JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نظهر طريقة لتطبيق إجهاد القص السائل على الخلايا السرطانية المعلقة لنمذجة آثار الإجهاد الدموي على الخلايا السرطانية المتداولة.

Abstract

أثناء الانبثاث ، والخلايا السرطانية من الأنسجة الصلبة ، بما في ذلك الظهارة ، والوصول إلى الدورة الدموية اللمفاوية والهيماتوجينية حيث يتعرضون للإجهاد الميكانيكي بسبب تدفق الدم. واحدة من هذه الضغوط أن الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) تجربة الإجهاد القص السوائل (FSS). في حين أن الخلايا السرطانية قد تواجه مستويات منخفضة من FSS داخل الورم بسبب التدفق الخلالي ، تتعرض CTCs ، دون ارتباط مصفوفة خارج الخلية ، لمستويات أعلى بكثير من FSS. من الناحية الفسيولوجية ، يتراوح FSS على 3-4 أوامر من الحجم ، مع مستويات منخفضة موجودة في اللمفاويات (<1 dyne / cm2)وأعلى المستويات موجودة لفترة وجيزة مع مرور الخلايا عبر القلب وحول صمامات القلب (>500 dynes / cm2). هناك عدد قليل من النماذج في المختبر مصممة لنموذج نطاقات مختلفة من الإجهاد القص الفسيولوجية على أطر زمنية مختلفة. تصف هذه الورقة نموذجا للتحقيق في عواقب نبضات قصيرة (مللي ثانية) من FSS عالية المستوى على بيولوجيا الخلايا السرطانية باستخدام حقنة بسيطة ونظام إبرة.

Introduction

الانبثاث ، أو انتشار السرطان خارج موقع الورم الأولي ، هو عامل رئيسي وراء وفيات السرطان1. خلال الانبثاث ، تستخدم الخلايا السرطانية نظام الدورة الدموية كطريق سريع لنشره في المواقع البعيدة في جميع أنحاء الجسم2،3. بينما في الطريق إلى هذه المواقع, الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) موجودة داخل البيئة الدقيقة السائل الديناميكي على عكس ذلك من الورم الأساسي الأصلي3,4,5. وقد اقترح أن هذه البيئة الدقيقة السائل هو واحد من العديد من الحواجز التي تحول دون الانبثاث4. هناك اتفاق واسع في مفهوم عدم الكفاءة النقيلي، أي أن معظم CTCs دخول الدورة الدموية إما يهلك أو لا تشكل مستعمرات النقيليالمنتجة 6،7،8. غير أن السبب في عدم كفاءة الانبثاث من منظور فرادى لجنة مكافحة الإرهاب أقل يقينا ولا يزال مجالا نشطا للتحقيق. يتم فصل CTCs من مصفوفة خارج الخلية ، وحرمانها من عوامل النمو القابلة للذوبان والبقاء على قيد الحياة التي قد تكون موجودة في الورم الأساسي ، وتتعرض للجهاز المناعي والقوى الدموية بطريقة مختلفة كثيرا عن الورم الأساسي4. وقد يسهم كل عامل من هذه العوامل في ضعف بقاء البلدان المحوسبة، ولكن مساهماتها النسبية غير واضحة. تتناول هذه الورقة مسألة كيفية تأثير القوى الديناميكية الدموية على مركبات الكربون الكلورية فلورية.

إن دراسة آثار القوى الديناميكية الدموية على مركبات الكربون الكلورية فلورية أمر صعب للغاية. حاليا، لا توجد أنظمة هندسية في المختبر التي يمكن أن تكرر كامل ديناميات الصدغية (القلب إلى الشعيرات الدموية) والخصائص الريولوجية للنظام الأوعية الدموية البشرية. وعلاوة على ذلك، فإن كيفية تجربة أجهزة مكافحة الإرهاب لنظام الدورة الدموية ليست واضحة تماما. تشير الأدلة التجريبية إلى أن معظم الخلايا السرطانية لا تدور باستمرار مثل خلايا الدم. بدلا من ذلك ، نظرا لحجمها الكبير نسبيا (10-20 ميكرومتر في القطر) ، تصبح معظم CTCs محاصرة في أسرة شعرية (قطرها 6-8 ميكرومتر) لأطوال زمنية متغيرة (ق إلى أيام) حيث قد تموت أو تتغلغل أو يتم إزاحتها إلى السرير الشعري التالي8و9و 10و11. ومع ذلك، هناك بعض الأدلة على أن حجم لجنة مكافحة الإرهاب قد يكون أكثر تغايرا في الجسم الحي، وأن أصغر CTCs يمكن الكشف عنها12. لذلك ، استنادا إلى المسافة وسرعة تدفق الدم ، قد تدور CTCs بحرية فقط لبضع ثوان بين فترات الفخ هذه ، على الرغم من أن الوصف الكمي لهذا السلوك يفتقر إلى13.

وعلاوة على ذلك، اعتمادا على المكان الذي تدخل فيه CTCs الدورة الدموية، فإنها قد تمر عبر أسرة شعرية متعددة في الرئة وغيرها من المواقع الطرفية وعبر القلب الأيمن والأيساري قبل الوصول إلى وجهتها النهائية. على طول الطريق، تتعرض CTCs لضغوط ديناميكية دموية مختلفة بما في ذلك إجهاد القص السائل (FSS)، والقوى الضاغطة أثناء فخها في الدوران الدقيق، وربما، قوى الجر في ظل ظروف قد تظهر فيها مثل الكريات البيض المتداول على طول جدران الأوعية الدموية14. وبالتالي، فإن القدرة على نمذجة الدورة الدموية وفهم سلوك لجنة مكافحة الإرهاب على غرار محدودة. وبسبب هذا عدم اليقين، ينبغي التحقق من صحة أي نتائج من أنظمة النموذج المختبري في كائن فقري تجريبي، وفي نهاية المطاف، في مرضى السرطان.

مع المحاذير المذكورة أعلاه، توضح هذه الورقة نموذجا بسيطا نسبيا لتطبيق FSS على الخلايا المعلقة للتحقيق في آثار FSS على CTCs الموصوفة لأول مرة في عام 201215. تنتج FSS عن احتكاك تدفق الدم ضد جدار السفينة ، والذي ينتج تدرج سرعة مكافئة في ظل ظروف تدفق صفح في الأوعية الأكبر. تواجه الخلايا مستويات أعلى من FSS بالقرب من جدران الأوعية ومستويات أقل بالقرب من مركز الأوعية الدموية. تؤثر لزوجة السوائل ومعدل التدفق وأبعاد القناة التي يحدث من خلالها التدفق على FSS ، كما هو موضح في معادلة Hagen-Poiseuille. وهذا ينطبق على تدفق الدم يتصرف سوائل النيوتونية، ولكن لا يحمل لميكروسيرانج. يتراوح FSS الفسيولوجية على عدة أوامر من الحجم مع أدنى المستويات في اللمفاويات (<1 dyn/cm2)وأعلى في المناطق المحيطة صمامات القلب واللويحات تصلب الشرايين (>500 dyn/cm2)5. متوسط جدار القص الإجهاد في الشرايين هو 10-70 دين / سم2 و 1-6 dyn/cm2 في الأوردة16،17.

في القلب، قد تتعرض الخلايا لتدفقات مضطربة حول منشورات صمام حيث عالية المستوى جدا، ولكن قصيرة الأجل جدا FSS قد تكون من ذوي الخبرة18،19. على الرغم من أن مجال المعالجة الحيوية قد درس منذ فترة طويلة آثار FSS على خلايا الثدييات في التعليق ، قد تكون هذه المعلومات ذات قيمة محدودة لفهم آثار FSS على CTCs لأنها تركز بشكل عام على مستويات أقل بكثير من FSS المطبقة على مدى فترة طويلة20. كما هو موضح أدناه، وذلك باستخدام حقنة وإبرة، يمكن للمرء تطبيق عالية نسبيا (عشرات إلى آلاف dyn/cm2) FSS لمدة قصيرة نسبيا (مللي ثانية) إلى تعليق الخلية. منذ الوصف الأولي لهذا النموذج15, وقد استخدمت آخرين لدراسة آثار FSS على الخلايا السرطانية21,22,23. يمكن تطبيق "نبضات" متعددة من FSS على تعليق الخلايا في فترة قصيرة من الزمن لتسهيل التحليلات التجريبية في المصب. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذا النموذج لقياس قدرة الخلايا على مقاومة التدمير الميكانيكي من قبل FSS عن طريق قياس صلاحية الخلية كدالة لعدد البقول المطبقة. بدلا من ذلك، يمكن استكشاف آثار التعرض ل FSS على بيولوجيا الخلايا السرطانية عن طريق جمع الخلايا لمجموعة متنوعة من التحليلات المصب. الأهم من ذلك، يتم حجز جزء من تعليق الخلية كتحكم ثابت لمقارنة آثار FSS من تلك التي قد تكون مرتبطة بانفصال الخلية والوقت الذي يحتفظ به في التعليق.

Protocol

1. إعداد الخلية

  1. حرر الخلايا من طبق زراعة الأنسجة عند التقاء 70-90٪ باتباع الإرشادات الموصى بها لخط الخلية قيد الاستخدام.
    1. على سبيل المثال، يستنشق متوسط النمو لخلايا PC-3، ويغسل طبق 10 سم من الخلايا مع 5 مل من المالحة الخالية من الكالسيوم والمغنيسيوم الفوسفات المخزنة (PBS).
    2. يستنشق برنامج تلفزيوني قبل إضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
    3. بعد مراقبة انفصال الخلايا تحت المجهر المقلوب ، أضف 5 مل من DMEM: F12 المتوسطة التي تحتوي على مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ لمنع التريبسين.
  2. ضع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي.
  3. تحديد تركيز الخلية وإجمالي عدد الخلايا.
  4. خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي (300 × غرام لمدة 3 دقائق)، يستنشق الخلايا الفائقة، وإعادة الإنفاق في زراعة الأنسجة الخالية من المصل المتوسطة إلى 5 × 105 خلايا / مل.
    ملاحظة: من المهم أن متوسطة المقايسة يحتوي على ما لا يقل عن 1.17 mM Ca++ كما تم إثبات Ca++ خارج الخلية لتكون مطلوبة للمقاومة الخلوية ل FSS15.

2. التعرض للإجهاد القص السوائل

  1. قبل تعريض الخلايا ل FSS، قطع أنبوب البوليسترين 14 مل من القاع عند خط 7 مل. اخلط تعليق الخلية، وضع 5 مل من التعليق في أنبوب القطع، وجمع عينات التحكم ثابتة.
    ملاحظة: وحدة التخزين المطلوبة لجمع نموذج ثابت يعتمد على المقايسة الجدوى المستخدمة (راجع الخطوة 3).
  2. رسم تعليق الخلية في حقنة 5 مل، وإرفاق إبرة 30 G 1/2". فك الإبرة، ووضع المحقنة على مضخة حقنة، وتأمين الحقنة، وتعيين معدل التدفق لتحقيق المستوى المطلوب من FSS.
    ملاحظة: يبين الجدول 1 الحد الأقصى لإجهاد القص الجداري لمختلف الإبر ومعدلات التدفق، وكذلك الحد الأدنى من مستوى FSS اعتمادا على حجم الخلية (10 و15 و20 ميكرومتر). فحص الإبرة قبل استخدامها للتأكد من أنها ليست عازمة; إذا كان غير مؤكد، استبدال الإبرة بأخرى جديدة. يمكن أن يكون لسلامة الإبرة تأثير كبير على مستوى FSS المطبق.
  3. تشغيل مضخة حقنة، وجمع عينة مقص في أنبوب قطع بزاوية 45 درجة تقريبا للحد من رغوة. جمع عينة اعتمادا على نوع من اختبار الجدوى أو احتياجات الفحص المصب.
    1. قم بإزالة الحقنة والإبرة بعناية من مضخة الحقنة، واستخدم كماشة لإزالة الإبرة من الحقنة، مع الحرص على عدم لمس الإبرة.
      ملاحظة: يمكن استخدام الإبر غير المفلطوفة بالتبادل مع الإبر المفلتة كإجراء أمان إضافي.
  4. ارسم التعليق المقص مرة أخرى في الحقنة، ثم أعد ربط الإبرة بعناية باستخدام كماشة، ثم ضعها مرة أخرى في مضخة الحقنة.
  5. كرر الخطوتين 2.3 و 2.4 حتى يتعرض تعليق الخلية للعدد المطلوب من نبضات FSS.
    ملاحظة: لتقييم قدرة الخلايا على مقاومة التدمير الميكانيكي من التعرض ل FSS ، يخضع تعليق الخلية عادة ل 10 نبضات من FSS. ومع ذلك، فقد ثبت أن الخلايا تبدأ في الخضوع للتكيف البيولوجي استجابة ل FSS بعد نبضات2 24.

3. قياس الجدوى

ملاحظة: يمكن تقييم الجدوى باستخدام المقايسات الأنزيمية (لوسيفيراز، ريسازورين، و WST-1)، عد الخلايا سليمة، قياس التدفق الخلوي، أو عن طريق المقايسات كلونوجينيك.

  1. لجميع مقاييس الجدوى، جمع عينة قبل تعريض الخلايا لفاس.
    1. لإجراء فحوصات أنزيمية، خذ 100 ميكرولتر مكررة من الاقتباسات ووضعها في لوحة من 96 بئرا.
    2. لقياس التدفق الخلوي، خذ واحد 500 ميكرولتر aliquot ووضعه في أنبوب 1.5 مل.
    3. لإجراء فحص كلونوجينيك، اجمع 100 ميكرولتر من اليكوت.
  2. الفحص الأنزيمي
    1. جمع عينات 100 ميكرولتر بعد 1 و 2 و 4 و 6 و 8 و 10 نبضات من التعرض ل FSS ووضعها في لوحة من 96 بئرا.
    2. إضافة الركيزة المطلوبة، واتبع البروتوكول للمقايسة المستخدمة:
      1. لريسازورين, إضافة 20 ميكرولتر من محلول 0.15 ملغم / مل لكل بئر. إضافة 20 ميكرولتر من محلول ريسازورين 0.15 ملغم/مل إلى الآبار التي تحتوي على 100 ميكرولتر من المتوسطة وحدها. حضانة لمدة 2 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية. قياس الامتصاص باستخدام قارئ لوحة قادرة على قراءة الفلورسينس (579 الإثارة / 584 الانبعاثات).
      2. للخلايا المعبرة عن لوسيفيراز، أضف 100 ميكرولتر من 15 ملغم/مل D-لوسيفيرين إلى 5 مل من المتوسط. أضف 100 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل بئر يحتوي على خلايا. انتظر لمدة 5 دقائق، ثم اقرأ اللوحة باستخدام قارئ متوافق مع التلألؤ.
      3. بالنسبة إلى WST-1، أضف 10 ميكرولتر من WST-1 إلى كل بئر، بما في ذلك الآبار التي تحتوي على متوسط فقط. احتضان لمدة 4 ساعة، ومن ثم قراءة امتصاص بين 420 و 480 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
    3. قارن متوسط الإشارة من كل عينة من العينات المعرضة ل FSS بعينة التحكم الثابتة المتوسطة للحصول على النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة.
  3. قياس التدفق الخلوي24
    1. جمع عينات 500 ميكرولتر ووضعها في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل بعد 1 و 2 و 5 و 10 نبضات من FSS.
    2. عينات الطرد المركزي (500 × غرام لمدة 3 دقائق)، والتخلص من النتوائط.
    3. Resuspend الكريات مع 1 مل من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من برنامج تلفزيوني، والطرد المركزي عينات (300 × غرام لمدة 3 دقائق).
    4. تعليق الكريات مع 500 ميكروغرام من الفلورسينس تنشيط فرز الخلايا (FACS) العازلة (PBS مع 0.5٪ ألبوم مصل البقر و 0.1٪ azide الصوديوم) مع عد الخرز والأصباغ الغشاء غير نفاذية أو صلاحية مثل يوديد البروبيديوم (1.75 ميكروغرام / مل).
    5. تحديد الجدوى من خلال مقارنة نسبة الخلايا القابلة للحياة، تطبيع لعد الخرز، في عينات مقص لتلك التي من عينة ثابتة.
  4. فحص كلونوجينيك
    1. خذ 100 ميكرولتر من العينة الثابتة، وأضف 900 ميكرولتر من متوسط النمو لجعل تخفيف 1:10.
    2. خذ 100 ميكرولتر من العينة المخففة 1:10 ، وأضف 900 ميكرولتر من متوسط النمو لجعل تخفيف 1:100 النهائي.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من عينة التخفيف 1:100 في كل بئر من 3 آبار من طبق 6 آبار تحتوي على 2 مل من متوسط النمو.
    4. كرر الخطوات 3.4.1-3.4.3 مع العينات التي تعرضت لنبضات 10 من FSS.
    5. دع الخلايا تنمو لمدة 7-10 أيام دون تغيير الوسط ، وتحقق من تكوين المستعمرة. مرة واحدة وقد شكلت مستعمرات من خلايا ≥50، يستنشق متوسط النمو، وشطف كل بئر مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، يستنشق برنامج تلفزيوني، وإصلاح لمدة 5 دقائق باستخدام 1 مل من الجليد الباردة 70٪ الإيثانول (EtOH). الأهم من ذلك، إصلاح كل من عينات مقص وثابتة في نفس الوقت
    6. بعد تحديد العينات، يستنشق EtOH، وإضافة 1 إلى 2 مل من الكريستال البنفسجي الحل (0.1٪ البنفسجي الكريستال في 90٪ H2O، 10٪ EtOH) لمدة 5 دقائق.
    7. شطف مع فائض من الماء، والسماح للوحة الجافة
    8. عد المستعمرات (مجموعات من ≥50 خلية) لكل من العينات الثابتة والمقصة. قارن نسبة متوسط عدد المستعمرات من العينة المقصة بمتوسط عدد المستعمرات من العينة الثابتة لتحديد الجدوى.

النتائج

وقد ثبت سابقا مقاومة مرتفعة للتدمير الميكانيكي الناجم عن FSS ليكون النمط الظاهري المحفوظة عبر خطوط الخلايا السرطانية متعددة والخلايا السرطانية معزولة حديثا من الأورام بالنسبة للخلية الظهارية غير المحولة المقارنة15،24. هنا، تم اختبار خطوط خلايا سرطانية إضافية من مجموعة متنوعة من أصول الأنسجة(الجدول 2)لإثبات أن غالبية هذه الخلايا تظهر قابلية البقاء ≥ 20٪ بعد 10 نبضات من FSS عند 250 ميكرولتر /ثانية. الاستثناء الوحيد هو خلايا MiaPaCa2 ، التي كانت حساسة نسبيا للتدمير الميكانيكي من FSS (≤ 10٪). لوصف ملف مقاومة FSS بشكل كاف لخط الخلية ، يوصى ب n ≥ 3 تكرارات بيولوجية.

على سبيل المقارنة، جميع الخلايا الظهارية غير المحولة التي تم فحصها لها صلاحية < 10٪ في ظل هذه الظروف15،24. وهكذا ، في حين أن هناك مجموعة في مقاومة FSS لوحظ ، فإن غالبية خطوط الخلايا السرطانية التي تم اختبارها تظهر مقاومة أكبر ل FSS من الخلايا غير المتحولة. يمكن اشتقاق خطوط الخلايا السرطانية من كل من أنسجة الورم الأولية والانبثاث. يمكن للمرء أن يفترض أن الخلايا المشتقة من الانبثاث قد تظهر مقاومة أكبر ل FSS لأن هذا النمط الظاهري قد تم اختياره أثناء النشر النقيلي. ومع ذلك، تبين أن مستوى مقاومة FSS لا يعتمد على ما إذا كانت الخلايا مشتقة من الأورام الأولية أو الانبثاث15،24. وعلاوة على ذلك، فإن مستويات مقاومة FSS لا ترتبط مع إمكانات النقيلي في سلسلة من خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشري15.

لاختبار هذا أكثر من ذلك، تم استخدام BALB / c الخلايا الظهارية الثديية مع إمكانات النقيلي متفاوتة (4T1 = النقيلي للغاية، 4T07 = إمكانات النقيلي ضعيفة إلى معتدلة، 67NR = لا لانخفاض إمكانات النقيلي25،26). وكشفت هذه التجربة أن مقاومة FSS لا ترتبط بالإمكانات النقيلية(الشكل 1). وعلاوة على ذلك، تظهر كل من الخلايا 4T1 و 4T07 فقدان ثنائي الطور من صلاحية الخلية- فقدان أكبر من الجدوى في البقول 1-2 مما لوحظ في البقول اللاحقة. هذا هو نموذجي من معظم خطوط الخلايا السرطانية التي حققت فيها هذه المجموعة. في المقابل، يعرض 67NR فقدان خطي أكثر من صلاحية الخلية كدالة ل FSS. بشكل جماعي، تظهر البيانات من الجدول 2 والشكل 1 أن مقاومة FSS هي خاصية للخلايا المتحولة.

figure-results-2403
الشكل 1:مقاومة الإجهاد القص السوائل من BALB syngeneic / ج الخلايا السرطانية الظهارية الثديية. تعرضت الخلايا ل FSS (إبرة 30 G، 10 pulses@250 مل / ثانية)، وتم قياس الجدوى باستخدام تحويل ريسازورين (n = 4/cell line). في حين أن التعرض FSS خفض عدد الخلايا القابلة للحياة (ص < 0.0001، ANOVA 2-way)، وعرض كل خط الخلية ملامح المقاومة المختلفة (ع = 0.0446، 2-اتجاه ANOVA)، لم يكن هناك فرق كبير بين خطوط الخلية بعد 10 نبضات التعرض FSS (ع = 0.2833، 2-way ANOVA). الاختصارات: FSS = إجهاد القص السائل؛ ANOVA = تحليل التباين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

القص (τ):الجدار (الحد الأقصى)الحد الادني
قطر الخلية:N/A10 ميكرومتر15 ميكرومتر20 ميكرومتر
مقياس الإبرة:302725302725302725302725
معدل التدفق (μL/s)20507220116321044816764219
50126755029080261112039171595222
100253411005801595222239793331910545
1503801165086923979333591185047815767
200506822001159319105454781576763721089
2506335275014493981315659819684797262111

الجدول 1: الحد الأقصى من الإجهاد القص(الجدار)مستويات. يسرد الجدول الحد الأقصى لمستويات FSS الجدار في dyn/cm2 ل 30 G, 27 G, و 25 G الإبر بمعدلات تدفق 20, 50, 100, 150, 200, و 250 ميكرولتر / ثانية. تم حساب مستويات الإجهاد القص باستخدام معادلة Poiseuille ( figure-results-6026 ) ، والمعلومات المتاحة عن القطر الداخلي لكل مقياس إبرة ، فضلا عن افتراض أن μ = 0.01 dyn · s / cm2. تم حساب الحد الأدنى لمستويات FSS لكل حجم باستخدام figure-results-6253 حيث r هو نصف قطر الخلية ، وR هو نصف قطر الإبرة. اختصار: FSS = الإجهاد القص السائل; τ = القص. الجدار = الحد الأقصى القص. μ = اللزوجة؛ س = معدل التدفق الحجمي.

خط الخليةمصدر الأنسجةجنسمتوسط الجدوى (٪) بعد 10 نبضات
TRAMPC1بروستاتفأر40
4T01صدرفأر32
4T7صدرفأر43
67NRصدرفأر46
66CL4صدرفأر28
RT4قربةبشري62
W17-266-4الميلانومابشري46
HS852الميلانومابشري41
HS695الميلانومابشري41
A2058الميلانومابشري37
A375الميلانومابشري37
آر بي إم أي-7951الميلانومابشري35
SKMEL2الميلانومابشري29
A101Dالميلانومابشري28
مياباكاالبنكرياسبشري7

الجدول 2: مقاومة الإجهاد القص السوائل من مختلف خطوط الخلايا السرطانية. تعرض كل خط من خطوط الخلايا السرطانية لإجهاد القص السائل من نموذج الحقنة والإبرة (إبرة 30 G، 10 pulses@250 مل/ثانية) (n ≥ 3/cell line)، وتم قياس الجدوى إما عن طريق نشاط لوسيفيراز أو تحويل الريسازورين.

Discussion

توضح هذه الورقة تطبيق FSS على الخلايا السرطانية المعلقة باستخدام حقنة وإبرة. باستخدام هذا النموذج، وقد ثبت أن الخلايا السرطانية لتكون أكثر مقاومة لنبضات وجيزة من FSS عالية المستوى بالنسبة للخلايا الظهارية غير المحولة15،22،24. وعلاوة على ذلك، والتعرض ل FSS باستخدام هذا النموذج يؤدي إلى زيادة سريعة في تصلب الخلايا، وتفعيل RhoA، وزيادة القشرية F-أكتين وميسين الثاني القائم على العقد24،27. قد الميكانو التكيف السريع (قدرة CTCs لتصبح أكثر أو أقل قاسية اعتمادا على الظروف) منع التدمير الميكانيكي للCTCs وتسهيل جوانب أخرى من الاستعمار النقيلي24،28. في الواقع، تم تأكيد النتائج التي تم التوصل إليها باستخدام هذا النموذج في المختبر باستخدام CTCs التجريبية في النماذج الحيوانية24. هذا التكيف الميكانيكي السريع يفسر على الأرجح فقدان ثنائي المراحل البقاء الخلية لوحظ عادة في هذا النموذج(الشكل 1)،أي الخلايا FSS-السذاجة هي أكثر عرضة للتدمير من الخلايا التي تعرضت لنبض واحد حتى من FSS. إذا ما أخذت معا، وهذا يشير إلى أن FSS يحفز تصلب الخلايا السريع في الخلايا السرطانية التي تحميهم من البقول اللاحقة من FSS.

على الرغم من أن محور RhoA-actomyosin هو محرك مهم للمقاومة FSS15،21،24، هناك آليات أخرى محتملة تشارك29. دليل آخر على أن تصلب الخلية هو المحدد الرئيسي لمقاومة FSS هو أن تعطيل صفح A ، الذي يتحكم في السلامة الهيكلية للنواة - أشد مكون في الخلية ، يقلل من مقاومة FSS في الخلايا السرطانية باستخدام هذا النموذج22. نحن نستخدم هذا النموذج للتحقيق في آليات مقاومة FSS في الخلايا السرطانية كذلك. هنا، وقد استخدم هذا النموذج لقياس قدرة خطوط الخلايا السرطانية المختلفة لمقاومة التدمير الميكانيكي من خلال تعريض الخلايا لنبضات وجيزة من مستويات عالية من FSS. على الرغم من أن هذا هو رخيصة نسبيا، نموذج بسيط لتطوير في المختبر، مع العنصر أغلى هو مضخة حقنة، يجب الحرص على اتباع البروتوكول بأمانة للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ. يمكن تطبيق نبضات متعددة من FSS على الخلايا في وقت قصير جدا، <10min. يعتمد إجمالي الوقت المنقضي للتجربة على حجم التعليق ومعدل التدفق ورقم النبض وبراعة المستخدم في نقل التعليق بين النبضات. مع الخبرة، يمكن معالجة تعليق 5 مل يتعرض ل FSS مع إبرة 30 G لمدة 10 pulses@250 ميكرولتر / ثانية في ~ 10 دقيقة. بالنسبة لمعظم خطوط الخلايا، هناك الحد الأدنى من فقدان القدرة على البقاء بسبب عقد في تعليق لهذا الطول من الزمن.

ونظرا لأن التعرض ل FSS يحدث بسرعة نسبية، يتم تطبيق FSS عادة على تعليق الخلايا في وسط خال من المصل لتقليل رغوة العينات. الفرق في اللزوجة بين 0-10٪ مصل الأبقار الجنين لا يكاد يذكر في هذا المقايسة. ومع ذلك، فمن الأهمية بمكان لضمان مستويات فسيولوجية من الكالسيوم في الوسط الذي يتم قص الخلايا. وعلاوة على ذلك، فيما يتعلق بأساليب فصام الخلية قبل التعرض ل FSS، لم يتم الكشف عن أي فرق في مقاومة FSS في تعليق خلايا PC-3 الذي تم إعداده عن طريق التجربس أو العلاج بعوامل فص غير أنزيمية15. يمكن أن يكون تركيز الخلية أكبر أو أقل من 5 × 105 خلايا / مل اعتمادا على احتياجات تطبيق المصب. استجابة PC-3 خلايا سرطان البروستاتا مماثلة في مجموعة من 5 × 104 إلى 5 × 105,15. ومع ذلك، ينبغي تحديد آثار تركيز الخلايا على الجدوى بعد التعرض ل FSS تجريبيا.

بالنسبة لمعظم التطبيقات المتوخاة مع الخلايا المستزرعة، يجب ألا تؤثر كثافة الخلايا بشكل كبير على اللزوجة وبالتالي، فإن كمية FSS المطبقة. وينبغي أن تكون المتغيرات، مثل الوقت الذي يتم فيه احتجاز الخلايا في تعليق قبل التعرض ل FSS، ثابتة عبر التكرارات التجريبية. كما ذكر أعلاه، سلامة إبرة أمر بالغ الأهمية أيضا. وقد لوحظت اختلافات الكثير في الإبر فيما يتعلق بهذا المقايسة مع مرور الوقت. تم تصميم الإبر تحت الجلد للاستخدام السريري، وليس لمعدلات التدفق المستخدمة هنا. في مناسبات نادرة ، يمكن أن يكون محور الإبرة منعزلا جزئيا ، والذي يمنع خلال النبضات اللاحقة مرور التعليق من خلال الإبرة وفي النهاية ، التدفق الخلفي حول المكبس المحقن. علاوة على ذلك ، من المهم جدا أن نفهم أن الخلايا الميتة / المحتضرة حساسة بشكل استثنائي ل FSS ، كما هو موضح سابقا24. لذلك، إذا كان خط خلية معينة لديه مستوى عال من الخلايا المحتضرة، إما كخصائص روتينية أو التلاعب التجريبي (على سبيل المثال، العلاجات الدوائية)، وهذا سيؤدي إلى فقدان حاد جدا من صلاحية الخلية التي قد لا تكون طبيعية تماما بالمقارنة مع السيطرة ثابتة.

يمكن إقران تطبيق FSS مع المقايسات الأخرى ، مثل immunofluorescence ، ويقايس الانسحاب ، والنشاف الغربي ، لدراسة تأثير FSS على بيولوجيا الخلايا السرطانية 24. من حيث المبدأ، يمكن استخدام هذا النموذج أيضا لاستكشاف آثار FSS عالية المستوى وقصيرة الأجل على أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك خلايا الدم. خلايا الدم الحمراء العادية وخلايا الكريات البيض هي أكثر مقاومة لفاس تطبيقها بهذه الطريقة من الخلايا السرطانية حتى, الذي يقف إلى العقل من الناحية الفسيولوجية15. في الواقع، ومستوى FSS تطبيقها، وذلك باستخدام إبرة 30 G 1/2 "بمعدل تدفق 250 مل / ثانية، بين قوسين النطاق المطلوب لتعطيل غشاء الخلية الحمراء (على أساس تطبيق مللي ثانية من القوة)30،31. أحد قيود هذا النموذج، أو أي قيود تنطوي على تمرير السوائل عبر قناة، هو أن المستوى الدقيق ل FSS التي تواجهها الخلايا ضمن النطاق من الإجهاد الأقصى لقص الجدار والحد الأدنى في وسط القناة غير معروف. وهكذا، في كل نبضة، لا تواجه جميع الخلايا نفس المستوى من FSS، وعلى مدى النبضات المتكررة، يتوقع من الخلايا الفردية أن تواجه مستويات مختلفة من FSS في كل نبضة داخل النطاق المحدد.

ومع ذلك، فإن التركيز الهيدروديناميكي في ظل الظروف المستخدمة في هذا النموذج يؤدي إلى توجيه الخلايا نحو مركز التدفق، بعيدا عن الجدار، وبالتالي نحو التعرض FSS أقل32. نماذج أخرى، مثل مخروط ولوحة viscometers أو غرف كويت، هي أكثر ملاءمة لتطبيق FSS في مستويات ثابتة لتعليق الخلية. كما ذكر أعلاه، فإنه لا يزال تحديا لنموذج التعرض FSS من CTCs في المختبر. هذا النموذج هو الأنسب لاختبار آثار عالية، ولكن قصيرة، والتعرض ل FSS كما قد يحدث عبور القلب. يؤدي التدفق عبر الشرايين والأوردة إلى التعرض لفترة أطول لمستويات أقل من FSS. ومع ذلك، وكما ذكر، فإن المدة التي تبقى فيها مركبات الكربون الكلورية فلورية في تدفق مستمر في الدورة الدموية غير واضحة، ومعظم الأدلة التجريبية حتى الآن تتسق مع فترات قصيرة (ثانية) من التدفق الحر تتخللها فترات أطول من الفخ في الدوران الدقيق.

النماذج التي تعرض الخلايا السرطانية في التعليق إلى مستويات أقل من FSS (0.5-60 dyn/cm2)لفترات أطول (دقائق إلى أيام) تشمل مقاييس المخروط والصفائح ، وغرف كويت ، وحلقات التدفق المستمر ، والمحاقن مع تمديد أنبوب ، والأجهزة microfluidic33،34،35،36،37. وقد استخدمت هذه أيضا للحصول على رؤى حول كيفية FSS قد تؤثر على CTCs وأدت إلى العثور على أن التعرض ل FSS يزيد من الإجهاد التأكسدي, انتشار الخلايا والغزو, وخصائص تشبه الخلايا الجذعية في مختلف خطوط الخلايا السرطانية. وسيكون من المثير للاهتمام مقارنة النتائج المستمدة من تلك النماذج مع تلك الموصوفة هنا. على سبيل المثال، باستخدام نموذج حلقة التدفق المستمر، وجد شين وآخرون أن محور ROCK-actomyosin عزز فقدان صلاحية الخلية في خطوط الخلايا السرطانية المعرضة ل FSS (20 dyn/cm2)لمدة 2-12h في تناقض صارخ مع البيانات الموصوفة أعلاه38. وبالتالي، من المرجح جدا أن يكون السياق البيولوجي مهما لجميع هذه النماذج في المختبر، مما يعزز الحاجة إلى ترجمة النتائج حول CTCs إلى نماذج حية وفي نهاية المطاف إلى مرضى السرطان.

Disclosures

MDH هو المؤسس المشارك والرئيس والمساهم في SynderBio ، وشركة DLM هو مستشار لشركة SynderBio ، وشركة

Acknowledgements

تم دعم تطوير النموذج الذي تم إظهاره هنا من خلال منحة وزارة التنمية W81XWH-12-1-0163 ، وتمنح المعاهد القومية للصحة R21 CA179981 و R21 CA196202 ، وصندوق أبحاث Sato Metastasis.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% TrypsinGibco25200-056
14 mL round bottom tubesFalcon - Corning352059
30 G 1/2" NeedleBD305106
5 mL syringeBD309646
96-well black bottom plateCostar - Corning3915
Bioluminescence detectorAMIAMI HTX
BSA, Fraction VSigma10735086001
Cell Titer BluePromegaG8081
crystal violetSigmaC0775
D-luciferinGoldBioD-LUCK
DMEMGibco11965-092
FBSAtlanta BiologicalsS11150
PBSGibco10010023
Plate ReaderBioTekSynergy HT
Sodium Azide (NaN3)SigmaS2002
Syringe PumpHarvard Apparatus70-3005

References

  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Strilic, B., Offermanns, S. Intravascular survival and extravasation of tumor cells. Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).
  4. Labelle, M., Hynes, R. O. The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination. Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).
  5. Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
  6. Weiss, L. Metastatic inefficiency. Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).
  7. Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor. Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).
  8. Fidler, I. J. Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine. Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).
  9. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  10. Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).
  11. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  12. Takagi, H., et al. Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types. International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).
  13. Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization. Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells. PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).
  16. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  17. Brass, L. F., Diamond, S. L. Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).
  18. Stein, P. D., Sabbah, H. N. Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves. Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).
  19. Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis. The American Journal of Physiology. 265 (5), 1787-1796 (1993).
  20. Chalmers, J. J. Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about. Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).
  21. Vennin, C., et al. Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis. Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).
  22. Mitchell, M. J., et al. Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).
  23. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).
  24. Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
  25. Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines. British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).
  26. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399 (1992).
  27. Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study. Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).
  28. Gensbittel, V., et al. Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis. Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).
  29. O'Leary, B. R., et al. Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism. Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).
  30. Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. Hemolysis near a transversely oscillating wire. Science. 169 (3948), 871-873 (1970).
  31. Rooney, J. A. Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble. Science. 169 (3948), 869-871 (1970).
  32. Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions. Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).
  33. Brooks, D. E. The biorheology of tumor cells. Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).
  34. Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition. Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).
  35. Fan, R., et al. Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells. Scientific Reports. 6, 27073 (2016).
  36. Fu, A., et al. High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin. Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).
  37. Li, S., et al. Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).
  38. Xin, Y., et al. Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow. Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved