Method Article
نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تجانس وضع العلامات لكل أنواع البروتين في عينة بروتين معقدة على مستوى جزيء واحد.
غالباً ما تتصف بروتيوميس الخلية باستخدام فحوصات التفريد، حيث جميع الأنواع من البروتينات في الخلايا المسماة غير تحديداً مع صبغة فلورسنت ورصدت قبل فوتوديتيكتور بعد انفصالهما. تصوير fluorescence جزيء واحد يمكن أن توفر البروتين أولتراسينسيتيفي الكشف عن قدرته على تصور الأفراد الفلورسنت الجزيئات. ومع ذلك، تطبيق هذا الأسلوب التصوير قوية لفحوصات التفريد يعوقها الافتقار إلى سبل لتوصيف تجانس الفلورسنت وسم كل أنواع البروتين عبر البروتين. هنا، قمنا بتطوير أسلوب لتقييم تجانس وضع العلامات عبر البروتين استناداً مقايسة تصوير fluorescence جزيء واحد. لدينا قياس استخدام عينة خلية هيلا، نسبة البروتينات المسماة بصبغ واحد على الأقل، مما يمكننا وصف 'وسم شغل' (لو)، مصممة على مجموعة من 50% إلى 90%، إمكانات عالية لتطبيق تصوير جزيء واحد لدعم تحليل البروتين حساسة ودقيقة.
تحليل البروتين، الذي يهدف إلى تحديد المجموعة من الجزيئات البروتينية التي أعرب عنها في الخلية بأكملها، ونهج قيمة في الدراسات البيولوجية والطبية الحالية. عادة يعتمد هذا التحليل على الكتلي، الذي يحدد أنواع البروتين استناداً إلى الأطياف التي تم إنشاؤها عن طريق البروتين التأين1،،من23. هو أسلوب بديل لتحليل البروتين الكهربي، بما في ذلك جل polyacrylamide التفريد (صفحة)، والتفريد الشعرية والتفريد هلام ثنائي الأبعاد (2D). يعتمد هذا الأسلوب على وضع العلامات الفلورية غير محددة من جميع جزيئات البروتين في خلايا تم تحليلها، يليها فصل الغرواني الكهربي والكشف والتحديد الكمي لكل أنواع البروتين. لتحقيق العلامات المطلوبة غير محددة البروتين، هو استراتيجية واحدة لاستخدام الأصباغ الفلورية الذي يمكن ربطه بالبروتينات عن طريق التفاعلات الكهرباء والماء، مثل أخذ الأزرق وسيبرو-روبي4،5،6 . هو استراتيجية بديلة لاستخدام التساهمي وسم مع الأصباغ التي تحتوي على إستر N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) أو ماليميدي، الذي يمكن ربط تساهمي البروتينات عن طريق المخلفات الشائعة مثل الأمينات الأولية وثيولس، على التوالي7، 8.
ومن ناحية أخرى، حساسية الكشف عن الأسفار مثالي لتحليل البروتينات المنخفضة-وفرة وعدد قليل من الخلايا. تصوير fluorescence جزيء واحد هو واحد من الأساليب الأكثر حساسية التي تتيح الكشف عن الأصباغ الفلورية الفردية والبروتينات المسمى في المختبر و المجراة في9،10،،من1112، 13،،من1415. ومن المتوقع تطبيق هذا الأسلوب التصوير للتحليل القائم على التفريد البروتين لتمكين فحوصات حساسة للغاية والكمية عن طريق العد الفردي البروتينات المسماة فلوريسسينتلي. ومع ذلك، فإنه لا يزال غير واضح ما إذا كان وضع العلامات مع الأصباغ الفلورية متجانسة ما يكفي عبر جميع جزيئات البروتين، وكيف يتأثر هذا التجانس في الأنواع المختلفة من البروتين (الشكل 1). قياسات حل غالبية بسيطة يمكن استخدامها للحصول على نسبة مولى من الأصباغ الفلورية للبروتينات التي تسمى 'اقتران الكفاءة'8 أو 'وسم الكفاءة'، ولكن هذه الخاصية لا توفر المعلومات على التجانس بين العلامات جزيئات البروتين.
هنا، يمكننا وصف البروتوكول المتعلق فحص للتحقيق في تجانس وضع العلامات لجميع أنواع البروتين في الخلية (الشكل 2)16. الخطوات الرئيسية اثنين من هذا التحليل هي تنقية البروتين والتصوير. في الخطوة الأولى، جميع البروتينات في الخلايا المسماة فلوريسسينتلي وبيوتينيلاتيد، ثم استخراج كل على حدة باستخدام هلام التفريد متبوعاً اليكترويلوشن. في الخطوة الثانية، يتم تقييم خصائص الأسفار من الجزيئات البروتينية الفردية في العينات المستخرجة استناداً إلى تصوير جزيء واحد. صبغ معالم هامة لتحليل عد الأصوات، مثل النسبة المئوية للبروتين المسمى مع واحد على أقل من هذه البيانات،، الذي نسميه التوسيم شغل (لو)16، ومتوسط عدد من الأصباغ الفلورية ملزمة لجزيء بروتين واحد (n̄ صبغ)، يمكن أن توصف. في البروتوكول، إجراء أمثل لوسم البروتين هيلا الخلية مع دائرة الصحة الوطنية المستندة إلى إستر صبغ Cyanine 3 (Cy3) يرد على سبيل مثال، ويمكن تعديلها مع الإجراءات الأخرى وضع العلامات وفقا للأهداف المرجوة من البحث.
1-إعداد الخلية
2-خلية تفسخ ووسم نيون
3-الفصل البروتين والانتعاش
4-المجهر إعداد ساترة
5-المراقبة مع جزيء واحد fluorescence مجهرية
6-صورة التحليل واستخراج المعلومات
ويمثل الرقم 4 بيانات الصورة الخام لكسور مختلفة الوزن الجزيئي للبروتينات من الخلية هيلا ليساتي، فضلا عن عنصر التحكم الإيجابي والسلبي. بينما عينة البروتين والإيجابية على السواء مراقبة البقع المعرض 100 – 500 كل صورة، يعرض عنصر التحكم السلبي لا شيء أو بقع قليلة، تبين أن البروتوكول بما فيه الكفاية يحول دون ربط غير محددة من الأصباغ إلى السطح ساترة. مدرجات تكرارية كثافة بقعة لعينات البروتين وعنصر التحكم الإيجابي الحالي قمم متعددة، يمثل الربط العشوائية من الأصباغ إلى الأمينات الأولية في البروتينات وهياكل avidin تيترامير22، على التوالي. وأظهرت جميع البقع فوتوبليتشينج وامض وتدريجي مع الإثارة الليزر المستمر، تسليط الضوء على المراقبة على مستوى جزيء واحد (الشكل 5 أ، ب).
لو يحسب من نسبة عدد النقاط في كل عينة البروتين لأن في مراقبة إيجابية. لو يقاس من العينة ليستي خلية هيلا تتراوح من 50% للكسر (كاتشين 16) الوزن الجزيئي الأصغر إلى 90% للكسر (120 كاتشين) الوزن الجزيئي أعلى وكان 72% للعينة البروتين كله دون فصل (الشكل 6). وفي المقابل، n̄صبغة تميل إلى زيادة مع زيادة الوزن الجزيئي. وتعتبر هذه زيادة النزعات أن تحدث نتيجة لأرقام أعلى من بقايا يسين، مما يؤدي إلى زيادة دائرة الصحة الوطنية--إستر صبغ ملزمة. على سبيل المثال، قد الكسر كاتشين 23 قيمة لو عالية بسبب الإعداد الكبيرة من مخلفات يسين في البروتينات هستون الوارد في هذا الكسر.
رقم 1: تأثير البروتين وسم التجانس في العد رقم البروتين. عدد العد البروتين يعتمد اعتماداً كبيرا على مدى قوة والبلوتينيوم المسمى الجزيئات البروتينية، بدلاً من نسبة عدد من البروتينات للأصباغ. يمكن سجل التجانس استخدام معلمة يسمى شغل وضع العلامات (لو)، الذي يحدد احتمال جزيئات البروتين المسمى ضد جزيئات البروتين الكلي. هذه القيمة ويوفر كفاءة البروتين العد (أي، عد لو غلات أعلى الأرقام (يسار) ونائب (يمين) بالعكس). بينما لو قيمة 100% يعد أمرا مثاليا، لو من < 100% يمكن أن توفر عامل توهين لتقدير إعداد البروتين المطلق. لقد تم تعديل هذا الرقم من لوكلير et al.16 الجمعية الكيميائية الأمريكية 2018 حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل سير العمل. أولاً، كوفيرسليبس () و (ب) تعامل مع عبدين لتحقيق كثافة ثابتة. بروتينات العينة الثانية، والمسمى فلوريسسينتلي بيوتينيلاتيد ويعلق على ساترة () عن طريق تفاعل البيوتين عبدين. في موازاة ذلك، هو معطلة البيوتين المنقي المسمى فلوريسسينتلي 100% تقريبا في ساترة (ب). الثالث، يتم تصويرها في كوفيرسليبس قبل مجهرية fluorescence جزيء واحد للحصول على توزيع عدد وسطوع البقع الأسفار. وأخيراً، يحسب المعلمة التجانس، لو، من نسبة أرقام بقعة في () إلى أن في (ب). لقد تم تعديل هذا الرقم من لوكلير et al.16 الجمعية الكيميائية الأمريكية 2018 حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الفصل بين عينة البروتين هيلا الخلية باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-صفحة- المسمى فلوريسسينتلي وخلية بيوتينيلاتيد ليساتي تم ترحيلها في اثنين مختلفة المواد الهلامية (الاكريلاميد 20%)، والبروتينات التي تصور استخدام عارض هلام، مع وقت تعرض دقيقة 5 و 10 دقيقة لجل 1 وجل 2، على التوالي. مربعات حمراء تمثل جل المناطق التي تم قطع واستخراجها. لقد تم تعديل هذا الرقم من لوكلير et al.16 الجمعية الكيميائية الأمريكية 2018 حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: واحد الصور جزيء من عينات البروتين. بقعة fluorescence الصور (يسار) ورسوم بيانية من شدة بقعة (يمين) التي تم الحصول عليها من مختلف الوزن الجزيئي البروتين الكسور. شريط مقياس من 10 ميكرومتر. تشير الأسهم في مراقبة إيجابية إلى خطوة وصفها مختلفة من أفيدين. لقد تم تعديل هذا الرقم من لوكلير et al.16 الجمعية الكيميائية الأمريكية 2018 حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: فوتوبليتشينج بقع الفلورسنت. (أ) الوقت الفاصل بين الصور البقع الفلورسنت تحت الإثارة الليزر المستمر. (ب) الوقت يتتبع من شدة الأسفار في مواقع مختلفة. وتظهر الآثار أما فوتوبليتشينج خطوة واحدة أو اثنين، تشير الأرقام الخاصة بكل منها من الأصباغ اقترنت بالبروتين في بقعة عينة جيش صرب البوسنة المنقي. لقد تم تعديل هذا الرقم من لوكلير et al.16 الجمعية الكيميائية الأمريكية 2018 حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: وسم تجانس عينات البروتين. لو (أزرق) و n̄صبغ (أحمر داكن) تم الحصول عليها من كسور مختلفة الوزن الجزيئي. يتم التعبير عن البيانات يعني ± الصور المطران 98، 46، 27، 77، 44، 39، 62 و 101، 65، 62، 82، 61 و 70 حللت لخلية كله، 16، 23، 55، 120، 19 – 25، 25 – 32، 32 – 42، 42 – 54، 54 – 69، 69-97، 97-136 و 136-226 من الكسور كاتشين ، على التوالي. لقد تم تعديل هذا الرقم من لوكلير et al.16 الجمعية الكيميائية الأمريكية 2018 حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لتحديد مقدار تجانس وضع العلامات لكل نوع من الأنواع المسماة البروتين في الخلايا بعد الانفصال مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3). يمكن أن يكون محل أسلوب الفصل مع أساليب أخرى مثل كروماتوغرافيا سائلة أو التفريد الشعرية، التي تسمح بفصل وتجزئة البروتينات الخلوية بدقة عالية، بينما تتطلب معدات خاصة23. يمكن استبدال طريقة وضع العلامات باستخدام دائرة الصحة الوطنية--إستر في البروتوكول الحالي مع أساليب أخرى باستخدام ماليميدي--إستر أو الأجسام المضادة، على سبيل المثال.
الحاجة إلى وسم التحليل تجانس يعتمد على مقدار العلامات ينحرف عن عملية عشوائية بسيطة، كما يفترض في تحليل كفاءة اقتران. لدينا الدراسة الأخيرة16 أشارت إلى أن دائرة الصحة الوطنية--إستر وسم البروتينات ينحرف عن عملية عشوائية تبعاً لظروف رد فعل مثل درجة الحموضة والمنظفات. ولاحظنا أن بعض الشروط التي يسببها عدم التجانس ملزم التعاونية من الأصباغ للبروتينات أو وجود جزء صغير من البروتينات غير المتفاعلة بسبب سولوبيليزاتيون غير مكتملة أو النسب المخفضة للصبغ. على النقيض من ذلك، خفض الشروط الأخرى التغايرية بالربط الكامل من بقايا المتفاعلة داخل بروتين إلى الصبغ.
ونحن نعتبر هذا الرقم الهيدروجيني أحد العوامل الأكثر تأثيراً على تجانس وضع العلامات. يمكن أن يسبب ارتفاع درجة الحموضة تحييد مخلفات يسين في البروتينات، مما يؤدي إلى مفاعليه أعلى مع صبغ إستر دائرة الصحة الوطنية. وباﻹضافة إلى ذلك، درجة الحموضة العالية يمكن أن يحفز تحلل الخلية، ويمكن أن تؤذي البروتينات. ومع ذلك، منذ ارتفاع درجة الحموضة يجعل المسؤول عن البروتينات السلبي وهو غير مناسب لبعض التجارب مثل التفريد isoelectric أو التفريد 2D، يحتاج الشرط الأس الهيدروجيني النظر بعناية استناداً إلى الغرض من البحوث.
لقياس تجانس وضع العلامات في الفحص دقة، من المهم أن استخدام عينة البروتين بيوتينيلاتيد كافية. هذا سبب المقايسة يفترض أن البروتينات الربط مع التشبع لكل جزيء avidin ساترة، وعدم كفاية البروتين تركيز النتائج في تقدير لو. وقد أظهرت لنا الدراسة السابقة16 أن عادة أكثر من 10 بيكوغرام من البروتين ضروري لربط المشبعة، ويمكن الحصول على هذه من حوالي 1,000 خلايا هيلا24، حتى بعد تجزئة. من المستحسن لإنشاء سلسلة تمييع عينة البروتين للتأكد من تشبع البقع أفيدين. ونلاحظ أيضا أن على ساترة كثافة عبدين قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل حتى لا تسبب التداخل بين بقع في الصور المسجلة، مع إعطاء أرقام الموضعية كافية لإجراء تحليل إحصائي.
ويفترض هذا التحليل أن أحد عبدين رباعي جزيء22 على ساترة يمكن ربط بروتين واحد. وفي الواقع، أوضحت بيانات عنصر التحكم الإيجابي في دراستنا السابقة يمكن ربط هذا الجزيء avidin واحد ليصل إلى أربعة بيوتينس المسمى فلوريسسينتلي، ولكن الأغلبية (55%) من جزيئات عبدين ربط جزيئات البيوتين واحد فقط أو اثنين. لأن البروتينات أكبر من البيوتين، ينبغي أن تؤدي آثارها الفراغية أقل البروتينات منضمة إلى عبدين واحد. لدينا افتراض يدعمه كذلك الحقيقة أن n̄صبغ يظل ثابتاً عند قياس العينات المختلطة من المسماة وغير المسماة البروتينات في نسب مختلفة16.
اعتماداً على هذه الأنواع من البروتين، قد يحدث الربط غير محدد من البروتينات ساترة إلى حد كبير حتى مع طلاء جيش صرب البوسنة. إذا كان هذا هو الحال، قد يكون خيار واحد لقياس عنصر تحكم حيث المغلفة البروتينات بيوتينيلاتيد في ساترة دون عبدين، بدلاً من البيوتين الفلورسنت في خطوة 4.6.3. يمكن القضاء أثر الملزم غير محدد على لو رياضيا بطرح عدد النقاط لعنصر التحكم هذا من أن العينة البروتين.
وسيكون هذا البروتوكول لا تقدر بثمن للبروتين على نطاق واحد-جزيء البروتين عد التحليلات. حساسية جزيء واحد سوف يسمح بتحليل لكميات البروتين لكل أنواع البروتين بغض النظر عن وفرة في الخلية25. ويمكن أن يتحقق هذا بفصل البروتين متبوعاً بالتحديد الكمي لعدد البقع fluorescence مقترنة بالبروتينات. علاوة على ذلك، حساسية عالية ستسمح أيضا تحليل خلية مفردة، تمكن الباحثين تفحص التغايرية عبر الخلية السكان والقيام بتجميع الخلوية الدول25،26.
الكتاب يعلن interest(s) المالية المتنافسة التالية: بتبريد قدم طلب براءة على هذه النتائج مع س. ل. و Y.T. واسمه المخترعين المشاركين.
يشكر المؤلفون أونو تغلبت ونيشيمورا كازويا للمشورة والمساعدة التجريبية. تم دعم هذا العمل من المعزوفة (JPMJPR15F7)، واليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا، معونة للشباب العلماء (A) (24687022)، وتحدي البحوث الاستكشافية (26650055)، والبحوث العلمية في "المجالات المبتكرة" (23115005)، جمعية اليابان تعزيز العلوم، ومن المنح المقدمة من المؤسسة وتاكيدا للعلوم ومؤسسة النصب التذكاري موشيدا للبحوث الصيدلانية والطبية. س. ل. وتسلم الدعم المقدم من البرنامج بتبريد الدولي البرنامج المعاون (IPA).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
Borate | Nacalai-tesque | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
Dialyzer - D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
DMEM | Sigma-Aldrich | ||
DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
EDC | Nacalai-tesque | ||
EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
SDS | Wako | NC0792960 | |
Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved