Method Article
In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.
Pflanzliche Systeme sind als wertvolle Plattform für die Produktion rekombinanter Proteine als Ergebnis ihrer gut dokumentierten Potential für die flexible und kostengünstige Herstellung von qualitativ hochwertigen, bioaktive Produkte.
In dieser Studie verglichen wir die Expression eines Ziel humanen rekombinanten Protein in herkömmlichen Fermenter basierenden Zellkulturen (Bakterien und Insekten) mit pflanzlichen Expressionssysteme, sowohl transient und stabil.
Für jede Plattform beschrieben wir den Aufbau, die Optimierung und die Länge der Herstellungsverfahren, der Endproduktqualität und der Ausbeute und wir geprüft vorläufigen Herstellungskosten, die spezifisch für das ausgewählte rekombinante Zielprotein fusionieren.
Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass die Bakterien zur Produktion des Zielproteins ungeeignet aufgrund ihrer Akkumulation in unlöslichen Einschlusskörpern. Andererseits sind Pflanzenbasierte Systeme flexiblen Plattformen tKappe ermöglichen die Produktion des ausgewählten Proteins zu niedrigeren Kosten als die Baculovirus / Insektenzellsystem. Insbesondere angezeigten stabilen transgenen Linien die höchste Ausbeute des Endproduktes und vorübergehend exprimierenden Pflanzen der schnellste Prozessentwicklung. Allerdings können nicht alle rekombinanten Proteinen aus pflanzlichen Systemen profitieren, aber die beste Produktionsplattform sollte empirisch mit einer Fall-zu-Fall-Ansatz bestimmt werden kann, wie hier beschrieben.
Recombinant proteins are commercially mass-produced in heterologous expression systems with the aid of emerging biotechnology tools. Key factors that have to be considered when choosing the heterologous expression system include: protein quality, functionality, process speed, yield and cost.
In the recombinant protein field, the market for pharmaceuticals is expanding rapidly and, consequently, most biopharmaceuticals produced today are recombinant. Proteins can be expressed in cell cultures of bacteria, yeasts, molds, mammals, plants and insects, as well as in plant systems (either via stable- or transient-transformation) and transgenic animals; each expression system has its inherent advantages and limitations and for each target recombinant protein the optimal production system has to be carefully evaluated.
Plant-based platforms are arising as an important alternative to traditional fermenter-based systems for safe and cost-effective recombinant protein production. Although downstream processing costs are comparable to those of microbial and mammalian cells, the lower up-front investment required for commercial production in plants and the potential economy of scale, provided by cultivation over large areas, are key advantages.
We evaluated plants as bioreactors for the expression of the 65 kDa isoform of human glutamic acid decarboxylase (hGAD65), one of the major autoantigen in Type 1 autoimmune diabetes (T1D). hGAD65 is largely adopted as a marker, both for classifying and monitoring the progression of the disease and its role in T1D prevention is currently under investigation in clinical trials. If these trials are successful, the global demand for recombinant hGAD65 will increase dramatically.
Here, we focus on the expression of the enzymatically inactive counterpart of hGAD65, hGAD65mut, a mutant generated by substituting the lysine residue that binds the cofactor PLP (pyridoxal-5'-phosphate) with an arginine residue (K396R)1.
hGAD65mut retains its immunogenicity and, in plant and insect cells, accumulates up to ten-fold higher than hGAD65, its wild-type counterpart. It was hypothesized that the enzymatic activity of hGAD65 interferes with plant cell metabolism to such an extent that it suppresses its own synthesis, whereas hGAD65mut, the enzymatically-inactive form, can be accumulated in plant cells to higher levels.
For the expression of hGAD65mut, the use of different technologies, widely used in plant biotechnology, was explored here and compared to traditional expression platforms (Escherichia coli and Baculovirus/insect cell-based).
In this work, the recombinant platforms developed for the expression of hGAD65mut comprising traditional and plant-based systems were reviewed and compared on the basis of process speed and yield, and of final product quality and functionality.
1. Konstruktion von Expressionsvektoren
2. Expression rekombinanter Proteine
3. Expression rekombinanter Proteine Analysen
Eine Versuchsanordnung für die heterologe Expression eines rekombinanten Zielproteins in verschiedenen Produktionssystemen wird hier beschrieben. Der erste Schwerpunkt war der Aufbau der verschiedenen Plattformen durch Festlegung der optimalen Bedingungen für die Expression des Zielproteins in jedem System.
Die Expression des Target-Proteins, hGAD65mut, wurde dreifach induzierten E. coli-Kulturen. Nach 3 h der Expression bei 37 ° C wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation gesammelt und durch Beschallung lysiert. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden die löslichen Proteine von unlöslichen Einschlusskörpern getrennt und erste Analysen zeigten, dass hGAD65mut vorwiegend in unlöslichen Einschlusskörpern akkumuliert (Daten nicht gezeigt). Rekombinantes Protein Solubilisierung erforderte den Einsatz von Harnstoff 6 M, die für ihre starke Denaturierung Eigenschaften, stört RIA-Analyse, so dass nicht eine richtige Quantifizierung hGAD65mut. Es wurden mehrere Strategien seinen berichteten zum Begrenzen der Bildung von Einschlusskörpern, umfassend das Züchten der mikrobiellen Zellen bei niedriger Temperatur 11. Die Kulturen wurden bei 15 ° C und 20 ° C gezüchtet, und rekombinante Proteinexpression wurde bei den gleichen Temperaturen induziert. Wie in 1A gezeigt, ist die Solubilisierung hGAD65mut hergestellt bei beiden Temperaturen, wiederum erfordert Harnstoff (Spuren S2). So müssen niedrigen Temperaturen in diesem Experiment nicht verhindern hGAD65mut Bildung von unlöslichen Aggregaten.
Baculovirus-Vektoren, die die hGAD65mut Sequenz (Baculo.G65mut) wurde in adhärente Sf9-Zellkulturen exprimiert. V1 und V2 mit hohem Titer Aktien wurden hergestellt, und die leistungsfähigsten Infektionsbedingungen wurden die Bewertung verschiedener Virus Lagerbestand 5-50 ul eingestellt. Wie in 1B gezeigt, wurde die optimale Virusstammvolumen von 25 ul identifiziert, wodurch man 11,8 ± 0,8 ug rekombinantes Protein pro ml Kulturmedium, wie durch RIA untersuchtAnalyse (Tabelle 1).
Nach Infiltration, Zeitverlaufsanalyse von agroinfected N. benthamiana Blättern wurde in den beiden transienten Expressionssystemen durchgeführt. Für die pK7WG2 basierte System wurden Blattproben täglich im Bereich von 1-5 dpi gepoolt wurden gesamten löslichen Proteine (TSP) extrahiert und gleiche Mengen von TSP wurden durch Western-Blot (Figur 1C) analysiert. Diese Analyse hervorgehoben, dass die maximale Anreicherung von Ziel rekombinanten Proteins erreicht 2 DPI. Daher wurden die Blätter 2 dpi geerntet und die Proteinextrakte wurden durch RIA zur Messung von rekombinanten Proteinakkumulation, die einen Durchschnitt von 67,8 g / g FLW (Frischgewicht Blatt, Tabelle 1) zeigt, analysiert. Rekombinantes Protein Expressionsniveaus, mit diesem System kann weiter verbessert werden, durch Co-Infiltration der Blätter mit einem Suppressor posttranskriptioneller Gene Silencing (PTGS) wie P19 oder HC Pro 12.
DieGleichzeitig Gängen Nachweis erfolgte mit N. geführt benthamiana Blätter mit den magnICON Vektoren agroinfected: infizierte Blätter 1-8 dpi und gleiche Mengen von TSP wurden durch Western-Blot analysiert gesammelt. Diese Untersuchung zeigte, dass eine maximale rekombinanten Proteinakkumulation erhält 4 dpi (1D), mit einer mittleren Anreicherung des rekombinanten Proteins von 78,8 & mgr; g / g FLW (Tabelle 1), wie durch RIA untersucht.
Die Expression hGAD65mut in transgenen Tabakpflanzen wurde bereits berichtet 12 ist, zeigt, dass rekombinantes Protein-Spiegel signifikant unter unabhängig transformierten Linien variiert. Die leistungsfähigsten hGAD65mut T1 transgenen Pflanze war selbst gekreuzt und die daraus abgeleiteten Pflanzen (T2) wurden analysiert, um zu wählen wieder das beste Ergebnis erzielt man. Dieses Verfahren wurde über mehrere Generationen hinweg wiederholt werden, um eine homogene Produktionsplattform zu entwickeln, die Überprüfung der Leistung in jeder Generation von RIA, bis keineweitere Verbesserung erzielt (Daten nicht gezeigt). In Figur 1E ist eine repräsentative Western-Blot von T5 transgenen Pflanzen berichtet, in denen die Homogenität des rekombinanten Proteinausbeuten ist offensichtlich. Wie in 1F gezeigt ist, erhöht die durchschnittliche hGAD65mut Ausbeute von T2 bis T6 und erreichte Niveau von 99,1 & mgr; g / g FLW (Tabelle 1), und bei der Auswahl der Standardabweichung des Expressionsniveau gesunken.
Abb. 1: Platform-Setup Einrichten der besten Bedingungen für hGAD65mut Ausdruck in jeder Plattform. (A) E. coli induzierbare Expression Plattform. Bakterienzellen wurden bei 15 ° C oder 20 ° C. Oberplatte, Western-Blot von hGAD65mut in Zellextrakten (2 ug TSP pro Spur). Das untere Feld angebaut, Ladesteuerung mit Coomassie gefärbt. n.c. = Negativkontrolle, Bakterienzellen mit dem Vektor pDEST17 die Chloramphenicol-Resistenz-Gen enthält, transformiert sind; T insgesamt Proben; S1: Der Überstand nach der Beschallung und Zentrifugation; S2 und P: Der Überstand (1) und Pellet (2) nach dem Zentrifugieren der Probe in harnstoffhaltigen Puffer solubilisiert. (B), Baculovirus / Insektenzellen-Plattform. Folgende Virus Lagerbestand wurden getestet: 5, 25 und 50 & mgr; Oberplatte, Western-Blot von hGAD65mut in Zellextrakten (5 ug TSP pro Spur) Untere Tafel, Ladesteuerung mit Coomassie gefärbt... nc = Negativkontrolle, Extrakt aus nicht-transformierten Insektenzellen. (C) Eine vorübergehende Expression in N. benthamiana Pflanzen mit dem pK7WG2 Vektor. Die Proben wurden täglich gesammelt, 1-5 dpi (Spuren 1-5). Oberes Feld, Western-Blot von hGAD65mut in Blattextrakten (2,5 ug TSP pro Spur). Unteres Feld, Ladekontrolle mit Coomassie, wo die große Untereinheit gebeiztvon Rubisco ist offensichtlich. nc = Negativkontrolle, Pflanzen, die mit dem pK7WG2 Vektor, der das GFP-Markergen infiltriert. (D) Eine vorübergehende Expression in N. benthamiana Pflanzen mit magnICON Vektoren. Die Proben wurden täglich gesammelt, 1-8 dpi (Spuren 1-8). Oberes Feld, Western-Blot von hGAD65mut in Blattextrakten (5 ug TSP pro Spur). Unteres Feld, Ladesteuerung mit Coomassie gefärbt, wo die große Untereinheit von Rubisco ist offensichtlich, . nc = Negativkontrolle, Pflanzen nur mit pICH20111 5'-Modul und pICH14011 Integrase-Modul infiltriert. Die Zahlen geben molekulare Marker in kDa. pc = positive Kontrolle 15 ng der kommerziellen hGAD65 im Baculovirus / Insektenzellen-System produziert. (E) Eine stabile Expression in N. tabacum Pflanzen. Blattproben wurden von verschiedenen Pflanzen T5 (Spuren 1-11) gesammelt. Oberes Feld, Western-Blot von hGAD65mut in Blattextrakten (5 ug TSP pro Spur). Das untere Feld, Ladekontrolle befleckt with Coomassie. nc = Negativkontrolle, Wildtyp-Pflanzen. Die Zahlen geben molekulare Marker in kDa. pc = positive Kontrolle 15 ng der kommerziellen hGAD65 im Baculovirus / Insektenzellen-System produziert. (F) Stabile Expression in N. tabacum Pflanzen. Boxplot Darstellung hGAD65mut Akkumulation über mehrere Generationen abgeleitet besten Performance hGAD65mut T1 transgenen Tabakpflanze ab RIA Daten berechnet g / g FLW gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
System | [HGAD65mut] (& mgr; g / ml) | [HGAD65mut] |
Baculo / Insekten | 117,5 ± 7,7 | 11,8 ± 0,8 ug / ml Kulturmedium |
Transient | 22,6 ± 0,9 | 67,8 ± 2,7 pg / g FLW |
MagnICON | 26,3 ± 5,9 | 78,8 ± 17,8 pg / g FLW |
Elite T6 | 33,0 ± 3,8 | 99,1 ± 11,3 pg / g FLW |
Tabelle 1: hGAD65mut ergibt hGAD65mut Renditen in verschiedenen Plattformen - Fermenter-basierte (Baculo / Insekt) und pflanzlichen (pK7WG2- und magnICON in N. benthamiana und Elite-T6 in N. tabacum). Zweite Spalte - hGAD65mut Konzentration in Proteinextrakten (ug / ml). Dritte Säule - hGAD65mut Gehalt in frischem Blattgewicht (g / g FLW) für pflanzliche Plattformen und in Zellkulturmedium (ug / ml) für Fermenter-basierten Plattform.
Bakterienzellen, Baculovirus / Insektenzellen und Pflanzen: In dieser Studie wurden drei verschiedene Plattformen für die Expression eines rekombinanten humanen Proteins verglichen. (- MagnICON und pK7WG2 basiert - und stabile dh transient) Die Anlage-basierte Plattform wurde durch die Nutzung von drei weit verbreitete Ausdruck Technologien erforscht. Der für dieses Experiment, hGAD65mut, ausgewählten Zielproteins wurde zuvor in verschiedenen Systemen 13 zum Ausdruck gebracht, und seine Herstellung und Funktionalität sind leicht nachweisbar und messbar 14.
Bakterienzellen wurden keine effektive Produktionsplattform weil hGAD65mut gebildeten Einschlusskörper auch bei niedrigen Temperaturwachstumsbedingungen, was somit mühsam Solubilisierung und Rückfaltung in seine native Konformation zu erreichen. Tatsächlich ist die Haupt Versagen dieser Plattform zur Vermittlung komplexer rekombinanter Proteine die richtige Konformation des Endprodukts.
DieBaculovirus / Insektenzellen-Plattform vermittelt eine hohe Expression des immunreaktiven rekombinanten Proteins, aber die wichtigste Einschränkung dieses Expressionssystems sind die hohen Kosten der Kulturmedien erforderlich sind, um Insektenzellen zu wachsen. Es wurde geschätzt, dass die Gesamtproduktionskosten für 1 g hGAD65mut könnten € 700 in dieser Produktionsplattform zu erreichen (unter Berücksichtigung 9 L von Insektenzellkulturmedien erforderlich). Eine weitere Einschränkung dieses Ausdrucks Plattform ist die Notwendigkeit von sterilen Anbau von Insektenzellen, die Personal mit aseptischen Manipulation Fähigkeiten erfordert. Die verwendet werden, um Zellen zu infizieren virales Stockvolumen und den Zeitpunkt der Virusinfektion: Um eine rekombinante Proteinakkumulation zwei kritische Parameter müssen sorgfältig in diesem Expressionssystem gesteuert werden, zu gewährleisten. Weiterhin können die Reinigungsmittel für das gesamte lösliche Protein Extraktion aus Sf9-Insektenzellen verwendet werden, drastisch beeinflusst rekombinanten Proteins Solubilisierung.
Pflanzliche Systeme waren die meisten Vorteile platform hGAD65mut auszudrücken: die Anlage werden auch rekombinante Protein war immunreaktiv und in hohen Konzentrationen in das Blattgewebe akkumuliert. Vergleich verschiedener pflanzlicher Expressionssysteme wurden die höchsten Ausbeuten in stabilen transformierten Tabakpflanzen (Tabelle 1) und erreicht, wenn unter Berücksichtigung der gesamten Biomasse von Tabak gegenüber N. benthamiana, für vorübergehende Expression verwendet, ist die Gesamt höhere Produktivität der Tabak evident. Ist die Haupteinschränkung stabil transformierten Tabakpflanzen-basierte Plattform jedoch die Zeit für den Aufbau des Systems, die in unserer Studie wurde 20 Monate benötigt. Tatsächlich sollte eine homozygote Linie für die rekombinante Proteinexpression Homogenität ausgewählt werden, und es kann wiederholt erfordern selbstvernetzenden Zyklen, beginnend mit der höchsten T1 exprimierenden Linien. Insbesondere, wenn der ausgewählte T1 trägt mehr als eine Kopie der transgenen Merkmale kann das Zuchtprogramm von bis zu 3 Jahren.
Vorübergehende Expressionssysteme bot dieVorteil einer schnellen Upscaling durch Kurzintervall zwischen Transformation und Expression und den Aufbau des Expressionsplattform benötigt 4 Tage. Allerdings ist eine Beschränkung der pflanzliche transiente Systeme, dass deren Automatisierung kaum umsetzbar auf einem Labormaßstab sei denn gewidmet hochwertigen Anlagen für Agroinfiltration verwendet. Daher kann eine korrekte Berechnung für die großtechnische Produktion von hGAD65 Verwendung transient-basierte Systeme hier nicht durchgeführt werden. Auf der anderen Seite, kann spekuliert werden, dass die gesamten Herstellungskosten für 1 g an rekombinantem Protein mit T6 stabiler Tabaklinie kann bei weniger als Euro 5 berechnet werden (unter Berücksichtigung der Boden für den Anbau von 60 Tabakpflanzen). Um die effiziente Agroinfiltration und der Proteinherstellung mehrere kritische Parameter sollten sorgfältig kontrolliert werden, zu gewährleisten (Pflanzenentwicklungsstadium, zu wachsen und Infiltration Zustand Agrobacterium), wie bereits berichtet 15. Außerdem für jeden Ausdruck experimentieren eine bestimmte Zeitverlaufsanalyse solltedurchgeführt, um die dpi, die die höchste Akkumulation des rekombinanten Proteins ermöglicht auszuwählen.
Die hier diskutierten Beispiel kann als ein Proof-of-Prinzip Fallstudie, dass einige der spezifischen Vorteile der pflanzlichen Produktion gegenüber herkömmlichen Systemen beleuchtet werden. Insbesondere kann Tabak transgenen Linien homogen das rekombinante Protein exprimieren als wertvolle Plattform für die Massenproduktion von rekombinanten Proteinen, die in großen-Mengen benötigt werden.
The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this paper.
This work was supported by the COST action ‘Molecular pharming: Plants as a production platform for high-value proteins’ FA0804. The Authors thank Dr Anatoli Giritch and Prof. Yuri Gleba for providing the MagnICON vectors for research purposes.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast extract | Sigma | Y1333 | |
Tryptone | Formedium | TRP03 | |
Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | |
Sf-900 II SFM medium | Gibco | 10902-088 | |
Grace’s Insect Medium, unsupplemented | Gibco | 11595-030 | |
Cellfectin II Reagent | Invitrogen | 10362-100 | |
MS medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
Plant agar | Duchefa Biochemie | P1001 | |
Ampicillin sodium | Duchefa Biochemie | A0104 | Toxic |
Gentamycin sulphate | Duchefa Biochemie | G0124 | Toxic |
Ganciclovir | Invitrogen | I2562-023 | |
Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO |
Streptomycin sulfate | Duchefa Biochemie | S0148 | Toxic |
Spectinomycin dihydrochloride | Duchefa Biochemie | S0188 | |
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) | Sigma | I5502 | Toxic |
MES hydrate | Sigma | M8250 | |
MgCl2 | Biochemical | 436994U | |
Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
Syringe (1 ml) | Terumo | ||
MgSO4 | Fluka | 63136 | |
BAP (6-Benzylaminopurine) | Sigma | B3408 | Toxic |
NAA (Naphtalene acetic acid) | Duchefa Biochemie | N0903 | Irritant |
Cefotaxime | Mylan Generics | ||
Trizma base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer |
HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
NaCl | Sigma | S3014 | 1 M stock |
KCl | Sigma | P9541 | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) | Sigma | P7626 | Corrosive, toxic |
Urea | Sigma | U5378 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic |
Tween-20 | Sigma | P5927 | |
Hepes | Sigma | H3375 | |
DTT (Dithiothreitol) | Sigma | D0632 | Toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
CHAPS | Duchefa Biochemie | C1374 | Toxic |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | Do not freeze/thaw too many times |
SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flammable, toxic, corrosive – 10% stock |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
Isopropanol | Sigma | 24137 | Flammable |
Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67 | Sigma | G5163 | Do not freeze/thaw too many times |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
Sf9 Cells | Life Technologies | 11496 | |
BL21 Competent E. coli | New England Biolabs | C2530H | |
Protein A Sepharose | Sigma | P2545 | |
Cell culture plates | Sigma | CLS3516 | |
Radio Immuno Assay kit | Techno Genetics | 12650805 | Radioactive material |
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten