Ensayo basado en transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas

Este protocolo describe un ensayo basado en BRET para medir las interacciones de la quinasa CRAF con las proteínas 14-3-3 en células vivas. El protocolo describe los pasos para la preparación de las celdas, la lectura de las emisiones BRET y el análisis de datos. También se presenta un ejemplo de resultado con la identificación de los controles adecuados y la resolución de problemas para la optimización del ensayo.

El CRAF es un efector primario de las GTPasas RAS y desempeña un papel fundamental en la tumorigénesis de varios cánceres impulsados por KRAS. Además, el CRAF es un punto caliente para las mutaciones de la línea germinal, que se ha demostrado que causan la RASopatía del desarrollo, síndrome de Noonan. Todas las quinasas RAF contienen múltiples sitios de unión dependientes de la fosforilación para las proteínas reguladoras 14-3-3. La unión diferencial de 14-3-3 a estos sitios desempeña un papel esencial en la formación de dímeros activos de RAF en la membrana plasmática en condiciones de señalización y en el mantenimiento de la autoinhibición de RAF en condiciones de reposo. Comprender cómo se regulan estas interacciones y cómo se pueden modular es fundamental para identificar nuevos enfoques terapéuticos que se dirijan a la función de la RAF. Aquí, describo un ensayo basado en la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas. En concreto, este ensayo mide las interacciones de CRAF fusionado con un donante de nanoluciferasa y 14-3-3 fusionado con un aceptor de etiquetas Halo, donde la interacción de RAF y 14-3-3 da lugar a la transferencia de energía de donante a aceptor y a la generación de la señal BRET. El protocolo muestra además que esta señal puede ser interrumpida por mutaciones que se ha demostrado que evitan la unión de 14-3-3 a cada uno de sus sitios de acoplamiento RAF de alta afinidad. Este protocolo describe los procedimientos para sembrar, transfectar y replantear las células, junto con instrucciones detalladas para leer las emisiones de BRET, realizar análisis de datos y confirmar los niveles de expresión de proteínas. Además, se proporcionan ejemplos de resultados de ensayos, junto con pasos de optimización y solución de problemas.

Las quinasas RAF (ARAF, BRAF y CRAF) son los efectores directos de las GTPasas RAS y los miembros iniciadores de la cascada de quinasas RAF-MEK-ERK pro-proliferativa/pro-supervivencia. Estudios recientes han demostrado que la expresión de CRAF desempeña un papel clave en la tumorigénesis de varios cánceres impulsados por KRAS, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el adenocarcinoma ductal de páncreas 1,2,3,4,5. Además, las mutaciones de la línea germinal en CRAF causan una forma particularmente grave de la RASopatía (síndrome de Noonan) ^6,7. Comprender la regulación del CRAF es fundamental para desarrollar enfoques terapéuticos exitosos que se dirijan a su función en las células.

Todas las quinasas RAF se pueden dividir en dos dominios funcionales, un dominio catalítico C-terminal (CAT) y un dominio regulador N-terminal (REG), que controla su actividad (Figura 1A)⁸. El dominio REG abarca el dominio de unión RAS (RBD), el dominio rico en cisteína (CRD) y una región rica en serina/treonina (rica en S/T). En particular, la región rica en S/T contiene el sitio N', que se une a 14-3-3 de una manera dependiente de la fosforilación (S259 en CRAF; Figura 1A) ⁸. El dominio CAT abarca el dominio quinasa, junto con un segundo sitio de acoplamiento 14-3-3 de alta afinidad, denominado sitio C' (S621 en CRAF; Figura 1A) ⁸. La unión diferencial de las proteínas diméricas 14-3-3 a los sitios N' y C', junto con la CRD, desempeña un papel crítico tanto en la activación como en la inhibición de RAF 9,10,11,12,13. En condiciones normales de señalización, la activación de RAF se inicia mediante su reclutamiento a la membrana plasmática por RAS, lo que le permite formar dímeros activos, de los cuales el heterodímero BRAF-CRAF es la forma activa predominante^14,15. Los ensayos bioquímicos con BRAF y CRAF, junto con estructuras de microscopía electrónica criogénica (Cryo-EM) de BRAF dimérico, indican que un dímero 14-3-3 estabiliza los dímeros activos de RAF al unirse simultáneamente al sitio C' de ambos protómeros de RAF (Figura 1B)9,13,16,17. Por el contrario, los estudios han demostrado que, en condiciones de reposo, la RAF adopta una confirmación citosólica autoinhibida, donde el dominio REG se une al dominio CAT e inhibe su actividad 12,18,19,20. Este estado cerrado se estabiliza mediante un dímero 14-3-3 unido al sitio CRD y N' en el dominio REG y al sitio C' en el dominio CAT (Figura 1B)10,13,21. En BRAF, este modelo está respaldado por estructuras Cryo-EM recientes de monómeros BRAF autoinhibidos y por nuestros estudios bioquímicos previos 10,12,13,21,22. Sin embargo, mientras que se ha demostrado que el 14-3-3 desempeña un papel inhibidor en la regulación²³ del CRAF, un estado autoinhibido similar al BRAF puede desempeñar un papel menor en la regulación¹² del CRAF; por lo tanto, se requieren más estudios para aclarar los mecanismos por los cuales las proteínas 14-3-3 regulan la actividad de CRAF. La regulación mediada por 14-3-3 de las quinasas RAF requiere una gran cantidad de eventos de fosforilación y desfosforilación de RAF, la unión a varias proteínas reguladoras e interacciones con la membrana plasmática⁸. Por lo tanto, es fundamental que las interacciones de 14-3-3-RAF se midan en condiciones fisiológicamente relevantes y en presencia de una bicapa lipídica intacta.

Para abordar este problema, se utilizó la tecnología NanoBRET (en adelante denominada N-BRET; consulte la Tabla de materiales para obtener detalles del kit) para desarrollar un ensayo basado en la proximidad para medir las interacciones de CRAF con las proteínas 14-3-3 en células vivas (Figura 1C). Este sistema basado en BRET mide las interacciones de dos proteínas de interés (POI), donde una proteína se marca con un donante de nanoluciferasa (Nano) y la otra con una etiqueta Halo, para su marcaje con el ligando aceptor de energía Halo618^22,24. La interacción de las proteínas de interés da como resultado la transferencia de energía del donante al aceptor, que a su vez genera la señal BRET (Figura 1C). La proteína donante Nano extremadamente brillante (emisión (em) 460 nm) y el ligando Halo618 (em 618 nm) proporcionan una mayor separación espectral y sensibilidad que el BRET convencional, lo que lo convierte en una plataforma ideal para estudiar interacciones más débiles y detectar cambios sutiles en la unión²⁴. De hecho, previamente desarrollamos un ensayo basado en N-BRET para medir las interacciones autoinhibitorias de los dominios RAF REG y CAT, que fue esencial para la caracterización de un panel de mutaciones de RASopathy en el BRAF CRD y demostró la importancia crítica de este dominio para mantener la autoinhibición y prevenir la activación constitutiva de BRAF¹².

El ensayo descrito aquí mide las interacciones de CRAF, fusionado con una etiqueta Nano N-terminal (Nano-CRAF), y la isoforma zeta de 14-3-3 fusionada con la etiqueta Halo C-terminal (14-3-3ζ-Halo; Figura 1C). Demostramos que las interacciones de Nano-CRAF con 14-3-3ζ-Halo generan una señal BRET robusta, que a su vez puede ser interrumpida por mutaciones que impiden la unión de 14-3-3 al sitio N' (S259A) y/o al sitio C' (S621A). El siguiente protocolo proporciona pasos detallados para realizar, optimizar y solucionar problemas de este ensayo.

NOTA: Este ensayo se realiza en celdas de 293 pies. Una línea epitelial bien caracterizada y fácilmente transfectable derivada de células embrionarias de riñón humano. Una sola placa de cultivo confluente de 10 cm de estas células suele proporcionar suficientes células para sembrar 20 pocillos de placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Los pasos 1 a 3 deben realizarse utilizando técnica estéril en una cabina de seguridad biológica.

1. Siembra de células (Día 1)

NOTA: En este paso, las células se separan de la(s) placa(s) de cultivo de tejidos, se cuentan y se siembran en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos para la transfección en el paso 2 (Figura 2).

1. Aspire el medio de las células en el plato de 10 cm. Lave las células con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y aspire.
2. Añadir 1 mL de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubar durante 3-5 min a 37 °C para separar las células de la placa.
3. Añada 9 mL del medio eagle modificado completo de Dulbecco (DMEM) a las células para neutralizar la tripsina y pipetee hacia arriba y hacia abajo repetidamente para generar una suspensión unicelular homogénea.
4. Transfiera inmediatamente 20 μL de células a un tubo de 1,7 mL y mezcle con 20 μL de tinción de azul de tripano. Cuente las células utilizando un contador de células automatizado (Tabla de materiales) o un hemocitómetro.
5. Diluya las células a 2 x 10⁵ células/ml en un medio DMEM completo y añada 2 ml a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos (4 x 10⁵ células/pocillo). Incubar las células a 37 °C y 10% de CO₂ durante la noche.
   NOTA: Se recomienda utilizar celdas de 293 pies que hayan pasado menos de 20x. Hemos encontrado previamente que el uso de celdas con un mayor número de pasajes puede resultar en una reducción de las proporciones BRET y una mayor variabilidad de la señal de pozo a pocillo.

2. Transfección celular (Día 2)

NOTA: Aquí, las células se transfectan con las construcciones de expresión pCMV5-NanoLuc-CRAF y pCMV5-14-3-3ζ-Halo, junto con el vector vacío pCDNA3.1 (Figura 2).

1. Antes de la transfección, diluir los plásmidos N-BRET a 5 ng/μL y pCDNA3.1 a 100 ng/μL, y numerar un juego de tubos estériles de 1.7 mL.
2. Agregue 100 μL de medio de transfección (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) a cada tubo, junto con 5 ng de pCMV5-NanoLuc-CRAF, 10 ng de pCMV5-14-3-3ζ y 200 ng de PCDNA3.1.
3. Añada 2 μL de reactivo de transfección (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) y vórtice suavemente para mezclar. Centrifugar los tubos por pulsos brevemente en una microcentrífuga para asegurarse de que todo el líquido se recoge en el fondo de los tubos y, a continuación, incubar a unos 25 °C durante 15 minutos.
4. Añadir complejos de transfección gota a gota a las células e incubar a 37 °C/10% CO₂ durante 16-20 h para permitir que se expresen las proteínas marcadas con Halo y Nano.
   NOTA: La adición de un vector vacío (pCDNA3.1) de ADN portador es esencial para lograr una alta eficiencia de transfección de las construcciones de expresión de N-BRET. La falta de adición de vector vacío da lugar a niveles reducidos de expresión de las proteínas 14-3-3ζ-Halo y Nano-CRAF y, a su vez, da lugar a proporciones BRET débiles e inconsistentes, como se ha comentado anteriormente²².

3. Rechapado de células (Día 3)

NOTA: En este paso, las células se transfieren a una placa de 384 pocillos y el ligando Halo 618 (+ligando; Tabla de Materiales) o DMSO (+vehículo) para leer las emisiones BRET en el paso 4. Las células restantes se transfieren a placas de cultivo frescas de 6 pocillos para el análisis de Western blot en el Paso 5 (Figura 2).

1. Reúna los siguientes materiales y prepare el área de trabajo como se describe a continuación.
   1. Usando un baño de agua a 37 °C, precaliente la tripsina-EDTA, junto con los medios de ensayo sin suero y los medios de ensayo suplementados con un 10% de FBS (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
   2. En función del número de muestras que se van a medir, etiquete previamente tres juegos de tubos estériles de 1,7 ml (juego 1-3) y un juego de tubos estériles de fondo cónico de 15 ml. Equipe una centrífuga de cubo oscilante con insertos de tubo de 15 mL y preenfriamiento a 4 °C.
   3. Coloque los siguientes elementos en la campana de cultivo de tejidos: depósitos de reactivos, placas de cultivo de tejidos de 384 pocillos, placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos, una pipeta y puntas multicanal, portaobjetos/cámaras de recuento de células y tinción de azul de tripán (Tabla de materiales), junto con los juegos de tubos 1-3 de 1,7 ml.
2. Coseche y cuente las celdas como se describe a continuación.
   1. Aspire el medio de las placas de 6 pocillos y agregue 250 μL de tripsina-EDTA a las células. Incubar las placas de 6 pocillos a 37 °C hasta que las células comiencen a desprenderse (3-5 min).
   2. Agregue 1 ml de medio de ensayo suplementado con FBS al 10% a cada pocillo para neutralizar la tripsina y pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente para generar una suspensión unicelular.
   3. Transfiera 1 mL de la suspensión celular a los tubos de 15 mL preetiquetados. Agregue otro 1 mL de medio de ensayo suplementado con FBS al 10% a cada uno de los tubos de 15 mL.
   4. Invierta los tubos 5 veces para mezclar y transfiera inmediatamente 20 μL de suspensión celular al juego de tubos 1.
   5. Centrífuga en la centrífuga de cubeta oscilante preenfriada durante 5 minutos a ~250 x g. Durante la etapa de centrifugación, mezcle 20 μL de tinción de células de azul de tripano con las células del juego de tubos 1 y luego cuente las células usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro. Es típico un rendimiento de 6-8 x 10⁵ células/mL.
   6. Retire los tubos de 15 ml de la centrífuga y aspire los medios de los gránulos de la celda. Vuelva a suspender los gránulos celulares a 2 x 10⁵ células/ml en un medio de ensayo sin suero y pipetee enérgicamente para generar una suspensión de una sola célula.
      NOTA: El uso de medios de ensayo sin suero se utiliza para poner en modo inactivo las vías normales de señalización celular.
3. Vuelva a colocar las celdas en placas de 384 pocillos y 6 pocillos como se describe a continuación.
   1. Invierta los tubos de 15 ml varias veces para asegurar una suspensión celular homogénea y transfiera 500 μL a los tubos de 1,7 ml del juego 2 y del juego 3.
   2. Añada 0,5 μL de DMSO (+vehículo) al conjunto 2 y 0,5 μL de ligando Halo 618 (+ligando) al juego de tubos 3 y pipetea para mezclar.
   3. Transfiera las suspensiones de celdas +vehículo y +ligando a pozos separados de depósitos de reactivos. Utilizando la pipeta multicanal (Tabla de materiales), transfiera 40 μL de la suspensión de celda +vehículo desde los depósitos de reactivos a los pocillos cuadruplicados de la placa de cultivo de 384 pocillos. Repita este paso para las suspensiones de células +ligando.
   4. Transfiera las células restantes a placas de cultivo frescas de 6 pocillos. Incubar las placas de 384 pocillos y 6 pocillos durante la noche a 37 °C y 5% de_CO2.

4. Lectura de las emisiones BRET (Día 4)

NOTA: En este paso, el sustrato de nanoluciferasa (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) se agrega a las células en la placa de cultivo de 384 pocillos y se leen las emisiones del aceptor N-BRET (618 nm) y del donante (460 nm) (Figura 2). A continuación, se calculan los ratios BRET corregidos.

1. Precalentar los medios de ensayo sin suero en un baño de agua a 37 °C y descongelar el sustrato de nanoluciferasa a 25 °C. Diluir el sustrato de nanoluciferasa 1:100 en un medio de ensayo sin suero y transferir a un depósito de reactivo. Prepare suficiente cantidad de esta mezcla para agregar 10 μL a cada pocillo de la placa de 384 pocillos, más un 10%-15% de volumen adicional.
2. Utilizando una pipeta multicanal (Tabla de Materiales), transfiera 10 μL de la mezcla de sustrato a cada uno de los pocillos que contienen células en la placa de cultivo de 384 pocillos. Gire suavemente la placa durante 1 minuto, ya sea manualmente o con un agitador orbital.
3. Inserte la placa de 384 pocillos en el lector de placas multimodo y registre las emisiones de 460 nm y 618 nm para todos los pocillos que contienen celdas.
   NOTA: Para el lector de placas multimodo utilizado para este paso (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles), se utilizó una altura de lectura de 6,5 mm, con una medición de tiempo de lectura de 0,1 s, sin embargo, puede ser necesaria una mayor optimización si se utilizan otros lectores de placas.
4. Calcule las proporciones BRET brutas para +vehículo y +ligando en unidades miliBRET (mBU) individualmente, utilizando la siguiente ecuación:
   
5. Calcule la relación BRET corregida restando la relación BRET +vehículo de la del +ligando (Tabla suplementaria 1).
   NOTA: Al comparar los resultados de múltiples experimentos, las proporciones BRET corregidas se pueden agrupar y normalizar al promedio del par N-BRET de tipo salvaje (WT), que consta de Nano-CRAF^WT y 14-3-3ζ^WT-Halo (Tabla suplementaria 1).

5. Confirmación de los niveles de expresión proteica (Días 4 y 5)

NOTA: En este paso, las células de las placas de 6 pocillos se lisan y los niveles de expresión proteica de las proteínas Nano-CRAF y 14-3-3ζ-Halo se determinan mediante análisis de Western blot utilizando anticuerpos específicos para las etiquetas Halo y Nano. (Figura 2).

1. Añadir inhibidores de la proteasa y la fosfatasa al tampón de lisis NP40 (Tabla de materiales), lo que permite 200 μL de tampón de lisis por muestra.
2. Aspire los medios de las placas de 6 pocillos que contienen células. Lavar las celdas una vez con 1 mL de PBS frío y aspirar.
3. Añadir 125 μL de tampón de lisis NP40 a cada pocillo e incubar placas de 6 pocillos a 4 °C en una plataforma oscilante durante 15 min para lisar las células.
4. Transfiera los lisados a tubos de 1,7 ml sobre hielo y centrifuga a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C. Vuelva a colocar los lisados aclarados en hielo y determine la concentración de proteínas utilizando ensayos disponibles comercialmente, como los ensayos de Bradford o de ácido bicinconínico (BCA).
5. Normalice la concentración de proteínas en todas las muestras transfiriendo un volumen adecuado de lisado y tampón de lisis NP40 a tubos nuevos de 1,7 ml hasta un volumen total de 100 μl.
6. Hervir 5 veces el tampón de muestra de proteínas (Tabla de materiales) durante 1 minuto y añadir 25 μL a cada muestra. Hervir las muestras durante 5-6 minutos y luego centrifugar los tubos por pulsos brevemente para asegurarse de que toda la muestra se acumule en la base del tubo.
7. Cargue 25 μL de muestra en cada pocillo de geles de proteínas duplicados (Gel 1 y Gel 2) y luego transfiera las proteínas a membranas de nitrocelulosa o PVDF utilizando procedimientos estándar de Western blot, como se describió anteriormente²².
8. Bloquee las membranas en BSA-PBS al 3% a 25 °C durante 30 min y luego incube las membranas durante la noche con el anticuerpo Halo (dilución 1:1,000; Gel 1) y anticuerpo nanoluciferasa o CRAF (dilución 1:500; Gel 2) en solución salina tamponada con tris, suplementado con Tween-20 al 0,2% (TBST; Tabla de Materiales).
9. Lave las membranas 1 vez durante 5 min en 10 mL de TBST y luego incube a temperatura ambiente durante 1 h con el anticuerpo secundario HRP anti-ratón, diluido 1:10.000 en TBST.
10. Lave las membranas 3 veces en una plataforma oscilante en 10 mL de TBST a 25 °C durante 5 min cada una. Retire el TBST y visualice las bandas de proteínas utilizando reactivos ECL y un procesador de película de rayos X u otro sistema de imagen adecuado.

Cuando se realiza como se describe en este protocolo (Figura 2), la interacción de Nano-CRAF^WT y 14-3-3ζ-Halo debería producir proporciones BRET corregidas de 50-60 mBU (Figura 3A; Cuadro complementario 1). CRAF contiene dos sitios de acoplamiento 14-3-3 dependientes de fosforilación, el sitio N' y el sitio C' (Figura 1)⁸. Por lo tanto, los controles apropiados para reducir la unión de CRAF:14-3-3ζ incluyen S259A y S621A, que evitan la fosforilación y, a su vez, la unión de 14-3-3 a los sitios N' y C', respectivamente²⁵. Como se muestra en la Figura 3A, Nano-CRAF^S259A reduce la señal BRET en ~45% y Nano-CRAF^S621A en ~25%, mientras que el doble mutante S259A/S621A (SS/AA) elimina casi por completo la señal CRAF:14-3-3 BRET. Además, los resultados de múltiples experimentos independientes se pueden comparar normalizando primero los resultados de cada experimento con la proporción BRET corregida promedio (Tabla complementaria 1) y luego agrupando los puntos de datos de los tres experimentos (Figura 3B). Los niveles relativos de expresión de las proteínas marcadas también deben confirmarse mediante el análisis de Western blot (Figura 3). Obsérvese que los niveles de expresión de las proteínas mutantes pueden variar de los de WT, lo que requiere que las cantidades transfectadas de vectores de ADN mutantes se ajusten en consecuencia (Tabla suplementaria 1).

También debe tenerse en cuenta que puede ser necesaria la optimización de este protocolo, especialmente cuando se utiliza un lector de placas, líneas celulares o reactivos de transfección alternativos. La Figura 4A muestra los resultados de un ejemplo de experimento de optimización, en el que el aumento de la cantidad transfectada del plásmido aceptor pCMV5-14-3-3ζ-Halo, mientras se mantiene constante la cantidad de donante de pCMV5-NanoLuc-CRAF, aumenta la señal BRET de forma dependiente de la dosis, que luego se reduce por la presencia del mutante CRAF^SS/AA deficiente en 14-3-3-unión. Sin embargo, si la proporción de aceptor a donante es demasiado alta, la diferencia en la señal entre la unión de 14-3-3ζ-Halo a Nano-CRAF^WT frente al control negativo de Nano-CRAF^SS/AA se reducirá, probablemente reflejada en la saturación de unión de Nano-CRAF^WT. Además, una vez que se logra una relación BRET que genera valores reproducibles con un error estándar bajo, no es necesario aumentar aún más la proporción de aceptores a donantes. De hecho, una de las principales ventajas de estos ensayos es la capacidad de medir las interacciones de las proteínas a niveles de expresión fisiológicos. A la hora de desarrollar nuevos ensayos N-BRET, otra consideración importante es la colocación de las etiquetas. La Figura 4B muestra el efecto de cambiar la etiqueta Halo del extremo C al extremo N de 14-3-3ζ en las proporciones BRET corregidas generadas por la unión de 14-3-3ζ a Nano-CRAF^WT y Nano-CRAF^SS/AA. Con este fin, se deben generar construcciones de expresión de ADN para cada una de las posibles ubicaciones de las etiquetas (Figura 4C), y se deben evaluar sus efectos sobre las proporciones BRET tanto del par WT como de un control negativo conocido para la unión.

Figura 1: Regulación de RAF por proteínas 14-3-3. (A) Esquema de la estructura del dominio quinasa RAF con sitios de acoplamiento 14-3-3 conservados indicados. (B) Modelos de regulación RAF por proteínas 14-3-3. (C) Ensayo N-BRET que mide las interacciones de 14-3-3ζ fusionado con un aceptor de etiquetas Halo C-terminal y CRAF fusionado con un donante Nano N-terminal. La transferencia de energía del donante al aceptor genera la señal BRET. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Pasos clave para realizar el ensayo CRAF:14-3-3 basado en BRET de células vivas. Se muestran los cinco pasos principales descritos en este protocolo, que incluyen: siembra, transfección y replateado de las células, junto con métodos para leer la señal BRET y confirmar los niveles de expresión de las proteínas marcadas con Halo y Nano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: CRAF:Ensayo basado en BRET 14-3-3. Ensayo N-BRET que compara las interacciones de 14-3-3ζ-Halo con Nano-CRAF -WT o las formas mutantes -S259A, -S621A y -S259A/S621A (SS/AA), demostrado anteriormente que perjudican la unión²⁵ de CRAF:14-3-3. Los niveles de expresión de las variantes 14-3-3ζ-Halo (MW: 64 kDa.) y Nano-CRAF (MW: 93 kDa.) se examinaron mediante análisis de Western blot. (A) Lecturas BRET corregidas de cuatro pozos replicados de un solo experimento ± desviación estándar (SD). (B) Las lecturas corregidas de BRET de tres experimentos independientes se agruparon y normalizaron a Nano-CRAF^WT (establecido en 100) ± SD. La significación estadística se calculó mediante la prueba t de Student (dos colas, asumiendo la misma varianza). p<0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Pasos de optimización del ensayo. Los efectos de la co-transfectación de cantidades crecientes de (A) 14-3-3ζ-Halo o (B) Halo-14-3-3ζ con una cantidad constante de Nano-CRAF -WT o -SS/AA (S259A/S621A) en la señal BRET ± SD. (C) Esquema de todos los posibles pares N-BRET generados colocando la etiqueta Halo o Nano en el extremo N-terminal o C-terminal de cada proteína de interés (A y B). n = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria 1: Ejemplos de datos del ensayo CRAF:14-3-3 basado en BRET. Los constructos de expresión indicados se transfectaron en las células el día 2 (sección superior). Las lecturas brutas, corregidas y normalizadas de BRET se midieron y calcularon el día 4 (sección inferior). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Estudios previos han demostrado que las proteínas 14-3-3 desempeñan un papel fundamental tanto en la activación como en la inhibición de las quinasas RAF. Comprender cómo se regulan estos eventos de unión y los efectos de la modulación de estas interacciones en la señalización de RAF y la oncogénesis impulsada por RAF puede descubrir nuevas vulnerabilidades terapéuticas que se dirigen a la función de CRAF. Sin embargo, el ciclo de activación de Raf está respaldado por una gran cantidad de proteínas asociadas, modificaciones postraduccionales y cambios en la localización subcelular⁸, y por lo tanto, para recapitular completamente estas condiciones, las interacciones de RAF con sus reguladores deben medirse en condiciones de células vivas. Este protocolo describe un nuevo ensayo basado en proximidad que utiliza la relación señal-ruido superior y la resolución espectral del par nanoluciferasa-Halo N-BRET para medir las interacciones de 14-3-3ζ y CRAF en células vivas.

Si bien este ensayo proporciona una plataforma muy necesaria para estudiar las complejas interacciones de 14-3-3 y CRAF en condiciones fisiológicamente relevantes, tiene una serie de limitaciones que deben tenerse en cuenta. En primer lugar, dado que se ha demostrado que el 14-3-3 desempeña un papel tanto en la autoinhibición como en la dimerización de la RAF⁸, se pueden incorporar controles adicionales y enfoques experimentales para distinguir entre estos estados. Por ejemplo, este ensayo se puede realizar junto con el ensayo de autoinhibición N-BRET desarrollado anteriormente, que proporciona una lectura directa de los cambios en la autoinhibición de RAF^12,22. Además, controles como la mutación CRAF R401H, que se ha demostrado que interrumpe la dimerización de CRAF con otros protómeros RAF^15,26, también pueden resultar útiles para diseccionar estas funciones. Por último, la ubicación de las etiquetas Halo y Nano está optimizada para medir la interacción CRAF:14-3-3, pero no puede garantizar que las interacciones de CRAF o 14-3-3 con otras proteínas no se vean afectadas como resultado, ni este ensayo puede determinar la afinidad de la unión de CRAF:14-3-3, los efectos de estas interacciones sobre la actividad de CRAF o la ubicación en la célula en la que se producen estas interacciones. Por lo tanto, también puede ser necesario incorporar otros enfoques complementarios, como los ensayos de unión in vitro, los ensayos de quinasas CRAF y los estudios de localización subcelular 12,27,28,29.

Al realizar este ensayo, o cualquier ensayo basado en N-BRET, hay que tener en cuenta una serie de factores. Como se muestra en este manuscrito, y en trabajos previos²², la proporción correcta de transfección de las construcciones pCMV5-Halo (aceptor) y pCMV5-Nanoluciferasa (donante), junto con un control negativo adecuado, como un mutante que se sabe que interrumpe la unión de los POI, es fundamental para optimizar y probar estos ensayos. El aumento de la expresión del POI marcado con Halo, mientras se mantienen constantes los niveles de POI marcados con Nano, da como resultado un aumento de las proporciones BRET. Sin embargo, una vez que la unión está saturada, la señal se estabilizará y, a su vez, se reducirá la diferencia entre el WT y los POI deteriorados por la unión, lo que requiere la optimización aceptor-donante. Otro factor crítico en la optimización de ensayos es el uso de un ADN portador de vector vacío, como pCDNA3.1. La inclusión de 200 ng de pCDNA3.1. en la mezcla de transfección aumenta en gran medida los niveles de expresión de los POI marcados con Halo y Nano y reduce la variabilidad entre los pocillos replicados y los experimentos²². Sin embargo, dado que la eficiencia de la transfección puede variar entre reactivos y líneas celulares, también puede ser necesario valorar la cantidad de ADN portador para lograr una expresión óptima del par N-BRET, como se describió anteriormente²². Otro factor que afecta en gran medida a las proporciones BRET es la colocación de las etiquetas. De hecho, el POI que se fusiona con la etiqueta Halo frente a la etiqueta Nano y el hecho de que esta etiqueta se coloque en el extremo N o C de la proteína puede afectar tanto a la amplitud de la relación BRET como a la capacidad de los controles negativos para reducir esta señal. Por lo tanto, también es importante probar cada uno de los posibles pares N-BRET al desarrollar nuevos ensayos.

La sensibilidad y la resolución espectral mejoradas logradas por N-BRET en comparación con BRET convencional permiten medir interacciones más débiles y cambios sutiles en la unión en células vivas. Sin embargo, la utilidad de estos ensayos para el estudio de los eventos de señalización celular no se ha comprendido completamente. En particular, este ensayo probablemente podría adaptarse para estudiar la interacción de 14-3-3 con otras quinasas, como las quinasas ARAF y BRAF de la RAF, y cuando se combine con ensayos N-BRET publicados anteriormente para estudiar la unión a RAS:RAF y la autoinhibición de RAF^22,30, formará la base de un conjunto de herramientas para medir la regulación de RAF en condiciones de células vivas. Además, N-BRET se ha mostrado prometedor como plataforma de cribado de fármacos con células vivas³⁰ y, por lo tanto, este ensayo también puede ser útil para identificar compuestos que estabilicen la inhibición con las interacciones de 14-3-3 y RAF o interrumpan las implicadas en la activación de RAF. Dada la alta estabilidad de la señal de nanoluciferasa y la capacidad de los lectores de placas modernos para detectar simultáneamente las emisiones del aceptor y del donante, también se deduce que estos ensayos se pueden adaptar para medir las interacciones de las proteínas señalizadoras en tiempo real, lo que será fundamental para comprender la dinámica de estas interacciones en respuesta a la estimulación ascendente o a los tratamientos farmacológicos.

Nada que revelar.

Este proyecto ha sido financiado en parte con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el número de proyecto ZIA BC 010329.