 3D à l’aide de services d’impression 3D internes ou externalisés. Les données de conception assistée par ordinateur (CAO) 3D de la chambre d’imagerie sont fournies dans Furuta et al. 20226.
4. Imagerie CLSM
Le nettoyage optique d’une tranche de cerveau de souris de 1 mm d’épaisseur a été réalisé à l’aide de ce protocole. La figure 1B représente les images de transmission d’une tranche de cerveau de souris avant et après le traitement de nettoyage. La méthode de nettoyage des tissus a rendu transparente une tranche de cerveau de souris de 1 mm d’épaisseur. Une légère expansion de la taille finale des tranches de cerveau a été constatée après l’incubation dans la solution de clairance pendant 12 h (expansion linéaire: 102,5% ± 1,3%). La préservation de la fluorescence et de l’intégrité structurelle des tissus a été évaluée avec une expression ciblée de l’EGFP dans la membrane plasmique chez les souris PV-FGL (Figure 1C). Chez ces souris, l’EGFP ciblant la membrane somatodendritique est exprimée dans les neurones PV positifs9. L’expression de l’EGFP ciblant la membrane plasmique dans la région somatodendritique a été maintenue après le traitement (Figure 1C). De plus, l’étude EM précédente montre une intégrité structurelle bien préservée dans les tissus cérébraux nettoyés avec ScaleSF (Figure supplémentaire 1)6.
Les aberrations induites par l’incompatibilité de l’IR ont entraîné une perte notable de luminosité et de résolution de l’image (Figure 3). Une tranche cérébrale de 1 mm d’épaisseur de souris PV-FGL a été nettoyée et imagée sous un CLSM équipé d’un objectif multi-immersion d’un long WD. L’ajustement du collier de correction de l’objectif à la position de l’objectif à la position de l’eau (RI 1.33) a entravé la visualisation claire des neurones EGFP positifs situés à des profondeurs de 400 μm et 800 μm en raison de la faible luminosité et du faible contraste. (Figure 3A,C). Ces neurones ont été clairement visualisés avec le même CLSM, lorsque le collier de correction a été ajusté pour correspondre à la solution ScaleS4 (RI 1.47; Figure 3B,D). L’appariement de l’IR entre un fluide d’immersion et une lentille d’objectif est essentiel pour une imagerie 3D précise dans les tissus optiquement nettoyés.
Enfin, des neurones néocorticaux de souris ont été utilisés pour démontrer la faisabilité du protocole. Un cerveau de souris injecté avec le vecteur AAV2/1-SynTetOff-EGFP10 dans le cortex somatosensoriel primaire (S1) a été fixé avec 4% de PFA dans 0,1 M PB. Des tranches coronales de 1 mm d’épaisseur ont été préparées à partir du cerveau avec une trancheuse de tissu vibrante. Après le nettoyage et le montage sur la chambre d’imagerie, une imagerie neuronale ciblant les neurones néocorticaux a été réalisée (Figure 4). Une reconstruction 3D de neurones marqués EGFP dans la tranche cérébrale de 1 mm d’épaisseur est représentée à la figure 4A. Une image à grossissement plus élevé montre des tonnelles dendritiques individuelles décorées d’épines dendritiques (Figure 4B). Nous avons également montré des arborisations terminales axonales et des boutons axonaux dans le cortex controlatéral (Figure 4C).
Figure 1: Nettoyage optique de tranches de cerveau de souris de 1 mm d’épaisseur. (A) Le calendrier de nettoyage des tissus ScaleSF. (B) Images de transmission d’une tranche de cerveau de 1 mm d’épaisseur avant (à gauche) et après (à droite) le traitement. (C) Un rendu volumique 3D du cortex cérébral d’une souris PV-FGL nettoyé à l’aide de la méthode de nettoyage des tissus. (D,E) xy images en (C) à des profondeurs de 250 μm (D) et 750 μm (E). (F,G) Vue agrandie des rectangles décrits en (D) et (E). Les images apparaissant en (C-G) sont déconvolutées avant le processus de rendu. Abréviations : pia = pia mater, WM = substance blanche. Barre d’échelle : 2 mm in (B), 500 μm in (C), 200 μm in (D,E) et 40 μm in (F,G). Ce chiffre a été modifié à partir de Furata et al. 20226. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Une chambre d’imagerie personnalisable imprimée en 3D pour la visualisation de tranches de tissu. (A,B) Dessin de schéma (A) et image (B) d’une chambre d’imagerie personnalisable imprimée en 3D. La chambre d’imagerie est composée d’un cadre de chambre, d’un couvercle inférieur et d’adaptateurs de scène de microscope. Les tranches de tissu nettoyées sont placées sur le couvercle inférieur et incorporées dans le gel ScaleS4. Le cadre de la chambre, le couvercle inférieur et les adaptateurs de scène de microscope sont personnalisables en fonction de la taille et de l’épaisseur des tranches de tissu. (C) Une installation d’imagerie avec la chambre d’imagerie. La chambre d’imagerie est immergée dans la solution ScaleS4 dans une boîte de Pétri et montée sur une scène d’un CLSM vertical. Ce chiffre a été modifié à partir de Furata et al. 20226. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Imagerie profonde compromise causée par une inadéquation de l’IR entre une lentille d’objectif et une solution ScaleS4. (A-D) images xy du cortex cérébral d’une souris PV-FGL à des profondeurs de 400 μm (A, B) et 800 μm (C, D). La correction du collier d’un objectif multi-immersion est ajustée à 1,33 po (A, C) et 1,47 po (B, D). Les images sont acquises avec les mêmes paramètres, à l’exception des RI de l’objectif. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Imagerie neuronale dans une tranche de cerveau de souris de 1 mm d’épaisseur nettoyée avec ScaleSF. (A) Rendu de volume 3D de neurones néocorticaux de souris marqués EGFP dans le S1. Les neurones néocorticaux sont marqués avec le vecteur AAV2/1 SynTetOff-EGFP. (B) Tonnelles dendritiques de neurones néocorticaux marqués EGFP. Une image de projection d’intensité maximale (MIP) d’une profondeur de 39 μm à 48 μm est représentée. Les pointes de flèches indiquent des épines dendritiques. (C) Terminaux axonaux marqués EGFP dans le cortex controlatéral. Une image MIP d’une profondeur de 481,5 μm à 513 μm est représentée. Les pointes de flèche indiquent des boutons axonaux. Les images apparaissant en (B) et (C) sont déconvolutées. Barres d’échelle : 300 μm en (A) et 10 μm en (C). La barre en (C) s’applique également à (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Ultrastructure dans les tranches de cerveau nettoyées avec ScaleSF, CUBIC et PACT. (A-C) Transmission d’images EM du cortex cérébral de la souris effacées avec ScaleSF (A), CUBIC (B) et PACT (C). Les cerveaux de souris sont fixés avec 4% de PFA contenant 1% de glutaraldéhyde. Les sections ultraminces sont préparées à partir de tranches de cerveau nettoyées. Les structures membranaires sont gravement endommagées dans les tranches de cerveau nettoyées avec CUBIC (B) et PACT (C). Les pointes de flèche indiquent des membranes postsynaptiques. Barre d’échelle: 500 nm. Ce chiffre a été modifié à partir de Furata et al. 20226. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Recettes pour les solutions ScaleS | |
Solution ScaleS0 | |
Réactif | Concentration finale |
D-sorbitol | 20 % (p/v) |
Glycérol | 5 % (p/v) |
Méthyl-β-cyclodextrine | 1 mM |
γ-cyclodextrine | 1 mM |
Sulfoxyde de diméthyle | 3 % (v/v) |
10x PBS(–) | 1x |
Solution ScaleS4 | |
Réactif | Concentration finale |
Urée | 4 M |
D-sorbitol | 40 % (p/v) |
Glycérol | 10 % (p/v) |
Triton X-100 | 0,2 % (p/v) |
Sulfoxyde de diméthyle | 25 % (v/v) |
Solution ScaleS4D25(0) | |
Réactif | Concentration finale |
Urée | 4 M |
D-sorbitol | 40 % (p/v) |
Glycérol | 10 % (p/v) |
Sulfoxyde de diméthyle | 25 % (v/v) |
Tableau 1: Composition des trois solutions ScaleS. Les compositions des solutions ScaleS0, ScaleS4 et ScaleS4D25(0) sont répertoriées. Pour une procédure détaillée de préparation de ces solutions, reportez-vous à Miyawaki et al. 20167.
Étapes critiques du protocole
Il y a quelques étapes critiques dans le protocole qui doivent être menées avec la plus grande prudence pour obtenir des résultats significatifs. La fixation uniforme des échantillons est impérative pour l’imagerie 3D dans les tissus à grande échelle. La lentille de l’objectif, l’échantillon et le fluide d’immersion doivent avoir une IR correspondante. L’inadéquation de l’IR entre eux conduira à une imagerie très perturbée des cellules exprimant l’EGFP dans les tranches de cerveau nettoyées (Figure 3). Le réglage du collier de correction de la lentille de l’objectif au fluide d’immersion minimise les aberrations sphériques induites par la profondeur pour maximiser le signal, le contraste et la résolution spatiale en imagerie 3D. Les IR des solutions préparées peuvent être mesurés à l’aide d’un réfractomètre.
Dépannage de la technique
Un stockage plus long des solutions peut affecter la capacité de nettoyage et sa capacité à préserver les signaux de fluorescence et l’intégrité structurelle. Des solutions fraîchement préparées doivent être utilisées. Ces solutions peuvent être conservées jusqu’à 1 mois à 4 °C. L’isométrie est essentielle pour une imagerie neuronale efficace et efficiente avec une reconstruction précise du signal. Bien qu’une légère expansion de la taille des échantillons ait été observée après l’incubation pendant 12 h (figure 1B), l’expansion peut être contrôlée en diminuant la période d’incubation entre 8 et 12 h. Pour une imagerie de profondeur 3D plus précise, le collier de correction peut avoir besoin d’être ajusté à un plan donné en raison d’une aberration sphérique induite par la profondeur.
Modifications de la technique
Dans la présente étude, nous avons utilisé des tissus cérébraux de souris pour démontrer la faisabilité du protocole. Pourtant, le protocole décrit ici peut également être utilisé pour les animaux à gros cerveau, tels que les primates. En effet, ce protocole a été utilisé dans les tissus cérébraux des ouistitis communs (Callithrix jacchus), et a réussi à visualiser simultanément les circuits neuronaux et les structures subcellulaires de ses circuits corticostriataux6. Les adaptateurs d’étage de microscope sont conçus pour monter la chambre d’imagerie sur les étages de microscope directement6 (Figure 2A, B). Les tranches de tissus nettoyées sont observables à l’aide d’un microscope inversé à travers le couvercle inférieur de la chambre d’imagerie. Après la restauration de tissus cérébraux nettoyés avec PBS(-) (deScaling)5,11, nous pouvons préparer des coupes de tissus de 20 μm à 50 μm d’épaisseur à partir de tissus cérébraux qui ont été nettoyés avec ScaleSF (re-sectioning)6. Les structures subcellulaires capturées dans les tissus nettoyés peuvent être imagées à nouveau sur des recousses avec une lentille d’objectif NA élevée d’un WD court. L’élimination des tranches de cerveau perfusées de fixateurs contenant du glutaraldéhyde a été réalisée à l’aide de ce protocole, offrant une préservation supérieure de l’ultrastructure6. ScaleSF atteint un niveau élevé de préservation de l’ultrastructure qui permet l’analyse EM dans les tissus optiquement nettoyés6 (Figure supplémentaire 1). La compatibilité EM de cette méthode est particulièrement utile pour l’imagerie des structures avec les échelles du niveau macroscopique au niveau nanoscopique.
Limites de la technique
Le protocole décrit ici nous permet de visualiser les structures neuronales du circuit aux échelles subcellulaires dans des tranches de cerveau de 1 mm d’épaisseur. Cependant, trois limites demeurent dans le protocole. Le premier est la capacité de compensation du protocole de compensation. ScaleSF est un protocole de nettoyage pour les tranches de cerveau, pas pour l’ensemble du cerveau. Bien que des tranches cérébrales de 1 mm d’épaisseur puissent fournir une bonne connaissance des tonnelles axonales dendritiques et locales12, les informations sur les projections axonales couvrant l’ensemble du cerveau sont fragmentaires et incomplètes dans les tranches 13,14,15,16. La seconde est la résolution d’imagerie. En utilisant le protocole décrit ici, nous avons réussi à visualiser des structures neuronales subcellulaires, telles que des épines dendritiques et des boutons axonaux, dans une tranche de cerveau optiquement dégagée (Figure 4). Cependant, la résolution de la lentille objective utilisée dans cette étude, une résolution xy de 400-750 nm, n’est pas suffisante pour résoudre des structures plus fines des cellules neuronales. Étant donné que les objectifs NA élevés sont généralement conçus pour l’immersion dans l’huile (RI 1.52), l’inadéquation RI avec les solutions (RI 1.47) pourrait empêcher l’imagerie haute résolution avec ces objectifs. Le troisième est le marquage des protéines fluorescentes des cellules neuronales. La méthode d’étiquetage limite les larges applications de notre technique d’imagerie. Les techniques histochimiques et/ou immunohistochimiques qui marquent les tissus à grande échelle tout en maintenant l’intégrité des tissus feraient progresser considérablement le protocole fourni ici.
Importance par rapport aux méthodes existantes et aux applications futures de la technique
Dans la présente étude, nous décrivons un protocole détaillé pour l’imagerie neuronale des structures mésoscopiques aux structures microscopiques en utilisant la clairance tissulaire ScaleSF. Le protocole décrit ici permet de visualiser les structures neuronales du circuit aux niveaux subcellulaires dans un laps de temps raisonnable sans équipement spécialisé, facilitant ainsi la compréhension des structures neuronales des échelles de circuit aux composants. Les neurones élaborent des processus exubérants d’une longueur énorme et organisent des structures fines spécialisées pour transmettre et recevoir des informations. Ainsi, l’imagerie neuronale nécessite une méthode de nettoyage des tissus qui exerce une puissante capacité de nettoyage ainsi qu’un haut niveau de préservation des tissus pour la visualisation simultanée de structures à grande et à petite échelle. Cependant, les méthodes de nettoyage des tissus présentées avec des capacités de nettoyage élevées éliminent agressivement les lipides et les pigments pour une clarification approfondie des tissus 3,4, compromettant l’intégrité des tissus 5,6,17 (figure supplémentaire 1). Cela contraste fortement avec le protocole de défrichement utilisé ici qui permet d’atteindre un niveau élevé de préservation de la structure6 (figure supplémentaire 1). Par conséquent,l’éliminationdes tissus Sca l eSF permet une imagerie neuronale efficace et efficiente qui nécessite une imagerie 3D haute résolution multi-échelle avec une reconstruction précise du signal.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Les auteurs remercient Yoko Ishida (Université Juntendo) pour la production de vecteurs AAV et Kisara Hoshino (Université Juntendo) pour l’assistance technique. Cette étude a été soutenue par JSPS KAKENHI (JP20K07231 à K.Y.; JP21H03529 à T.F.; JP20K07743 à M.K.; JP21H02592 à H.H.) et la recherche scientifique sur le domaine innovant « Resonance Bio » (JP18H04743 à H.H.). Cette étude a également été soutenue par l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) (JP21dm0207112 à T.F. et H.H.), Moonshot R&D de l’Agence japonaise de la science et de la technologie (JST) (JPMJMS2024 à H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) de JST (JPMJFR204D à H.H.), Subventions d’aide de l’Institut de recherche sur les maladies de la vieillesse de la Faculté de médecine de l’Université Juntendo (X2016 à K.Y.; X2001 à H.H.), et le projet de marque des écoles privées.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
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