Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET)-basierter Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen

Dieses Protokoll beschreibt einen BRET-basierten Assay zur Messung der Wechselwirkungen der CRAF-Kinase mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen. Das Protokoll beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Zellen, zum Ablesen der BRET-Emissionen und zur Datenanalyse. Ein Beispielergebnis mit der Identifizierung geeigneter Kontrollen und der Fehlerbehebung für die Assay-Optimierung wird ebenfalls vorgestellt.

CRAF ist ein primärer Effektor von RAS-GTPasen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Tumorgenese mehrerer KRAS-getriebener Krebsarten. Darüber hinaus ist CRAF ein Hotspot für Keimbahnmutationen, die nachweislich die entwicklungsbedingte RASopathie, das Noonan-Syndrom, verursachen. Alle RAF-Kinasen enthalten mehrere phosphorylierungsabhängige Bindungsstellen für 14-3-3-regulatorische Proteine. Die differentielle Bindung von 14-3-3 an diese Stellen spielt eine wesentliche Rolle bei der Bildung aktiver RAF-Dimere an der Plasmamembran unter Signalbedingungen und bei der Aufrechterhaltung der RAF-Autoinhibition unter Ruhebedingungen. Zu verstehen, wie diese Wechselwirkungen reguliert werden und wie sie moduliert werden können, ist entscheidend für die Identifizierung neuer therapeutischer Ansätze, die auf die RAF-Funktion abzielen. Hier beschreibe ich einen auf Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) basierenden Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen. Insbesondere misst dieser Assay die Wechselwirkungen von CRAF, das mit einem Nano-Luciferase-Donor fusioniert ist, und 14-3-3, das mit einem Halo-Tag-Akzeptor fusioniert ist, wobei die Interaktion von RAF und 14-3-3 zu einem Energietransfer zwischen Donor und Akzeptor und der Erzeugung des BRET-Signals führt. Das Protokoll zeigt ferner, dass dieses Signal durch Mutationen gestört werden kann, die nachweislich die Bindung von 14-3-3 an jede seiner hochaffinen RAF-Andockstellen verhindern. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Aussaat, Transfektion und Neubeschichtung der Zellen sowie detaillierte Anweisungen zum Ablesen von BRET-Emissionen, zur Durchführung der Datenanalyse und zur Bestätigung der Proteinexpressionsniveaus. Darüber hinaus werden Beispiel-Assay-Ergebnisse sowie Optimierungs- und Fehlerbehebungsschritte bereitgestellt.

RAF-Kinasen (ARAF, BRAF und CRAF) sind die direkten Effektoren der RAS-GTPasen und die initiierenden Mitglieder der pro-proliferativen/überlebensfördernden RAF-MEK-ERK-Kinase-Kaskade. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die CRAF-Expression eine Schlüsselrolle bei der Tumorgenese mehrerer KRAS-getriebener Krebsarten spielt, darunter nicht-kleinzelliger Lungenkrebs und duktales Adenokarzinom^der Bauchspeicheldrüse 1,2,3,4,5. Darüber hinaus verursachen Keimbahn-CRAF-Mutationen eine besonders schwere Form der RASopathie, das Noonan-Syndrom ^6,7. Das Verständnis der CRAF-Regulation ist entscheidend für die Entwicklung erfolgreicher therapeutischer Ansätze, die auf seine Funktion in Zellen abzielen.

Alle RAF-Kinasen können in zwei funktionelle Domänen unterteilt werden, eine C-terminale katalytische (CAT) Domäne und eine N-terminale regulatorische (REG) Domäne, die ihre Aktivität steuert (Abbildung 1A)⁸. Die REG-Domäne umfasst die RAS-Bindungsdomäne (RBD), die Cystein-reiche Domäne (CRD) und eine serin/Threonin-reiche Region (S/T-reich). Bemerkenswert ist, dass die S/T-reiche Region die N'-Stelle enthält, die phosphorylierungsabhängig an 14-3-3 bindet (S259 in CRAF; Abbildung 1A) ⁸. Die CAT-Domäne umfasst die Kinase-Domäne zusammen mit einer zweiten hochaffinen 14-3-3-Andockstelle, die als C'-Stelle bezeichnet wird (S621 in CRAF; Abbildung 1A) ⁸. Die differentielle Bindung von dimeren 14-3-3-Proteinen an die N'- und C'-Stellen spielt zusammen mit der CRD eine entscheidende Rolle sowohl bei der RAF-Aktivierung als auch bei der Hemmung 9,10,11,12,13. Unter normalen Signalbedingungen wird die RAF-Aktivierung durch seine Rekrutierung an die Plasmamembran durch RAS initiiert, wodurch aktive Dimere gebildet werden können, von denen das BRAF-CRAF-Heterodimer die vorherrschende aktive Form^{ist 14,15}. Biochemische Assays mit BRAF und CRAF sowie kryogene Elektronenmikroskopie-Strukturen (Kryo-EM) von dimerem BRAF deuten darauf hin, dass ein 14-3-3-Dimer aktive RAF-Dimere stabilisiert, indem es gleichzeitig an die C'-Stelle beider RAF-Protomere bindet (Abbildung 1B)9,13,16,17. Umgekehrt haben Studien gezeigt, dass RAF unter Ruhebedingungen eine zytosolische, autoinhibierte Bestätigung annimmt, bei der die REG-Domäne an die CAT-Domäne bindet und deren Aktivität hemmt 12,18,19,20. Dieser geschlossene Zustand wird durch ein 14-3-3-Dimer stabilisiert, das an die CRD- und N'-Stelle in der REG-Domäne und an die C'-Stelle in der CAT-Domäne gebunden ist (Abbildung 1B)10,13,21. Bei BRAF wird dieses Modell durch neuere Kryo-EM-Strukturen von autoinhibierten BRAF-Monomeren und durch unsere früheren biochemischen Studien^unterstützt 10,12,13,21,22. Während jedoch gezeigt wurde, dass 14-3-3 eine hemmende Rolle bei der CRAF-Regulation^{spielt 23}, könnte ein BRAF-ähnlicher autoinhibierter Zustand eine geringere Rolle bei der CRAF-Regulation spielen¹²; daher sind weitere Studien erforderlich, um die Mechanismen zu klären, durch die 14-3-3-Proteine die CRAF-Aktivität regulieren. Die 14-3-3-vermittelte Regulation von RAF-Kinasen erfordert eine Vielzahl von RAF-Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsereignissen, die Bindung an verschiedene regulatorische Proteine und Wechselwirkungen mit der Plasmamembran⁸. Daher ist es wichtig, dass 14-3-3-RAF-Wechselwirkungen unter physiologisch relevanten Bedingungen und in Gegenwart einer intakten Lipiddoppelschicht gemessen werden.

Um dieses Problem zu lösen, wurde die NanoBRET-Technologie (im Folgenden als N-BRET bezeichnet; siehe Materialtabelle für Details zum Kit) eingesetzt, um einen näherungsbasierten Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen zu entwickeln (Abbildung 1C). Dieses BRET-basierte System misst die Wechselwirkungen von zwei Proteinen von Interesse (POI), wobei ein Protein mit einem Nanoluciferase (Nano)-Donor und das andere mit einem Halo-Tag markiert wird, um mit dem Halo618-Energieakzeptorliganden^22,24 markiert zu werden. Die Interaktion der interessierenden Proteine führt zu einem Energietransfer von Donor zu Akzeptor, der wiederum das BRET-Signal erzeugt (Abbildung 1C). Das extrem helle Nano-Donorprotein (Emission (em) 460 nm) und der Halo618-Ligand (em 618 nm) bieten eine größere spektrale Trennung und Empfindlichkeit als herkömmliche BRET, was es zu einer idealen Plattform für die Untersuchung schwächerer Wechselwirkungen und den Nachweis subtiler Änderungen in der Bindung^{macht 24}. In der Tat haben wir zuvor einen N-BRET-basierten Assay zur Messung der autoinhibitorischen Wechselwirkungen der RAF REG- und CAT-Domänen entwickelt, der für die Charakterisierung einer Reihe von RASopathie-Mutationen in der BRAF-CRD unerlässlich war und die entscheidende Bedeutung dieser Domäne für die Aufrechterhaltung der Autoinhibition und die Verhinderung der konstitutiven BRAF-Aktivierung demonstrierte¹².

Der hier beschriebene Assay misst die Wechselwirkungen von CRAF, das mit einem N-terminalen Nano-Tag (Nano-CRAF) fusioniert ist, und der Zeta-Isoform von 14-3-3, die mit einem C-terminalen Halo-Tag fusioniert ist (14-3-3ζ-Halo; Abbildung 1C). Wir zeigen, dass die Wechselwirkungen von Nano-CRAF mit 14-3-3ζ-Halo ein robustes BRET-Signal erzeugen, das wiederum durch Mutationen gestört werden kann, die eine Bindung von 14-3-3 an die N'-Stelle (S259A) und/oder die C'-Stelle (S621A) verhindern. Das folgende Protokoll enthält detaillierte Schritte zur Durchführung, Optimierung und Fehlerbehebung dieses Assays.

HINWEIS: Dieser Assay wird in 293FT-Zellen durchgeführt. Eine gut charakterisierte und leicht transfizierbare Epithellinie, die aus menschlichen embryonalen Nierenzellen gewonnen wird. Eine einzelne konfluente 10-cm-Kulturschale dieser Zellen liefert in der Regel genügend Zellen für die Aussaat von 20 Wells mit 6-Well-Gewebekulturplatten. Die Schritte 1-3 müssen in steriler Technik in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Aussaat der Zellen (Tag 1)

HINWEIS: In diesem Schritt werden die Zellen von der/den Gewebekulturschale(n) gelöst, gezählt und in 6-Well-Gewebekulturplatten für die Transfektion in Schritt 2 ausgesät (Abbildung 2).

1. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen in der 10-cm-Schale. Waschen Sie die Zellen mit 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und aspirieren Sie sie.
2. 1 ml Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugeben und 3-5 Minuten bei 37 °C inkubieren, um die Zellen von der Schale zu lösen.
3. Geben Sie 9 ml vollständiges Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) zu den Zellen, um Trypsin zu neutralisieren, und pipettieren Sie wiederholt auf und ab, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erzeugen.
4. Sofort 20 μl Zellen in ein 1,7-ml-Röhrchen umfüllen und mit 20 μl Trypanblau-Färbung mischen. Zählen Sie die Zellen entweder mit einem automatisierten Zellzähler (Table of Materials) oder einem Hämozytometer.
5. Verdünnen Sie die Zellen auf 2 x 10⁵ Zellen/ml in vollständigem DMEM-Medium und geben Sie 2 mL in jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte (4 x 10,⁵ Zellen/Well). Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C und 10 % CO₂ inkubiert.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, 293FT-Zellen zu verwenden, die weniger als 20x durchlaufen wurden. Wir haben bereits festgestellt, dass die Verwendung von Zellen mit größeren Passagenzahlen zu reduzierten BRET-Verhältnissen und einer erhöhten Variabilität des Well-to-Well-Signals führen kann.

2. Zelltransfektion (Tag 2)

HINWEIS: Hier werden die Zellen mit den Expressionskonstrukten pCMV5-NanoLuc-CRAF und pCMV5-14-3-3ζ-Halo zusammen mit dem leeren Vektor pCDNA3.1 transfiziert (Abbildung 2).

1. Vor der Transfektion verdünnen Sie die N-BRET-Plasmide auf 5 ng/μl und pCDNA3.1 auf 100 ng/μl und nummerieren Sie einen Satz steriler 1,7-ml-Röhrchen.
2. Geben Sie 100 μl Transfektionsmedium (siehe Materialtabelle für Details) zusammen mit 5 ng pCMV5-NanoLuc-CRAF, 10 ng pCMV5-14-3-3ζ und 200 ng PCDNA3.1 in jedes Röhrchen.
3. Fügen Sie 2 μl Transfektionsreagenz hinzu (siehe Materialtabelle für Details) und wirbeln Sie es vorsichtig zum Mischen. Schleudern Sie die Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit am Boden der Röhrchen gesammelt wird, und inkubieren Sie dann 15 Minuten lang bei etwa 25 °C.
4. Transfektionskomplexe tropfenweise in die Zellen geben und 16-20 h bei 37 °C/10 % CO₂ inkubieren, damit die Halo- und Nano-markierten Proteine exprimiert werden können.
   HINWEIS: Die Zugabe einer Träger-DNA mit einem leeren Vektor (pCDNA3.1) ist unerlässlich, um eine hohe Transfektionseffizienz der N-BRET-Expressionskonstrukte zu erreichen. Das Versäumnis, einen leeren Vektor hinzuzufügen, führt zu einer verringerten Expression der 14-3-3ζ-Halo- und Nano-CRAF-Proteine und führt wiederum zu schwachen und inkonsistenten BRET-Verhältnissen, wie zuvor diskutiert²².

3. Neubeschichtung der Zellen (Tag 3)

HINWEIS: In diesem Schritt werden die Zellen auf eine 384-Well-Platte übertragen und entweder Halo 618-Ligand (+Ligand; Tabelle der Materialien) oder DMSO (+Fahrzeug) wird zum Ablesen der BRET-Emissionen in Schritt 4 hinzugefügt. Die verbleibenden Zellen werden für die Western-Blot-Analyse in Schritt 5 auf frische 6-Well-Kulturplatten überführt (Abbildung 2).

1. Sammeln Sie die folgenden Materialien und bereiten Sie den Arbeitsbereich wie unten beschrieben vor.
   1. In einem 37 °C warmen Wasserbad wird Trypsin-EDTA zusammen mit serumfreien Assay-Medien und 10 % FBS-supplementierten Assay-Medien vorerwärmt (siehe Materialtabelle für Details).
   2. Basierend auf der Anzahl der zu messenden Proben werden drei Sätze sterile 1,7-ml-Röhrchen (Set 1-3) und ein Satz sterile 15-ml-Röhrchen mit konischem Boden voretikettiert. Rüsten Sie eine Schwenkbecherzentrifuge mit 15-ml-Röhrcheneinsätzen aus und kühlen Sie sie auf 4 °C vor.
   3. Legen Sie die folgenden Gegenstände in die Gewebekulturhaube: Reagenzienreservoire, 384-Well-Gewebekulturplatten, 6-Well-Gewebekulturplatten, eine Mehrkanalpipette und -spitzen, Objektträger/Kammern für die Zellzählung und Trypanblau-Färbung (Materialtabelle) sowie die 1,7-ml-Röhrchen-Sets 1-3.
2. Ernten und zählen Sie die Zellen wie unten beschrieben.
   1. Aspirieren Sie das Medium aus den 6-Well-Platten und geben Sie 250 μl Trypsin-EDTA in die Zellen. Inkubieren Sie die 6-Well-Platten bei 37 °C, bis sich die Zellen abzulösen beginnen (3-5 Minuten).
   2. Geben Sie 1 ml 10 % FBS-supplementiertes Assay-Medium in jede Vertiefung, um das Trypsin zu neutralisieren, und pipettieren Sie kräftig auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.
   3. Übertragen Sie 1 ml der Zellsuspension in die vormarkierten 15-ml-Röhrchen. Geben Sie weitere 1 ml 10 % FBS-supplementiertes Testmedium in jedes der 15 ml-Röhrchen.
   4. Drehen Sie die Röhrchen 5x um, um sie zu mischen, und überführen Sie sofort 20 μl Zellsuspension in das Röhrchenset 1.
   5. Zentrifuge in der vorgekühlten Schwenkschaufelzentrifuge für 5 min bei ~250 x g. Mischen Sie während des Zentrifugationsschritts 20 μl Trypanblau-Färbung mit den Zellen im Röhrchensatz 1 und zählen Sie die Zellen dann entweder mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer. Typisch ist eine Ausbeute von 6-8 x 10⁵ Zellen/ml.
   6. Nehmen Sie die 15-ml-Röhrchen aus der Zentrifuge und saugen Sie das Medium aus den Zellpellets an. Resuspendieren Sie die Zellpellets auf 2 x 10⁵ Zellen/ml in serumfreien Assay-Medien und pipettieren Sie kräftig, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.
      HINWEIS: Die Verwendung von serumfreien Assay-Medien wird verwendet, um normale zelluläre Signalwege zum Stillstand zu bringen.
3. Plattieren Sie die Zellen in 384-Well- und 6-Well-Platten wie unten beschrieben.
   1. Drehen Sie die 15-ml-Röhrchen mehrmals um, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten, und übertragen Sie 500 μl auf 1,7 ml-Röhrchen Set 2 und Set 3.
   2. 0,5 μl DMSO (+Vehikel) zu Satz 2 und 0,5 μl Halo 618 Ligand (+Ligand) zu Satz 3 des Röhrchens hinzufügen und zum Mischen pipettieren.
   3. Übertragen Sie die Suspensionen der +Vehikel- und +Ligandenzellen in separate Vertiefungen mit Reagenzreservoiren. Übertragen Sie mit der Mehrkanalpipette (Materialtabelle) 40 μl der +Vehikel-Zellsuspension aus den Reagenzreservoiren in vierfache Vertiefungen der 384-Well-Kulturplatte. Wiederholen Sie diesen Schritt für die +Ligandenzellsuspensionen.
   4. Übertragen Sie die restlichen Zellen in frische 6-Well-Kulturplatten. Die 384-Well- und 6-Well-Platten über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.

4. Ablesen der BRET-Emissionen (Tag 4)

HINWEIS: In diesem Schritt wird das Nanoluziferase-Substrat (siehe Materialtabelle für Details) zu den Zellen in der 384-Well-Kulturplatte hinzugefügt und die N-BRET-Akzeptor- (618 nm) und Donor-Emissionen (460 nm) werden abgelesen (Abbildung 2). Anschließend werden die korrigierten BRET-Verhältnisse berechnet.

1. Erwärmen Sie serumfreie Assay-Medien in einem 37 °C warmen Wasserbad und tauen Sie das Nanoluziferase-Substrat bei 25 °C auf. Verdünnen Sie das Nanoluziferase-Substrat 1:100 in serumfreiem Assay-Medium und überführen Sie es in ein Reagenzreservoir. Bereiten Sie genug von dieser Mischung vor, um 10 μl in jede Vertiefung der 384-Well-Platte plus 10 % bis 15 % zusätzliches Volumen zu geben.
2. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette (Materialtabelle) 10 μl der Substratmischung in jede der Vertiefungen, die Zellen in der 384-Well-Kulturplatte enthalten. Drehen Sie die Platte vorsichtig 1 Minute lang, entweder manuell oder mit einem Orbitalschüttler.
3. Setzen Sie die 384-Well-Platte in den Multimode-Plattenleser ein und zeichnen Sie die 460-nm- und 618-nm-Emissionen für alle Wells auf, die Zellen enthalten.
   HINWEIS: Für den für diesen Schritt verwendeten Multimode-Plattenleser (siehe Materialtabelle für Details) wurde eine Lesehöhe von 6,5 mm mit einer Lesezeitmessung von 0,1 s verwendet. Bei Verwendung anderer Plattenleser können jedoch weitere Optimierungen erforderlich sein.
4. Berechnen Sie die rohen BRET-Verhältnisse für +Fahrzeug und +Ligand in MilliBRET-Einheiten (mBU) einzeln, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:
   
5. Berechnen Sie das korrigierte BRET-Verhältnis, indem Sie das +Fahrzeug-BRET-Verhältnis von dem des +Liganden subtrahieren (Ergänzende Tabelle 1).
   HINWEIS: Beim Vergleich der Ergebnisse mehrerer Experimente können die korrigierten BRET-Verhältnisse gepoolt und auf den Durchschnitt des Wildtype (WT) N-BRET-Paares, bestehend aus Nano-CRAF^WT und 14-3-3ζ^WT-Halo, normiert werden (Ergänzende Tabelle 1).

5. Bestätigung der Proteinexpressionsniveaus (Tage 4 und 5)

HINWEIS: In diesem Schritt werden die Zellen in den 6-Well-Platten lysiert und die Proteinexpressionsniveaus der Nano-CRAF- und 14-3-3ζ-Halo-Proteine durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die für die Halo- und Nano-Tags spezifisch sind, bestimmt. (Abbildung 2).

1. Fügen Sie dem NP40-Lysepuffer Protease- und Phosphatase-Inhibitoren hinzu (Materialtabelle), sodass 200 μl Lysepuffer pro Probe vorhanden sind.
2. Aspirieren Sie Medien von 6-Well-Platten, die Zellen enthalten. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL kaltem PBS und aspirieren Sie.
3. Geben Sie 125 μl NP40-Lysepuffer in jede Vertiefung und inkubieren Sie 6-Well-Platten bei 4 °C auf einer Wippplattform für 15 Minuten, um die Zellen zu lysieren.
4. Lysate auf Eis in 1,7 mL Röhrchen überführen und bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Legen Sie die geklärten Lysate wieder auf Eis und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit kommerziell erhältlichen Assays, wie z. B. Bradford- oder Bicinchoninsäure (BCA)-Assays.
5. Normalisieren Sie die Proteinkonzentration in allen Proben, indem Sie ein angemessenes Volumen an Lysat und NP40-Lysepuffer auf frische 1,7-ml-Röhrchen auf ein Gesamtvolumen von 100 μl übertragen.
6. Kochen Sie 5x Proteinprobenpuffer (Materialtabelle) für 1 min und fügen Sie jeder Probe 25 μl hinzu. Kochen Sie die Proben 5-6 Minuten lang und zentrifugieren Sie die Röhrchen dann kurz, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Probe im Boden des Röhrchens sammelt.
7. Laden Sie 25 μl Probe in jede Vertiefung mit doppelten Proteingelen (Gel 1 und Gel 2) und übertragen Sie dann Proteine auf Nitrozellulose- oder PVDF-Membranen unter Verwendung von Standard-Western-Blotting-Verfahren, wie zuvor beschrieben²².
8. Blockieren Sie die Membranen in 3 % BSA-PBS bei 25 °C für 30 Minuten und inkubieren Sie die Membranen dann über Nacht mit Halo-Antikörpern (1:1.000 Verdünnung; Gel 1) und entweder Nanoluziferase oder CRAF-Antikörper (1:500 Verdünnung; Gel 2) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, ergänzt mit 0,2 % Tween-20 (TBST; Tabelle der Materialien).
9. Waschen Sie die Membranen 1x für 5 min in 10 mL TBST und inkubieren Sie dann 1 h lang bei Raumtemperatur mit Anti-Maus-HRP-Sekundärantikörper, verdünnt 1:10.000 in TBST.
10. Membranen 3x auf einer Wippplattform in 10 mL TBST bei 25 °C für jeweils 5 min waschen. Entfernen Sie TBST und visualisieren Sie Proteinbanden mit ECL-Reagenzien und entweder einem Röntgenfilmprozessor oder einem anderen geeigneten Bildgebungssystem.

Wenn die Wechselwirkung von Nano-CRAF^WT und 14-3-3ζ-Halo wie in diesem Protokoll beschrieben durchgeführt wird, sollte sie korrigierte BRET-Verhältnisse von 50-60 mBU erzeugen (Abbildung 3A; Ergänzende Tabelle 1). CRAF enthält zwei phosphorylierungsabhängige 14-3-3-Andockstellen, die N'-Stelle und die C'-Stelle (Abbildung 1)⁸. Daher umfassen geeignete Kontrollen zur Verringerung der CRAF:14-3-3ζ-Bindung S259A und S621A, die die Phosphorylierung und damit die Bindung von 14-3-3 an die N'- bzw. C'-Stellen verhindern²⁵. Wie in Abbildung 3A gezeigt, reduziert Nano-CRAF^S259A das BRET-Signal um ~45% und^{Nano-CRAF S621A} um ~25%, während die Doppelmutante S259A/S621A (SS/AA) das CRAF:14-3-3 BRET-Signal fast vollständig abträgt. Darüber hinaus können die Ergebnisse mehrerer unabhängiger Experimente verglichen werden, indem zunächst die Ergebnisse jedes Experiments auf das durchschnittlich korrigierte BRET-Verhältnis normalisiert werden (Ergänzende Tabelle 1) und dann die Datenpunkte aus allen drei Experimenten zusammengefasst werden (Abbildung 3B). Die relativen Expressionsniveaus der markierten Proteine sollten ebenfalls durch Western-Blot-Analyse bestätigt werden (Abbildung 3). Es ist zu beachten, dass die Expressionsniveaus mutierter Proteine von denen von WT abweichen können, so dass die transfizierten Mengen mutierter DNA-Vektoren entsprechend angepasst werden müssen (Ergänzende Tabelle 1).

Es sollte auch beachtet werden, dass eine Optimierung dieses Protokolls erforderlich sein kann, insbesondere bei der Verwendung eines alternativen Plattenlesegeräts, Zelllinien oder Transfektionsreagenzien. Abbildung 4A zeigt die Ergebnisse eines Beispiel-Optimierungsexperiments, bei dem die Erhöhung der transfizierten Menge des pCMV5-14-3-3ζ-Halo-Akzeptorplasmids bei gleichzeitiger Beibehaltung der Menge des pCMV5-NanoLuc-CRAF-Donors dosisabhängig das BRET-Signal erhöht, das dann durch die Anwesenheit der 14-3-3-bindenden CRAF^{SS/AA-Mutante} reduziert wird. Wenn jedoch das Akzeptor-Donor-Verhältnis zu hoch ist, wird der Signalunterschied zwischen der Bindung von 14-3-3ζ-Halo an Nano-CRAF^WT und der Nano-CRAF^{SS/AA-Negativkontrolle} verringert, was wahrscheinlich die Bindungssättigung von Nano-CRAF^WT widerspiegelt. Sobald ein BRET-Verhältnis erreicht ist, das reproduzierbare Werte mit geringem Standardfehler erzeugt, ist eine weitere Erhöhung des Akzeptor-Donor-Verhältnisses nicht mehr erforderlich. Einer der Hauptvorteile dieser Assays ist die Möglichkeit, die Wechselwirkungen von Proteinen auf physiologischem Expressionsniveau zu messen. Bei der Entwicklung neuer N-BRET-Assays ist ein weiterer wichtiger Aspekt die Platzierung der Markierungen. Abbildung 4B zeigt den Effekt des Umschaltens des Halo-Tags vom C-Terminus zum N-Terminus von 14-3-3ζ auf die korrigierten BRET-Verhältnisse, die durch die Bindung von 14-3-3ζ an Nano-CRAF^WT und Nano-CRAF^SS/AA erzeugt werden. Zu diesem Zweck sollten DNA-Expressionskonstrukte für jede der möglichen Tag-Positionen generiert werden (Abbildung 4C) und ihre Auswirkungen auf die BRET-Verhältnisse sowohl des WT-Paares als auch auf das einer bekannten Negativkontrolle für die Bindung sollten evaluiert werden.

Abbildung 1: RAF-Regulation durch 14-3-3-Proteine. (A) Schematische Struktur der RAF-Kinasedomäne mit konservierten 14-3-3-Andockstellen. (B) Modelle der RAF-Regulation durch 14-3-3-Proteine. (C) N-BRET-Assay zur Messung der Wechselwirkungen von 14-3-3ζ, das mit einem C-terminalen Halo-Tag-Akzeptor fusioniert ist, und CRAF, das mit einem N-terminalen Nanodonor fusioniert ist. Der Energietransfer von Donor zu Akzeptor erzeugt das BRET-Signal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Wichtige Schritte zur Durchführung des CRAF:14-3-3 Lebendzell-BRET-basierten Assays. Gezeigt werden die fünf Hauptschritte, die in diesem Protokoll beschrieben sind, darunter: Aussaat, Transfektion und Neubeschichtung der Zellen, zusammen mit Methoden zum Lesen des BRET-Signals und zur Bestätigung der Expressionsniveaus der Halo- und Nano-markierten Proteine. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: CRAF:14-3-3 BRET-basierter Assay. N-BRET-Assay zum Vergleich der Wechselwirkungen von 14-3-3ζ-Halo mit Nano-CRAF -WT oder den Mutantenformen -S259A, -S621A und -S259A/S621A (SS/AA), von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie die CRAF:14-3-3-Bindung^{beeinträchtigen 25}. Die Expressionsniveaus des 14-3-3ζ-Halo (MW: 64 kDa.) und der Nano-CRAF-Varianten (MW: 93 kDa.) wurden mittels Western-Blot-Analyse untersucht. (A) Korrigierte BRET-Messwerte aus vier Replikatwells aus einem einzigen Experiment ± Standardabweichung (SD). (B) Korrigierte BRET-Messwerte aus drei unabhängigen Experimenten wurden gepoolt und auf Nano-CRAF^WT (auf 100) ± SD normiert. Die statistische Signifikanz wurde durch den Student's t-Test berechnet (Zwei-Schwanz-Test unter der Annahme gleicher Varianz). P<0.0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Schritte zur Assay-Optimierung. Die Auswirkungen der Co-Transfektion zunehmender Mengen von (A) 14-3-3ζ-Halo oder (B) Halo-14-3-3ζ mit einer konstanten Menge an Nano-CRAF -WT oder -SS/AA (S259A/S621A) auf das BRET-Signal ± SD. (C) Schematische Darstellung aller möglichen N-BRET-Paare, die durch Platzieren des Halo- oder Nano-Tags entweder auf dem N-Terminus oder dem C-Terminus jedes interessierenden Proteins (A und B) erzeugt werden. n = 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: Beispieldaten aus dem CRAF:14-3-3 BRET-basierten Assay. Die angegebenen Expressionskonstrukte wurden an Tag 2 in die Zellen transfiziert (oberer Abschnitt). Die rohen, korrigierten und normalisierten BRET-Messwerte wurden an Tag 4 (unterer Abschnitt) gemessen und berechnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Frühere Studien haben gezeigt, dass 14-3-3-Proteine eine entscheidende Rolle sowohl bei der Aktivierung als auch bei der Hemmung von RAF-Kinasen spielen. Das Verständnis, wie diese Bindungsereignisse reguliert werden und welche Auswirkungen die Modulation dieser Wechselwirkungen auf die RAF-Signalgebung und die RAF-gesteuerte Onkogenese hat, könnte neue therapeutische Schwachstellen aufdecken, die auf die CRAF-Funktion abzielen. Der Raf-Aktivierungszyklus wird jedoch durch eine Vielzahl von assoziierten Proteinen, posttranslationalen Modifikationen und Veränderungen der subzellulären Lokalisation unterstützt⁸, und daher müssen die Wechselwirkungen von RAF mit seinen Regulatoren unter lebenden Zellbedingungen gemessen werden, um diese Bedingungen vollständig zu rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen Proximity-basierten Assay, der das überlegene Signal-Rausch-Verhältnis und die spektrale Auflösung des Nanoluciferase-Halo N-BRET-Paares zur Messung der Wechselwirkungen von 14-3-3ζ und CRAF in lebenden Zellen nutzt.

Obwohl dieser Assay eine dringend benötigte Plattform für die Untersuchung der komplexen Wechselwirkungen von 14-3-3 und CRAF unter physiologisch relevanten Bedingungen bietet, weist er eine Reihe von Einschränkungen auf, die berücksichtigt werden sollten. Erstens, da gezeigt wurde, dass 14-3-3 sowohl bei der Autoinhibition als auch bei der Dimerisierung von RAF eine Rolle spielt⁸, können zusätzliche Kontrollen und experimentelle Ansätze integriert werden, um zwischen diesen Zuständen zu unterscheiden. Zum Beispiel kann dieser Assay in Verbindung mit dem zuvor entwickelten N-BRET-Autoinhibitionsassay durchgeführt werden, der eine direkte Auslesung von Veränderungen der RAF-Autoinhibition ermöglicht^12,22. Darüber hinaus könnten sich auch Kontrollen wie die CRAF-R401H-Mutation, die nachweislich die Dimerisierung von CRAF mit anderen RAF-Protomeren stört^15,26, als nützlich erweisen, um diese Funktionen zu entschlüsseln. Schließlich ist die Platzierung der Halo- und Nano-Tags für die Messung der CRAF:14-3-3-Interaktion optimiert, kann jedoch nicht garantieren, dass die Wechselwirkungen von CRAF oder 14-3-3 mit anderen Proteinen dadurch nicht beeinflusst werden, noch kann dieser Assay die Affinität der CRAF:14-3-3-Bindung, die Auswirkungen dieser Wechselwirkungen auf die CRAF-Aktivität oder den Ort in der Zelle, an dem diese Wechselwirkungen auftreten, bestimmen. Daher kann es auch notwendig sein, andere komplementäre Ansätze einzubeziehen, wie z. B. In-vitro-Bindungsassays, CRAF-Kinase-Assays und subzelluläre Lokalisierungsstudien 12,27,28,29.

Bei der Durchführung dieses Assays, oder auch bei jedem N-BRET-basierten Assay, gibt es eine Reihe von Faktoren, die berücksichtigt werden müssen. Wie in diesem Manuskript und in früheren Arbeiten²² gezeigt, ist das korrekte Transfektionsverhältnis der Konstrukte pCMV5-Halo (Akzeptor) und pCMV5-Nanoluciferase (Donor) zusammen mit einer geeigneten Negativkontrolle, wie z.B. einer Mutante, von der bekannt ist, dass sie die Bindung der POIs stört, entscheidend für die Optimierung und Prüfung dieser Assays. Die Erhöhung der Ausprägung der Halo-getaggten POI bei gleichzeitiger Beibehaltung des Anteils an Nano-getaggten POI führt zu höheren BRET-Verhältnissen. Sobald die Bindung jedoch gesättigt ist, pendelt sich das Signal ab und das Delta zwischen den LB- und bindungsbeeinträchtigten POIs wird reduziert, was eine Akzeptor-Donor-Optimierung erforderlich macht. Ein weiterer kritischer Faktor bei der Assay-Optimierung ist die Verwendung einer leeren Vektorträger-DNA, wie z. B. pCDNA3.1. Die Aufnahme von 200 ng pCDNA3.1. in der Transfektionsmischung erhöht die Expressionsniveaus der Halo- und Nano-markierten POIs erheblich und reduziert die Variabilität zwischen Replikat-Wells und Experimenten²². Da die Transfektionseffizienz jedoch zwischen Reagenzien und Zelllinien variieren kann, muss möglicherweise auch die Menge der Träger-DNA titriert werden, um eine optimale Expression des N-BRET-Paares zu erreichen, wie zuvor beschrieben²². Ein weiterer Faktor, der die BRET-Verhältnisse stark beeinflusst, ist die Platzierung von Tags. In der Tat kann der POI, welcher POI mit dem Halo-Tag und welcher mit dem Nano-Tag fusioniert ist und ob dieser Tag am N- oder C-Terminus des Proteins platziert wird, sowohl die Amplitude des BRET-Verhältnisses als auch die Fähigkeit der Negativkontrolle beeinflussen, dieses Signal zu reduzieren. Daher ist es auch wichtig, bei der Entwicklung neuer Assays jedes der möglichen N-BRET-Paare zu testen.

Die verbesserte Empfindlichkeit und spektrale Auflösung, die N-BRET gegenüber herkömmlichem BRET erreicht, ermöglicht die Messung schwächerer Wechselwirkungen und subtiler Veränderungen in der Bindung in lebenden Zellen. Der Nutzen dieser Assays für die Untersuchung von zellulären Signalereignissen wurde jedoch nicht vollständig erkannt. Insbesondere könnte dieser Assay wahrscheinlich für die Untersuchung der Interaktion von 14-3-3 mit anderen Kinasen, wie z. B. den anderen RAF-Kinasen ARAF und BRAF, angepasst werden und in Kombination mit zuvor veröffentlichten N-BRET-Assays zur Untersuchung der RAS:RAF-Bindung und der RAF-Autoinhibition ^22,30 die Grundlage für ein Toolkit zur Messung der RAF-Regulation unter Lebendzellbedingungen bilden. Darüber hinaus hat sich N-BRET als vielversprechende Plattform für das Screening von Lebendzellpräparaten³⁰ erwiesen, und daher kann dieser Assay auch für die Identifizierung von Verbindungen nützlich sein, die entweder die inhibitorischen Wechselwirkungen von 14-3-3 und RAF stabilisieren oder diejenigen stören, die an der RAF-Aktivierung beteiligt sind. Angesichts der hohen Stabilität des Nanoluziferase-Signals und der Fähigkeit moderner Plattenlesegeräte, gleichzeitig Akzeptor- und Donoremissionen zu detektieren, würde daraus auch folgen, dass diese Assays für die Messung der Wechselwirkungen von Signalproteinen in Echtzeit angepasst werden können, was für das Verständnis der Dynamik dieser Wechselwirkungen als Reaktion auf vorgeschaltete Stimulation oder medikamentöse Behandlungen von entscheidender Bedeutung sein wird.

Nichts offenzulegen.

Dieses Projekt wurde teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, unter der Projektnummer ZIA BC 010329 finanziert.