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Buscamos establecer un modelo porcino de insuficiencia cardíaca inducida por la obstrucción de la arteria circunfleja izquierda y un ritmo rápido para probar el efecto y la seguridad de la administración intramiocardial de células madre para terapias basadas en células.
Aunque se han logrado avances en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca (HF) después del infarto de miocardio (MI), la IC después de la MI sigue siendo una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Las terapias basadas en células para la reparación cardíaca y la mejora de la función ventricular izquierda después de la MI han atraído una atención considerable. En consecuencia, la seguridad y eficacia de estos trasplantes de células debe probarse en un modelo animal grande preclínico de IC antes del uso clínico. Los cerdos son ampliamente utilizados para la investigación de enfermedades cardiovasculares debido a su similitud con los seres humanos en términos de tamaño del corazón y anatomía coronaria. Por lo tanto, buscamos presentar un protocolo eficaz para el establecimiento de un modelo de IC crónica porcina utilizando la oclusión del balón coronario de pecho cerrado de la arteria circunfleja izquierda (LCX), seguido de un ritmo ventricular rápido inducido con la implantación del marcapasos. Ocho semanas más tarde, las células madre fueron administradas por inyección intramiocardio en el área de peri-infarto. A continuación, se evaluó el tamaño del infarto, la supervivencia celular y la función ventricular izquierda (incluyendo ecocardiografía, parámetros hemodinámicos y electrofisiología). Este estudio ayuda a establecer un modelo estable de HF animal grande preclínico para el tratamiento de células madre.
Las enfermedades cardiovasculares, la enfermedad de las arterias coronarias (CAD) en particular, siguen siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en Hong Kong y en todo el mundo1. En Hong Kong, se proyectó un aumento del 26% entre 2012 y 2017 del número de pacientes con CAD tratados en el marco de la Autoridad Hospitalaria2. Entre todos los CAT, el infarto agudo de miocardio (MI) es una de las principales causas de muerte y complicaciones posteriores, como la insuficiencia cardíaca (HF). Estos contribuyen a cargas médicas, sociales y financieras significativas. En pacientes con MI, la terapia trombolítica o la intervención coronaria percutánea primaria (PCI) es una terapia eficaz para preservar la vida, pero estas terapias solo pueden reducir la pérdida de cardiomiocitos (CM) durante la E. Los tratamientos disponibles son incapaces de reponer la pérdida permanente de CM, lo que conduce a fibrosis cardíaca, remodelación miocárdica, arritmia cardíaca y, finalmente, insuficiencia cardíaca. La tasa de mortalidad a 1 año después de mima es de alrededor del 7% con más del 20% de los pacientes que desarrollan IC3. En pacientes con IC en etapa terminal, el trasplante de corazón es la única terapia efectiva disponible, pero está limitada por la escasez de órganos disponibles. Las terapias novedosas son necesarias para revertir el desarrollo de la IC post-MI. Como resultado, la terapia basada en células se considera un enfoque atractivo para reparar los CM deteriorados y mejorar la función ventricular izquierda (LV) en la IC después de la MI. Nuestros estudios previos encontraron que el trasplante de células madre es beneficioso para la mejora de la función cardíaca después del trasplante intramiocardio directo en modelos animales pequeños de MI4,,5. Por lo tanto, se necesitan protocolos estandarizados preclínicos de LCA para animales grandes para probar aún más la eficacia y seguridad del trasplante de células madre antes del uso clínico.
En las últimas décadas se ha visto el uso generalizado de cerdos en la investigación cardiovascular para la terapia con células madre. Los cerdos HF son un modelo prometedor de investigación traslacional debido a su similitud con los seres humanos en términos de tamaño cardíaco, peso, ritmo, función y anatomía de la arteria coronaria. Además, los modelos de IC porcino pueden imitar a los pacientes con IC post-MI en términos de metabolismo de CM, propiedades electrofisiológicas y cambios neuroendocrinos en condiciones isquémicas6. El protocolo presentado aquí utiliza un modelo de HF de cerdo estandarizado, empleando una oclusión de globo coronario de pecho cerrado de la arteria circunflex izquierda (LCX) seguida de un ritmo rápido inducido por la implantación del marcapasos. El estudio también optimiza la vía de administración intramiocardial de células madre para el tratamiento de la IC post-MI. El propósito es producir un modelo animal porcino de infarto crónico de miocardio que se puede utilizar para desarrollar tratamientos que sean clínicamente relevantes para pacientes con CAD grave.
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos y los reglamentos de la Universidad de Hong Kong, y el protocolo fue aprobado por el Comité para el Uso de Animales Vivos en La Enseñanza y la Investigación (CULTAR) en la Universidad de Hong Kong.
NOTA: Para este estudio se utilizaron cerdos de granja hembra de 35-40 kg (9-12 meses de edad). El diagrama de flujo de este experimento se muestra en la Figura 1.
1. Procedimientos quirúrgicos
2. Protocolo postoperatorio
Mortalidad
En este estudio se utilizaron un total de 24 cerdos. Tres de ellos murieron durante la inducción de MI debido a la VT sostenida. Un animal murió en la cirugía a corazón abierto para la inyección celular debido al sangrado de la herida. Dos animales murieron a causa de una infección grave. Dos animales fueron excluidos debido a una ligera reducción de EF (reducción de la FEVI > 40% de la línea de base). Como resultado, 16 animales completaron todo el protocolo de estudio.
Función cardíaca y remodelación
El examen ecocardiográfico en serie mostró que la FEVI disminuyó significativamente de 68,23 a 3,52% al inicio hasta el 39,37 - 3,22%. La LVEDD aumentó significativamente de 3,6 a 0,5 a 4,8 a 0,4 y la LVESD aumentó significativamente de 2,5 a 0,3 a 3,9 a 0,4(Figura 4A) a las 8 semanas después de la inducción de LA MI. La FEVI y la LVESD mejoraron significativamente a 52,9 a 4,27% y 3,3 a 0,3 respectivamente en el grupo hiPSC-MSC 8 semanas después del trasplante, en comparación con el estado de MI(Figura 4A).
El +dP/dt y el ESPVR disminuyeron significativamente de 1.325 a 63 mmHg/s y de 3,9 a 0,4 al inicio a 978 a 45 mmHg/s y a 1,8 a 0,2 a 8 semanas después de la inducción de MI. La administración intramiocardio de hiPSC-MSC aumentó el +dP/dt y ESPVR a 1.127,4 a 50 mmHg/s y 2,6 a 0,3 a las 8 semanas después del trasplante de iPSC-MSC, en comparación con el estado mi(Figura 4B).
Espesor de la pared de Infarct
El espesor medio de la pared del infarto de LV se midió a partir de muestras de sección de 5-7 cm de espesor en serie en cada animal (Figura 5). El porcentaje de infarto de VL fue de 16 a 2%.
Supervivencia celular después del trasplante
No hubo supervivencia celular alrededor del lugar de inyección en el área del infarto 8 semanas después del trasplante, pero un pequeño número de los hiPSC-MSC de supervivencia fueron visibles en el área peri-infarto (Figura 6).
Arritmia ventricular inducible
La incidencia de taquirritmias ventriculares sostenidas inducibles podría aumentar fácilmente en animales con IC (10% al inicio frente a 75% 8 semanas después de la inducción de MI). El trasplante hiPSC-MSC no modifica significativamente el sustrato miocárdico subyacente para reducir la susceptibilidad a la VT (62,5% en el grupo hiPSC-MSCs 8 semanas después de la administración intramiocardial de hiPSC-MSC, Figura 7).
Figura 1: Diagrama de flujo del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Modelo porcino de infarto de miocardio. El modelo porcino de infarto de miocardio (MI) fue inducido por embolización de la arteria coronaria circunfleja izquierda (LCX, flecha roja) distal a la primera rama marginal obtusa. Esta arteria coronaria fue ocluida con inflado de globo y una inyección de microesferas de 700 m. La angiografía coronaria en pre-MI, inflación de globos y post-MI se realizó a través de un catéter guía 6F JR4 a través de la arteria carótida derecha. El plomo del marcapasos se insertó en la pared del ventrículo derecho (flecha azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Trasplante celular en un modelo porcino de MI. Sitios de inyección celular en la pared lateral alrededor del área del infarto del ventrículo izquierdo durante la toracotomía izquierda. La flecha azul muestra el área peri-infarto y la flecha roja muestra el área del infarto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La función cardíaca cambia después de MI. (A) Una imagen de ecocardiograma en modo M LV al inicio, MI y trasplante celular. LA FEVI, LVEDD, LVESD disminuyeron significativamente 8 semanas después de la inducción de MI y aumentaron significativamente en el grupo hiPSC-MSC 8 semanas después del trasplante celular. (B) Para evaluar la función cardiaca de los cerdos con insuficiencia cardíaca, el valor +dP/dt y el ESPVR se midieron con un procesador de señal fotovoltaica. La vena cava inferior (IVC) fue ocluida por inflación de globos (flecha azul) durante la evaluación ESPVR. Tanto el +dP/dt como el ESPVR disminuyeron significativamente después de la inducción de MI, y luego aumentaron significativamente en los grupos hiPSC-MSC 8 semanas después del trasplante. ANOVA seguido de Student-Newman-Keuls post hoc testing (SPSS, versión 14) se utilizó con el valor de 0.05 para la importancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El área de Infarto cambia después de MI. Lv muestras de dirección transversal seccionadas a 1 cm de espesor en cada corazón que contiene miocardio infarto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Supervivencia celular después del trasplante. El injerto de los hiPSC-MSC trasplantados se detectó mediante tinción inmunohistoquímica para antígeno nuclear antihumano (color rojo). Barra de escala a 100 m. Las flechas representan celdas positivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Las incidencias de taquiarritmias ventriculares sostenidas. (A) Taquiarritmias ventriculares (VT, flecha roja) inducidas por estimulación eléctrica programada intracardiaca in vivo. (B) La incidencia de VT aumentó significativamente después de la inducción de MI. El trasplante celular no aumentó la incidencia de VT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Adquisición de ecocardiogramas. El panel izquierdo muestra la posición del animal. El panel derecho muestra la posición de la sonda. El panel central muestra la imagen ecocardiográfica bajo esta posición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 2: Ubicación de los buques. Los cerdos fueron colocados en posición supina. Las incisiones para la arteria carótida y la arteria femoral se presentan como una línea roja. La vena yugular y la vena femoral estaban debajo de la arteria carótida y la arteria femoral respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los modelos animales estándar son de suma importancia para entender la fisiopatología y los mecanismos de las enfermedades y probar nuevas terapias. Nuestro protocolo establece un modelo porcino de HF inducido por el bloqueo de la arteria circunfleja izquierda y el ritmo rápido. Ocho semanas después de la inducción de MI, los animales desarrollaron un deterioro significativo de la FEVI, LVEDD, LVESD, +dP/dt y ESPVR. Este protocolo también prueba el método de administración de la terapia con células madre para la regeneración cardíaca mediante inyección intramiocardio. Se evalúa el tamaño del infarto y la función sistólica y diastólica cardíaca. Este estudio ayuda a establecer un modelo de IC animal grande preclínico estable y reproducible para el tratamiento con células madre, que es similar a los casos clínicos.
El bloqueo de LCX y el ritmo rápido se han utilizado ampliamente para crear modelos animales de HF en nuestros estudios anteriores7,,8. La LCX distal a la primera rama marginal obtusa fue ocluida, seguida de 4 semanas de ritmo ventricular derecho rápido. La isquemia del miocardio produce la pérdida de cardiomiocitos durante la MI, que causa fibrosis cardíaca, remodelación del miocardio y arritmia cardíaca. El ritmo ventricular da como resultado una dilatación significativa del VI, un deterioro no no osonmico de la contractilidad ventricular izquierda y una disfunción grave del VL9,,10. Las duraciones más largas de la isquemia y el ritmo rápido producen un modelo experimental progresivo de HF de baja producción para la investigación traslacional. Estudios previos establecieron modelos de insuficiencia cardíaca induciendo MI10. Sin embargo, la mortalidad de MI grave fue mayor y la reducción de la FEVI de la MI fue inestable. Por lo tanto, aplicamos un ritmo ventricular derecho rápido después de la obstrucción de la LCX para inducir un deterioro significativo de la función cardíaca. Como se puede ver en nuestros estudios anteriores, el modelo presentado aquí produce un tamaño estable de infarto, y la FEVI de este modelo se reduce al menos por debajo del 40% normal6,7,8. Si hubiera habido menos infecciones y sangrado, nuestra tasa de éxito modelo podría haber sido de alrededor del 80%.
Uno de los principales obstáculos para la aplicación clínica de las células madre es su pobre supervivencia e injerto después del trasplante. Estudios clínicos recientes y metanálisis11,12,13,14,15 no han demostrado ninguna mejora consistente en la función de la VL o el tamaño del infarto después de dicha terapia. Una de las posibles razones es la baja tasa de supervivencia de las células trasplantadas. Descubrir un método de administración óptimo desempeña un papel fundamental en las terapias con células madre. Comparando los tres métodos de trasplante celular, la administración intramiocardio es más eficiente que la administración intravenosa e intracoronaria debido a una mayor retención celular16,,17. Por lo tanto, seleccionamos una vía de administración intramiocardio para la entrega de iPSC-MSC en este estudio. Los resultados ecocardiográficos y los resultados hemodinámicos invasivos demostraron que la administración intramiocardial de iPSC-MSC mejoró la función IV de los cerdos hf post-MI 8 semanas después del trasplante celular. A pesar de la administración de fármacos inmunosupresores (un esteroide y ciclosporina), sólo se detectaron unas pocas células trasplantadas en el área de peri-infarto. No se detectó ninguna célula sobreviviente en el área infartada alrededor del sitio inyectado. Estudios anteriores también han encontrado una porción extremadamente pequeña de células madre en el miocardio infarto después del trasplante18,19,20,21. La pérdida celular durante la administración intramiocardio puede afectar los resultados experimentales. La forma de mejorar los métodos de administración y aumentar la tasa de residencia debe aclararse en estudios futuros.
La seguridad, especialmente la arritmogénesis, es otra preocupación vital con respecto a la práctica clínica con terapias basadas en células. Nuestro estudio reciente demostró que la administración intramiocardial de células madre embrionarias humanas (hESC) derivan CM aumentó la incidencia de taquiarritmias ventriculares no sostenidas espontáneas4. En nuestro modelo porcino post-MI HF, la incidencia de taquiarritmia ventricular no sostenida espontánea (tasa >180 bpm y >12 latidos) registrada por la monitorización de telemetría del marcapasos fue del 25% después de la inducción de MI, pero la VT sostenida podría inducirse fácilmente (80%). En este estudio, la incidencia de muerte súbita permanece inalterada con o sin administración de hiPSC-MSC. Además, el trasplante de hiPSC-MSC no modificó el sustrato miocárdico subyacente para reducir o aumentar la susceptibilidad a las arritmias ventriculares. Este resultado sugiere que el modelo de IC crónica de animales grandes podría utilizarse para la evaluación de la seguridad celular.
La evitación de infecciones y hemorragias es de suma importancia para el establecimiento exitoso de modelos animales. Para reducir el riesgo de hemorragia, se debe prestar atención para evitar cualquier daño a las arterias coronarias y las venas cardíacas. Dado que dos animales murieron de infección grave, se beneficiará una estrategia médica postoperatoria adecuada. Aquí, proporcionamos una estrategia médica postoperatoria como se indica a continuación: Administración intramuscular de enrofloxacino (7,5 mg/kg, SID) y buprenorfina (0,02 mg/kg, BID) combinados con administración oral de Amoxycilina/ácido clavulánico (12,5 mg/kg, SID) y carprofeno (2 mg/kg, SID) a todos los animales durante 1 semana después de la cirugía para prevenir la infección y aliviar el dolor.
En resumen, el método actual proporciona un modelo animal grande estable y reproducible clínicamente relevante de insuficiencia cardíaca para terapias basadas en células.
Los autores no tienen nada que revelar.
Los autores reconocen a Alfreda y Kung Tak Chung por su excelente apoyo técnico durante los experimentos con animales.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amiodarone | Mylan | - | - |
Anaesthetic machines and respirator | Drager | Fabius plus XL | - |
Angiocath | Becton Dickinson | 381147 | - |
Anti-human nuclear antigen | abcam | ab19118 | - |
Axio Plus image capturing system | Zeiss | Axioskop 2 PLUS | Axioskop 2 plus |
AxioVision Rel. 4.5 software | Zeiss | - | - |
Baytril | Bayer | - | enrofloxacin |
Betadine | Mundipharma | - | - |
CardioLab Electrophysiology Recording Systems | GE Healthcare | G220f | - |
Culture media | MesenCult | 05420 | - |
Cyclosporine | Novartis | - | - |
Defibrillator | GE Healthcare | CardioServ | - |
Dorminal | TEVA | - | - |
Echocardiographic system | GE Vingmed | Vivid i | - |
EchoPac software | GE Vingmed | - | - |
Electrophysiological catheter | Cordis Corp | - | - |
Embozene Microsphere | Boston Scientific | 17020-S1 | 700 μm |
Endotracheal tube | Vet Care | VCPET70PCW | Size 7 |
Ethanol | VWR chemicals | 20821.33 | - |
Formalin | Sigma | HT501320 | 10% |
IVC balloon Dilatation Catheter | Boston Scientific | 3917112041 | Mustang |
JR4 guiding catheter | Cordis Corp | 67208200 | 6F |
Lidocaine | Quala | - | - |
Mersilk | Ethicon | W584 | 2-0 |
Metoprolol succinate | Wockhardt | - | - |
Microtome | Leica | RM2125RT | - |
Mobile C arm fluoroscopy equipment | GE Healthcare | OEC 9900 Elite | - |
Pacemaker | St Jude Medical | PM1272 | Assurity MRI pacemaker |
Pacemaker generator | St Jude Medical | Merlln model 3330 | - |
Pressure-volume catheter | CD Leycom | CA-71103-PL | 7F |
Pressure–volume signal processor | CD Leycom | SIGMA-M | - |
Programmable Stimulator | Medtronic Inc | 5328 | - |
PTCA Dilatation balloon Catheter | Boston Scientific | H7493919120250 | MAVERICK over the wire |
Ramipril | TEVA | - | - |
Sheath introducer | Cordis Corp | 504608X | 8F, 9F, 12F |
Steroid | Versus Arthritis | - | - |
Temgesic | Nindivior | - | buprenorphine |
Venous indwelling needle | TERUMO | SR+OX2225C | 22G |
Vicryl | Ethicon | VCP320H | 2-0 |
Xylazine | Alfasan International B.V. | - | - |
Zoletil | Virbac New Zealand Limited | - | tiletamine+zolezepam |
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