从羊膜中提取Lumican及其储存温度的测定

本协议描述了从羊膜（AM）中提取lumican及其储存条件作为AM提取物（AME）在-20°C，4°C和室温（RT）下6，12，20和32天以量化其蛋白质和lumican浓度。

Lumican是人羊膜（AM）中一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖，可促进角膜上皮化和胶原纤维的组织，保持角膜透明。本工作提出了一种从AM中提取蛋白质得到Lumican的方法。此外，还评估了在不同温度和时间段下储存的AM提取物（AME）中Lumican的稳定性。解冻100mgAM并机械去上皮化。将去上皮化的AM冷冻并粉碎，直至获得细粉，用2.5mL盐水缓冲液与蛋白酶抑制剂溶解并离心进行蛋白质提取。收集上清液并在-20°C、4°C和室温（RT）下保存6、12、20和32天。之后，在每个AME中量化Lumican。该技术允许从AM中提取lumican的可访问和可获取的方案。Lumican浓度受储存时间和温度条件的影响。Lumican在AME中在-20°C和4°C下储存12天明显高于其他AME。这种lumican提取可用于开发治疗方法和药物解决方案。需要进一步的研究来确定AME发光胶在再上皮化和伤口愈合过程中的用途。

角膜影响最常用的治疗方法之一是羊膜移植;然而，近年来，出现了使用羊膜组织的各种成分作为替代和辅助治疗的新建议。在研究最多的AM成分中，是从AM提取物（AME^）中获得的成分1，²，^3，4，⁵，^6，7。AM含有多种可溶性因子，例如抗血管生成蛋白，白细胞介素（IL），金属蛋白酶（TIMP）的组织抑制剂，由TSG-6介导的抑制中性粒细胞细胞外陷阱的抗炎蛋白，生长因子:表皮生长因子（EGF），转化生长因子（TGF）（α和β），角质形成细胞生长因子（KGF），肝细胞生长因子（HGF）和Lumican，通过调节胶原纤维生成来维持角膜透明度1^，2，³，⁴，⁵，⁶，⁷，^8，9.

Lumican是一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖（SLRP），是角膜基质基质中间质胶原酶的主要细胞外成分之一，负责组织胶原纤维并保持角膜透明度⁴，^10，11。蛋白聚糖是细胞外基质（ECM）中的分子，是进行细胞信号传导和维持细胞内稳态的主要分子¹²。据报道，ECM蛋白在伤口愈合过程中驱动细胞增殖，分化和迁移过程¹¹。

证据表明Lumican可能参与角膜再上皮化过程。Saika 等人在一项研究中表明，角膜损伤后，可以在损伤后的前 8 小时至最多 3 天内在角膜角质细胞中检测到 lumican。在第二天和第三天呈现最高浓度的lumican，该蛋白聚糖随后在第七天无法检测到¹³。这些数据表明Lumican参与角膜再上皮化过程的激活。另一方面，在另一项研究中，据报道，没有发光胶会延迟再上皮化;有趣的是，添加Lumican可以加速再上皮化过程⁴，^11，13。同样，最近的一项研究报告说，Lumican可以调节角膜缘成纤维细胞¹⁴的炎症功能，这表明Lumican作为炎症，抗纤维化和再上皮化反应的调节剂发挥作用。同样，lumican可以通过与Fas-FasL等信号分子相互作用来调节角膜反应。此外，在敲除Lum-^/-小鼠模型中没有Lumican表明缺乏lumican信号传导会阻止充分的角膜修复¹⁵。

该方法主要旨在展示一种从AM中提取lumican的可行且平易近人的方法。与以前的研究相比，使用这种有利的lumican提取方法可以获得相似浓度的蛋白质，从而减少了处理时间，并使研究人员更方便¹⁶。此外，这种AME发光胶可用作角膜修复和再上皮化过程的佐剂。

所有实验程序均已获得机构审查委员会的批准（项目编号:CEI-2020/06/04）。AM是从瓦伦西亚孔德羊膜库（来自去识别的人类受试者）获得的，该数据库是按照Chávez-García等人的描述制备的¹⁷。

1.羊膜提取物的制备

1. 从羊膜库获取 100 毫克 AM。
   注意:根据之前的报告，50 毫克 AM 总共分泌 10 ng/mL 的卢米康¹⁴。为了获得更高浓度的lumican，请使用100mg的AM，相当于总面积为32cm²。
2. 如果AM被冷冻，请在室温下解冻。
   注意:在 II B 级层流罩下执行以下步骤。
3. 用10mL无菌平衡盐溶液（BSS，参见 材料表）在培养皿中洗涤AM2分钟。
   1. 将 BSS 倒入烧杯中。
   2. 重复步骤3并目视确认培养皿BSS中不存在甘油培养基。
      注:重复步骤 3。根据需要，直到培养皿BSS中不存在甘油培养基。
4. 将AM与10mL分散酶II（1.7IU / mL，参见 材料表）在37°C，5%CO₂ 下孵育30分钟。
   注意:分散酶II是一种中性蛋白酶，对上皮细胞具有温和的活性。该酶有效地将完整的表皮与真皮分离，并分离完整的上皮片¹⁸。
5. 分散酶孵育后，用橡胶警察进行机械去上皮化¹⁴ （见 材料表）。通过显微镜可视化确认去上皮化。
   注意:去上皮化过程在使用4x和20x物镜的倒置显微镜中得到证实。可视化组织以排除任何细胞层的存在。
6. 用10mL BSS在培养皿中洗涤AM2分钟。将 BSS 倒入烧杯中。
7. 将去上皮化的AM（dAM）放入2 mL微量离心管中。将dAM浸入液氮中40分钟。
8. 在-85°C的预冷砂浆中手动研磨冷冻dAM2-3分钟，直到获得细粉。
9. 在研钵中，用 2.5 mL 蛋白酶抑制剂溶液（含蛋白酶抑制剂的 BSS）溶解 dAM 粉末。
   注意:每片蛋白酶抑制剂由以下酶混合物组成:胰腺提取物（0.02mg / mL），热溶酶（金属蛋白酶）（0.0005mg / mL），胰凝乳蛋白酶（0.002mg / mL），胰蛋白酶（0.02mg / mL）和木瓜蛋白酶（0.33mg / mL）（参见 材料表）。
10. 用微量移液管收集混合物，并在手术刀的帮助下清洁砂浆壁。将混合物放入 5 mL 管中。
11. 与涡旋充分混合30秒。
12. 通过在4°C下以34×g离心20分钟，并立即在4°C下以3360×g离心20分钟，使组织混合物匀浆。
13. 收集的上清液是AME（图1）。将 0.7 mL 的每个 AME 储存在不同的 2 mL 微量离心管中，在 -20 °C、4 °C 和室温 （RT） 的不同温度条件下储存 6、12、20 和 33 天。

图1:AME制备和lumican浓度测量的过程 。 将100mgAM与分散酶II在37°C孵育30分钟并机械去上皮化。将去上皮化的AM洗涤并浸入液氮中40分钟，然后粉碎直至得到细粉，用2.5mL盐水缓冲液与蛋白酶抑制剂溶解并离心。收集上清液并在-20°C，4°C和室温下储存6，12，20和32天，直到总蛋白质和Lumican定量。 请点击此处查看此图的大图。

2. AME蛋白定量

注意:AME中总蛋白的定量必须在获得后立即进行。使用Lowry蛋白测定法定量蛋白质，并遵循制造商的说明（参见 材料表）。建议将所有标准品和样品一式三份测定。

1. 将 40 μL 每个 AME 样品移液到 96 孔微孔板中。
   1. 使用牛血清白蛋白（BSA）标准品制备到同一微孔板中的标准曲线，最终BSA浓度为0-1，500μg/ mL（0，1，5，25，250，500，750，1，000和1，500μg/ mL）。
2. 将 200 μL 改良的 Lowry 试剂移液到每个孔中。立即在平板搅拌机上混合30秒。
3. 用铝箔覆盖微孔板，并在室温下孵育10分钟。
4. 将 20 μL 1x Folin-Ciocalteu 试剂移液到每个孔中。立即在平板搅拌机上混合30秒。
   注意:要制备 1x Folin-Ciocalteu 试剂，请用超纯水 1:1 稀释 2x （2N） 试剂。在使用当天准备1x Folin-Ciocalteu试剂，因为稀释的试剂不稳定。
5. 用铝箔从光上覆盖微孔板，并在室温下孵育30分钟。
6. 在ELISA板光谱仪中测量660nm处样品的吸光度（参见 材料表）。
   注意:可以在 650 nm 和 750 nm 之间的波长下测量颜色。
7. 平均标准空白样品的660 nm吸光度值，并从标准和未知样品的其他660 nm值中减去该值。
   1. 用ELISA板光谱仪在端点模式下以低振荡10秒测量吸光度。
8. 使用标准曲线确定每个未知样品的蛋白质浓度。
9. 对于蛋白质的计算，使用Y轴上的吸光度值与每条标准BSA曲线X轴上的mg / mL浓度（以mg / mL为单位）从线性回归图中确定浓度。
   1. 得到线性回归方程和r值来计算蛋白质浓度。
      注意:结果表示为总蛋白质相对于mg AM 的标准化相对浓度值（μg/mL 蛋白质/mg AM 组织）。

3. AME中Lumican的定量

注意:必须在不同储存条件和时间段储存的AME中测量Lumican的浓度。使用三明治ELISA量化Lumican并遵循制造商的说明。建议将所有标准品和样品一式两份测定。

1. 将人lumican捕获抗体（参见 材料表）稀释至磷酸盐缓冲盐水（PBS）中采用的浓度。
   注意:捕获抗体瓶含有120μg抗体。用 0.5 mL PBS 复溶后，在 2 μg/mL 的工作溶液中稀释捕获抗体。
   1. 立即将每孔 100 μL 稀释的捕获抗体移液至 96 孔微孔板中。封闭板并在室温下孵育过夜。
2. 吸出每个孔，并使用多通道移液器用 300 μL 洗涤缓冲液:0.05% 聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯 20 在 PBS、pH 7.2-7.4（参见 材料表）中移液洗涤。重复三次。
   注意:最后一次洗涤后，将盘子翻出，然后轻轻拍打纸巾，以去除任何剩余的洗涤缓冲液。
3. 通过向每个孔中加入 300 μL 试剂稀释剂来封闭板:PBS 中的 1% BSA，pH 7.2-7.4，0.2 μm 过滤（参见 材料表）。在室温下孵育1小时。
4. 重复步骤 2。
5. 使用0-8，000 pg/mL的两倍连续稀释液将标准曲线制备到96孔微孔板中，最终浓度为125、250、500、1，000、2，000、4，000和8，000 pg/mL。ELISA夜光聚糖试剂盒包含75 ng的重组夜光聚糖标准品（见 材料表）。
6. 在捕获抗体包被的 96 孔微孔板中加入 100 μL 样品和标准曲线。
7. 盖上微孔板，在室温下在紧凑型摇臂中以低搅拌孵育2小时，保持速度在2-3rpm之间。
8. 重复步骤 2。
9. 向每个孔中加入 100 μL 生物素化检测抗体（参见 材料表）。从光中盖上，并在室温下在紧凑型摇臂中以低搅拌孵育2小时，保持速度在2-3rpm之间。
   注意:生物素化检测抗体瓶含有24μg抗体。用 1.0 mL 试剂稀释剂复溶后，在 400 ng/mL 的工作溶液中稀释生物素化检测抗体。
10. 重复步骤 2。
11. 向每个孔中加入 100 μL 链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP，参见 材料表）的工作稀释液。从光上覆盖微孔板并在室温下孵育20分钟。
    注意:反应性链霉亲和素 HRP 的浓度为 40 倍。工作溶液1x链霉亲和素-HRP用试剂稀释剂制成。
    注意:避免将板放在直射光下。
12. 重复步骤 2。
13. 最后，向每个孔中加入 100 μL 底物四甲基联苯胺（TMB，参见 材料表）溶液。
    注意:用试剂盒中提供的等体积的稳定过氧化氢30%溶液制备TMB溶液。
    注意:使用前立即准备溶液并将其保持在室温下。
14. 在室温下在黑暗的地方孵育30分钟。
    注意:避免将板放在直射光下。不要吸出TMB溶液，因为不需要进一步洗涤。
15. 加入 50 μL 1N H₂SO₄ 终止液以停止比色反应。轻轻敲击盘子以确保充分混合。
16. 立即使用ELISA板光谱仪中设置为450nm的酶标仪确定每个孔的吸光度。
17. 用ELISA板光谱仪在端点模式下以低振荡10秒测量吸光度。
18. 平均标准空白样品的450 nm吸光度值，并从标准和未知样品的其他450 nm值中减去它。
19. 使用标准曲线确定每个未知样品的lumican浓度。
20. 为了计算Lumican浓度，使用Y轴上的吸光度值与每条标准lumican曲线X轴上的pg/mL浓度进行线性回归图。
    1. 得到线性回归方程和r值来计算发光胶浓度。
       注意:卢米康的浓度相对于提取的组织毫克标准化。结果表示为lumican与mg AM（ng / mL lumican/mg AM组织）的标准化相对浓度值。

结果报告为标准偏差 （SD） ±平均值。进行学生的 t检验和方差分析（方差分析）。 < 0.05 的 P 值被认为具有统计学意义。使用统计软件进行统计分析（见 材料表）。

AME中的总蛋白质量受时间和储存条件的影响。所有AME的基础蛋白浓度相似;总蛋白的范围为2.7±0.3μg/mL，评估的样品之间没有显着差异。然而，当样品储存12、20和32天时，观察到蛋白质浓度相对于基础浓度的变化。有趣的是，在储存的所有时间，AME中的蛋白质浓度在4°C和-20°C相对于RT增加。

同样，当比较储存时间之间的蛋白质浓度时，它在12天，20天和32天后发生变化。与RT条件相比，在4°C和-20°C下32和20天的AME中发现了显着差异（p < 0.05）（图2），这表明温度对于获得的不同AME中的蛋白质保存很重要。

图 2:AME 中的总蛋白浓度受时间和储存温度的影响。 在温度和时间储存条件之前和之后量化AME上蛋白质提取的浓度。与三种不同的温度条件（室温°C、4°C和-20°C）相比，评估的储存时间为6天（黑色三角形）、12天（粉红色三角形）、20天（紫色方块）和32天（棕色圆圈）。所有AME的基础蛋白浓度相似。在不同温度条件下，AME中20和32 d的蛋白质浓度相对于基础蛋白质浓度有显着差异。在每个条件下 n = 3。数据表示为蛋白质± μg/mL SE *p < 0.05 的中位数（4 °C 时 S1 32 天与 S1 20、12 和 6 天）;（S1 32 天与 -20 °C 下的 S1 20、12 和 6 天）。 请点击此处查看此图的大图。

Lumican浓度受储存时间和温度条件的影响。与储存12天相比，在储存6、20和32天的AME中发现的lumican浓度较低。显著的是，12 d的AME的发光聚糖浓度高于储存的20天和32天（p < 0.05）。

当在储存温度之间比较AME中的lumican浓度时，如果在-20°C和4°C下储存12天，则发现Lumican浓度更高（图3）。有趣的是，如果在-20°C下储存，与4°C相比，在AME的12天中发现甚至更高（p < 0.05）浓度的lumican。

这表明Lumican的浓度受温度条件和储存时间的影响，表明达到Lumican最高浓度的适当储存时间和温度是在-20°C下12天。

图 3:AME 中的总发光聚糖浓度受时间和储存温度的影响。 Lumican浓度受储存时间和温度条件的影响。在温度和时间储存条件之前和之后量化AME中lumican的浓度。与三种不同的温度条件（室温°C、4°C和-20°C）相比，评估的储存时间为6天（黑色三角形）、12天（粉红色三角形）、20天（紫色方块）和32天（棕色圆圈）。在-20 °C和4 °C的温度条件下，AME 12 d的Lumican与AME的32、20和6 d相比显着更高。 *p < 0.05（S1 12 天与 S1 4 °C 下的 32、20 和 6 天）;p < 0.001（-20°C 时 S1 12 天与 S1 32、20 和 6 天）。AME中Lumican的最高浓度在-20°C下储存12天++p <0.01（S1 12天4°C与S1 12天-20°C）。与储存温度条件（n.s）相比，32天和20天的AME中的lumican之间没有显着差异。在每个条件（n = 3）中，数据表示为蛋白质ng / mL的中位数。数据根据组织毫克数±SE.（n.s.）进行标准化，而不是统计学意义。 请点击此处查看此图的大图。

本研究分析了AME中Lumican的存在及其在不同储存条件下的稳定性的直接相关性。有趣的是，当AME中的总蛋白质浓度被量化时，储存后蛋白质浓度增加。有证据表明，有三种机制可以改变冷冻储存中的蛋白质浓度:冷变性、溶质的冷冻浓度和冰诱导的蛋白质结构部分展开¹⁹。由于样品中液相的结晶，冷冻过程可能会影响储存样品上的蛋白质浓度。结果表明，这可能是冷冻浓度的过程，受冰箱中储存时间的影响。在较长的储存时间（32天和20天）和最冷的温度（4°C和-20°C）下观察到较高浓度的蛋白质。然而，蛋白质浓度最高的时期没有卢米康浓度最高的时期;这表明Lumican可能会受到冻结温度和时间条件的影响。

根据结果，在4°C和-20°C下储存12天时，lumican浓度更高且更稳定。 尽管如此，与12天相比，在6天时发现的lumican浓度较低。一些报告表明，冷冻储存条件后蛋白质浓度可能会发生变化²⁰。结果可能是由一种称为冰诱导蛋白质结构部分展开的热力学机制引起的，该机制发生在样品冷冻期间。蛋白质与水溶液中水的相互作用减少了它们与其他分子的相互作用。水在冷冻条件下的结晶过程允许蛋白质和一些功能区域与其他分子相互作用¹⁹。通过上述，在水溶液中冷冻Lumican12天后，它可以与ELISA定量试剂盒中存在的抗体相互作用，从而产生更高的浓度。另一方面，可能在第六天，lumican可能被隔离在水溶液中。

在推进创新的过程中，无论病因如何，AM的使用都是角膜再上皮化的最新治疗方法。如前所述，AM的好处是巨大的²¹，22，23，24，^25，26。许多作者已经证明了lumican在AME中的益处，使其成为发展中国家负担得起的替代品¹，²，³，⁴，⁵，⁶，⁷，^8，9。目前，lumican在AME中有很多好处;它用作治疗有利于角膜再上皮化并改善角膜溃疡的预后⁴，⁵，⁶，⁷，⁸，9，¹⁰，¹¹，^12，13，^14，15。AM移植（AMT）已成为一种对改善各种角膜疾病具有巨大益处的治疗方法^24，25。然而，角膜组织有一些慢性影响，例如持续性上皮缺陷（PED）和角膜缘干细胞缺陷（LESCD），需要不断治疗和维持有助于角膜修复的生物因素的存在^21，24。目前，没有辅助治疗可以长期维持AMT在角膜表面释放的因子。然而，为了患者安全，不建议持续更换^AMT26。出于这个原因，有必要开发替代方案，使AMT的功能能够协助并帮助维持AM在角膜组织中释放的因子（例如Lumican）的存在更长时间，旨在有利于治疗角膜的持续问题²⁷。

Lumican是AM中存在的具有抗炎和抗纤维化功能的因素之一，据报道其在角膜修复过程中具有功能⁶，⁷，⁸，⁹，^{10，11，12，13}，^14，15.这就是为什么Lumican建议成为帮助治疗角膜情感的好人选;然而，需要进一步的研究来确定Lumican在AME中实现角膜再上皮化的功效。

Lumican是一种蛋白聚糖，已被证明可以调节细胞外基质化合物作为胶原蛋白的分泌;此外，它还参与成纤维细胞的活化和炎症细胞的调节以及血管生成过程，在伤口愈合中起重要作用。根据结果，可以从AM组织中提取Lumican。夜光聚糖的治疗应用很多;在AME中使用Lumican可以为眼部疾病提供可实现的治疗选择^4，13。使用AME的主要优点是，鉴于其水性成分，它提供了作为眼表局部治疗的简单应用。同样，在从AM组织中提取的成分中可以找到具有抗炎和免疫调节特性的其他蛋白质，这可能在治疗眼睛的去上皮化问题方面具有更大的益处。例如，AM和细胞成分中存在的其他抗炎因子如TSG-6先前已被报道具有免疫调节特性⁸。因此，AME中存在的lumican和其他细胞外基质化合物和免疫调节分子的联合治疗可用于再上皮化和伤口愈合过程。

该方法旨在展示一种简单的蛋白质提取技术，可用于获得丰富的蛋白质和因子。这种方法的关键考虑因素之一是使用蛋白酶抑制剂，因为它是成功提取蛋白质的基础，因为AM是一种具有大量酶化合物的组织，以防止蛋白质降解²⁷。有证据表明，将蛋白质抑制剂与水溶液结合使用可增加AM组织中其他因子（如HGF）的提取²⁶。在冷冻和接地AM后获得细粉对于AME的最佳获得是必要的，因为该过程适用于提取胞质和其他核化合物所需的组织和细胞破坏结构^28，29。

这种提取方法的一些局限性是所使用的AM量不允许大规模提取。该协议允许从有限量的组织中提取蛋白质;由于没有证据表明这种方法允许从更大的组织区域获得更多的蛋白质。与其他提取方法相比，要考虑的故障排除是使用合适浓度的蛋白酶抑制剂和孵育时间，因为过量的酶可能会影响蛋白质³⁰ 并降低该技术的功效。

该技术的一部分是从Mahbod等人¹⁶报道的修改而来的，该技术描述了重复离心和提取过程会增加蛋白质提取。与Mahbod相反，结果没有报告三个离心周期后的蛋白质浓度。当确定总蛋白质浓度时，它在第二次提取中下降了80%，在第三次提取中下降了97%。仅进行一次提取可减少处理时间，并且不会减少总蛋白质的量。如上所述，此处报告的提取方法只需要一个离心步骤即可获得良好的结果。

该技术可用于提取AM中存在的其他因子和蛋白质，并进一步从其他来源（例如动物或蔬菜）获得因子。它还可以用于获取蛋白质以进行基础研究，甚至开发配方和治疗方法。

这些结果表明，lumican可以从AM中提取，并在-20°C和4°C温度条件下以AME形式储存12天。重要的是要考虑其半衰期以达到Lumican作为AME的治疗效果。需要进一步的研究来确定AME发光胶在角膜上皮细胞中的作用，并确定用于角膜再上皮化的理想剂量。

总之，结果表明，在AME中获得诸如lumican之类的因子是可能的。同样，温度和储存时间条件会影响AME中存在的lumican的浓度。

该研究由墨西哥国立自治大学研究和技术创新项目支持计划（批准号PAPIIT IN203821）和教育，科学，技术和创新部（批准号SECTEI 250/2019）资助。

作者没有相互竞争的经济利益。