كوانتيتيشن خلية واحدة مرناً و "سطح التعبير البروتين" في خلايا CD4 المصابين "فيروس نقص المناعة القردي"⁺ "تي الخلايا المعزولة" من macaques ريسوس

وصف منهجية كوانتيتاتي الجينات 96 وأعرب 18 البروتينات السطحية من خلايا مفردة فيفو السابقين، مما يسمح للتعرف على خلطات الجينات والبروتينات في الخلايا المصابة بالفيروس بالنسبة للخلايا مصابة. نقوم بتطبيق نهج لدراسة CD4 المصابة بسيف⁺ تي الخلايا المعزولة من macaques الريسوسي.

تحليل خلية واحدة أداة هامة لتشريح السكان غير متجانسة من الخلايا. تحديد وعزل خلايا نادرة يمكن أن يكون صعباً. للتغلب على هذا التحدي، الجمع بين منهجية فهرسة التدفق الخلوي والفائق متعدد الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر). يهدف إلى تحديد وتوصيف فيروس نقص المناعة القردي (سيف)-إصابة خلايا موجودة داخل macaques الريسوسي. الخلايا المصابة بالفيروس من خلال كوانتيتيشن من البروتين السطحي بالأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) ومرناً ب qPCR، يتم تحديدها بواسطة التعبير الجيني الفيروسي، الذي هو جنبا إلى جنب مع قياسات مضيف الجينات والبروتين لإنشاء ملف تعريف متعدد الأبعاد . نحن مصطلح نهج، وتقييم خلية واحدة بروتو النسخي المستهدفة، أو تسسيبتري. لتنفيذ هذه الطريقة، ملطخة خلايا قابلة للحياة مع الأجسام المضادة الفلورسنت محددة للعلامات السطحية المستخدمة لعزل نظام مراقبة الأصول الميدانية خلية فرعية و/أو تحليل المظهرية المتلقين للمعلومات. يتم فرز الخلايا المفردة تليها متعدد النسخ العكسي (RT) وبكر قبل التضخيم، تحلل فورا و qPCR إنتاجية عالية تصل إلى 96 من النصوص. سجلت في وقت الفرز قياسات نظام مراقبة الأصول الميدانية وبعد ذلك ترتبط بالبيانات التعبير الجيني بالموقف جيدا لخلق البروتين مجتمعة والنسخي الشخصية. دراسة المصابين بسيف الخلايا مباشرة فيفو السابقين، وحدد الخلايا الكشف qPCR متعددة الأنواع الرنا الفيروسي. الجمع بين النصوص الفيروسية وكمية كل منها توفير إطار لتصنيف الخلايا في مراحل متميزة من دورة الحياة الفيروسية (مثلالإنتاجية مقابل غير منتجة). وعلاوة على ذلك، كانت تسسيبتري سيف⁺ الخلايا مصابة بالمقارنة خلايا معزولة من العينة نفسها لتقييم المضيف الأثران عن الجينات والبروتينات. وكشف التحليل مقدر سابقا الجيش الملكي النيبالي الفيروسية التعبير عدم التجانس بين الخلايا المصابة، وكذلك في فيفو تنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال سيف بوساطة مع القرار خلية واحدة. طريقة تسسيبتري ذات الصلة لتحليل أي السكان خلية قابلة لتحديد الهوية بواسطة التعبير marker(s) البروتين السطحية، gene(s) المضيف أو الممرض، أو مزيج منها.

العديد من مسببات الأمراض داخل الخلايا تعتمد على إليه الخلية المضيفة للنسخ المتماثل، غالباً ما تغيير بيولوجيا الخلية المضيف أو استهداف الفئات السكانية الفرعية محددة جداً للخلايا المضيفة تحقيق أقصى قدر من الفرص لنشر. نتيجة لذلك خلية العمليات البيولوجية تعطلت عادة، مع عواقب ضارة على الصحة العامة للبلد المضيف. فهم التفاعلات بين الفيروسات والخلايا المضيفة التي النسخ المتماثل سيتم توضيح آليات المرض يمكن أن يساعد في تطوير علاجات محسنة واستراتيجيات للوقاية من العدوى. الأدوات التحليلية المباشرة التي تمكن من دراسة التفاعلات بين المضيف الممرض ضرورية نحو تحقيق هذه الغاية. تحليل خلية واحدة يوفر الوسيلة الوحيدة للسمة لا لبس فيه النمط الظاهري خلوية الوراثي خاصة، أو الإصابة بالحالة¹. على سبيل المثال، الإصابات المسببة للأمراض كثيرا ما حمل التغييرات المباشرة وغير المباشرة على حد سواء في الخلايا المضيفة. ولذلك، التمييز بين الخلايا المصابة من نظرائهم غير مصاب ضروري لسمة التغييرات الخلية المضيفة للإصابة المباشرة أو الآثار الثانوية، مثل المعمم التهاب. وعلاوة على ذلك، للعديد من مسببات الأمراض، مثل سيف وفيروسات نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز)، العدوى الخلية المضيفة العائدات من خلال مراحل متعددة، مثل مبكرة أو متأخرة، أو الكامنة، كل منها قد تتسم بالجينات متميزة والبروتين التعبير التشكيلات الجانبية^{2 , 3 , 4 , 5}-سوف تفشل معظم التحليلات المخاليط خلية لالتقاط هذا التغاير⁶. على النقيض من ذلك، الغاية متعدد تحليلات خلية واحدة قادرة على التحديد الكمي للتعبير على حد سواء الفيروسية والجينات المضيفة توفر وسيلة لحل الاضطرابات الخلوية الخاصة بالعدوى، بما في ذلك الاختلافات عبر مراحل الإصابة. علاوة على ذلك، تحليل التفاعلات المضيف الممرض في الناحية الفسيولوجية الإعدادات ذات الصلة أمر بالغ الأهمية للتعرف على الأحداث التي تحدث في الكائنات الحية المصابة. وهكذا، الأساليب التي يمكن تطبيقها مباشرة السابقين فيفو يتم القبض على الأرجح أفضل في فيفو العمليات.

سيف، وفيروس نقص المناعة البشرية المستهدفة CD4⁺ تي الخلايا، التي هي التصدي للعوامل المضادة للفيروسات "تقييد" المضيف ومستضد downregulate تقديم جزيئات إثبات الإصابة بالإنتاجية وتجنب مراقبة محصنة ضد^{7،8، 9،،}من¹⁰¹¹. بدون علاج، نتائج العدوى في خسائر فادحة في خلايا CD4 الخلايا⁺ تي، وفي نهاية المطاف توجت حصل نقص المناعة المكتسب (الإيدز)¹². في الإعداد للعلاج المضاد للفيروسات الرجعية، تستمر الخلايا المصابة خفية الخزانات لعدة عقود، مما يشكل حاجزاً هائلا للاستراتيجيات العلاجية. فهم الخصائص في فيفو خلايا المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية/سيف لديه القدرة على الكشف عن ميزات الخلية المضيفة دوراً هاما في نشوء المرض واستمرار. ومع ذلك، هذا قد تم شديدة التحدي، أساسا بسبب low frequency للخلايا المصابة وعدم توفر والكواشف قادراً على سهولة التعرف عليها. الخلايا التي نسخ الرنا الفيروسي، يقدر أن يكون حاضرا عند 0.01 – 1% من خلايا CD4 خلايا⁺ تي في الدم والأنسجة اللمفاوية^13،،من¹⁴¹⁵. تحت العلاج القمعية، الخلايا المصابة خفية حتى أقل تواترا في 10^-3–10^{-7 16،،}من¹⁷¹⁸. تلوين البروتينات الفيروسية فحوصات أن عمل جيدا لدراسة التهابات في المختبر ، مثل هفوة داخل الخلايا، دون المستوى الأمثل بسبب تلوين الخلفية من 0.01-0.1%، مماثلة أو أكبر من تواتر الخلايا المصابة^{13، 14}. تلطيخ السطحية للبروتين الحياة الفطرية تتسم جيدا [مونوكلونل] الخاصة بالحياة الفطرية سيف، فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام أيضا ثبت أن تكون صعبة، المحتمل لأسباب مماثلة. في الآونة الأخيرة، أدوات مبتكرة تهدف إلى تحسين الكشف عن خلايا معربا عن هفوة أما عن طريق إدراج فحوصات محددة لهفوة الجيش الملكي النيبالي أو باستخدام بديل التصوير التكنولوجيات^14،،من¹⁵¹⁹. بيد أن مثل هذا النهج لا تزال محدودة في عدد القياسات الكمية التي يؤديها في كل خلية.

هنا، يمكننا وصف المنهجية (1) يعرف واحدة من الخلايا المصابة بالفيروس مباشرة السابقين فيفو بالمورثات الفيروسية حساسة ومحددة الكمية قبكر و (2) يوضحها تعبير البروتينات السطحية تصل إلى 18 والجينات 96 لكل المصابين (و خلية غير مصاب). يجمع هذا المنهجية قياس البروتين وحيد الخلية السطحية بنظام مراقبة الأصول الميدانية متبوعاً بتحلل الخلية فورا واستخدام تحليل التعبير الجيني متعدد qPCR المستهدفة في النظام بيومارك. تكنولوجيا الدوائر المتكاملة فلويديك (IFC) يسمح كوانتيتيشن متعدد الجينات 96 من 96 عينة في وقت واحد، أنجزه مصفوفة دوائر 9,216 التي تتم ردود فعل qPCR الفردية. فرز الخلايا الحية نظام مراقبة الأصول الميدانية سجلات قياسات وفرة المحتوى عالي البروتين في حين الحفاظ على الترنسكربيتوم كامل لتحليل أداء فورا المصب. لتحديد الخلايا المصابة بالفيروسات، يتم تضمين فحوصات محددة للكشف الفيروسية المقسمة، وبدلاً من ذلك وأونسبليسيد (فرنا) في التحليل قبكر، جنبا إلى جنب مع فريق فحوصات المعرفة من قبل المستخدم التي بلغ مجموعها يصل إلى 96 الجينات، الحد الأقصى لعدد فحوصات يقيمون حاليا في المؤسسة المالية الدولية. تعبير الجينات والبروتين من المعلومات التي تم جمعها لكل خلية مرتبطة بالموقف جيدا. ونحن سابقا أفادت النتائج من هذا التحليل في مكان آخر²⁰. هنا، نحن نقدم أكثر تفصيلاً المبادئ التوجيهية المنهجية، فضلا عن المزيد phenotyping وصفية لخلايا CD4 المصابة بسيف⁺ تي الخلايا.

يمكن تطبيق هذا النهج، الذي نحن على المدى تسسيبتري، لأن الإيقاف أي سكان خلية قابلة للتطبيق التفاعلي للأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي والتعبير عن الترنسكربيتوم متوافقة مع فحوصات qPCR المتاحة. على سبيل المثال، يمكن استخدامه لوصف الجينات التفاضلية والتعبير البروتين في خلايا نادرة أو خلايا لا يسهل تمييزها بعلامات البروتين السطحي. إعداد نموذج يعتمد على معيار تلطيخ بروتوكول استخدام الأجسام المضادة المتاحة تجارياً. سيتوميتيرس مع إمكانية فرز الخلايا المفردة أيضا متوفرة تجارياً، ولكن احتياطات السلامة الأحيائية إضافية مطلوبة من أجل معالجة الخلايا الحية المعدية. تسجيل ملف التعريف التعبير البروتين وحيد الخلية لكل خلية بالموقف جيدا، المشار إليها هنا كما فهرسة الفرز، سمة مشتركة لنظام مراقبة الأصول الميدانية المتاحة تجارياً فرز البرامج. التحليل الحسابي الجينات المضيف الأثران أعرب السكان خلية للفائدة ولا يرد هنا، ولكن ترد إحالات إلى أساليب نشرها مسبقاً.

ملاحظة: تخطيطي لسير العمل البروتوكول ويرد في الشكل 1. وهو يتألف من ثلاث خطوات رئيسية: نظام مراقبة الأصول الميدانية، الرايت وكدنا قبل التضخيم، و qPCR ليصل إلى 96 من الجينات في وقت واحد. يتم وصف إصدارين من البروتوكول، وفرز الخلايا في الحد من تخفيف وفرز الخلايا المفردة، بمزيد من التفصيل في الخطوة 5 والخطوه 6، على التوالي. هذه الاستراتيجيات ومعالجة مسائل بحثية مختلفة لكن اتباع إجراءات مماثلة.

1-المتطلبات المسبقة أو قبل تحليلات

1. التحقق من صحة جميع فحوصات التعبير الجيني لاستخدامها كما هو موضح سابقا⁶.
   ملاحظة: تتم هذه الخطوة قبل موعد التجربة. التحقق من صحة جميع فحوصات، التجارية والعرف، مطلوب لضمان كفاءة وخطي التضخيم من الحمض النووي الريبي ذات الصلة وصولاً إلى مستوى خلية واحدة. فشل العديد من الاختبارات المتاحة تجارياً ومخصصة للوفاء بهذه المواصفات. ترد في ملفات الترميز الإضافي 1-5تجهيز وتركيب منحنى الآلي للتأهيل المتزامن لفحوصات تعبير الجينات تصل إلى 96، ولكن يمكن أن يكون مؤهلاً الاختبارات الفردية استخدام R² ومنحدر يصلح الخطي ل. والرزن الناجحة والفاشلة الممثل المؤهل المؤامرات مبينة في الشكل 2.
2. وضع لوحة سيتوميتريك تدفق من الأجسام المضادة لوصمة عار علامات خلية السطحية للفائدة.
   1. تيتراتي الأجسام المضادة تلطيخ عينة ذات صلة، على سبيل المثال، الريسوسي المحيطية وحيدات النوى خلايا الدم (ببمكس)، مع كل جسم. بدء تشغيل مع 20 ميليلتر من جسم كل اختبار في 100 ميليلتر تلطيخ رد فعل وإنشاء ثمانية تخفيف المسلسل شقين. تحديد تركيز الأمثل الذي يسلك الحد الأقصى لتلطيخ كثافة مع الحفاظ على فصل واضح بين السكان السلبية والإيجابية.
   2. تقييم تلطيخ مجتمعة في sample(s) خلية إضافية باستخدام الخليط من جميع الأجسام المضادة في تركيز الأمثل تحديد في الخطوة 1.2.1. تأكد من أن تلطيخ مماثلة لتلك التي لوحظت بالنسبة للبقع جسم الفرد. إذا تلطيخ أقل من ما لوحظ عند استخدام أي جسم بمعزل عن غيرها، النظر يرتبط fluorochrome بديلة لتحل محل تلك الأجسام المضادة.

2. إعداد المقايسة تعبير الجين

1. التعبير الجيني 96 الجمع بين فحوصات في رناسي الدناز خالية/أنبوب 1 – 15 مل (حجم قد تختلف مع عدد لوحات الفرز). لوحة الاختبارات المستخدمة في هذه الدراسة هو المحدد في الجدول 1 و الجدول 2. المواد الناتجة عن ذلك يشار إلى "مزيج المقايسة". إضافة كل مقايسة لتركيز نهائي من 180 نانومتر إلى الأمام وعكس كبسولة تفجير. إضافة "المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي" لتحقيق التخفيف المناسبة من "مزيج المقايسة".
   ملاحظة: لأغراض عملية، مخزونات مخصصة المقايسة (المستخدم لتوليد) قد تكون مستعدة في 18 ميكرون لتكون متسقة مع تركيز المتاحة تجارياً "x 20" الجينات التعبير qPCR فحوصات (جدول المواد). 18 ميكرومتر يمزج من التمهيدي إلى الأمام وعكس مخصصة لكل الجينات مصنوعة من حلول الأسهم في "المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي". فحوصات متوفرة تجارياً (جدول المواد) تشمل أيضا تحقيقات، ولكن المسابير ليست مطلوبة من أجل RT أو كدنا قبل التضخيم ويمكن إهماله وبالتالي لفحوصات مخصصة. من المستحسن تضمين واحد أو أكثر من الجينات التدبير المنزلي لاستخدامها في مراقبة الجودة لتقييم كفاءة الفرز واسترداد الخلية، وتوليف كدنا. استخدام كبسولة تفجير عشوائي لتوليد كدنا لم تحدد، ولكن من المتوقع أن تكون أقل كفاءة من الإشعال الخاصة بالجينات.
2. إعداد 2 × لوحة المقايسة للاستخدام في الخطوة 7، 1 (متعدد qPCR). لكل مجموعة شرائح 96 × 96 المتوقعة، "الماصة؛" 6 ميليلتر لكل فحص في كل عين جيدا من صفيحة بكر 96-جيدا. على سبيل المثال، للرقائق 5، سوف تشغل 30 ميليلتر لفحص كل بئر واحدة في لوحة 96-جيدا. إذا كان استخدام فحوصات 96، سيحتوي كل بئر من لوحة 96-جيدا مقايسة. ختم اللوحة بختم لاصقة.
   ملاحظة: من الناحية المثالية، 2.1 و 2.2 يتم تنفيذ الخطوات في نفس الوقت، لتجنب دورات تجميد أذاب متعددة لفحوصات التعبير الجيني. يجب أن كانت جميع الجينات داخل لوحة الفحص أيضا موجودة في "مزيج المقايسة" (الخطوة 2، 1). مزيج المقايسة ولوحة الفحص يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية للاستخدام في الأجل الطويل أو القصير، على التوالي.

3-سطح وصمة عار خلايا قابلة للحياة

ملاحظة: تلطيخ داخل الخلايا، وبيرميبيليزيشن، والتثبيت غير متوافقة مع هذا الأسلوب كما أنها تهدد الجيش الملكي النيبالي.

1. إعداد العينات التعويض بإضافة كل جسم المدرجة في الجدول للمواد 40 ميليلتر من حبات التعويض في 2.5-fold تركيز أعلى من تلك المستخدمة لتلوين الخلية. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية محمية من الضوء. أضف 3 مل من برنامج تلفزيوني الخرز وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية. نضح في برنامج تلفزيوني وريسوسبيند الخرز في ~ 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
2. إعداد أرز خلية سيتوميتريك تدفق لتجهيز العينة: الحصول على تعويض أنابيب وإنشاء مصفوفة التعويض، وتطبيق مصفوفة للحصول على الملفات للعينات التجريبية.
3. إعداد مزيج الرئيسي من جسم الفلورسنت كوكتيل بالجمع بين وحدة التخزين المناسبة لكل جسم كما هو محدد في الجدول للمواد، في أنبوب العنبر 1.5 مل لجميع العينات تكون الملون. دوامة والطرد المركزي الكوكتيل في س 21,000 ز لمدة 2 دقيقة عند 25 درجة مئوية بيليه الضد، المجاميع.
   ملاحظة: يتم سرد الأجسام المضادة المستخدمة هنا في الجدول للمواد.
4. ذوبان الجليد cryopreserved الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية للحد الأدنى 2 إضافة 0.5 – 2 مل من تعليق خلية لمل 12 من برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية، ونضح برنامج تلفزيوني. ريسوسبيند في 3 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب البوليستيرين 5 مل. الطرد المركزي كما ذكر أعلاه ونضح برنامج تلفزيوني، تاركاً ~ 20 ميليلتر المتبقية في برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: قد تكون تكييف درجة الحرارة المصبوغة لدرجات حرارة أكثر دفئا أو أكثر برودة حسب الحاجة لتطبيقات محددة عن طريق تعديل المعايرة جسم تلطيخ الشروط تبعاً لذلك (راجع الخطوة 1، 2).
5. ريسوسبيند يصل إلى 2 × 10⁷ يغسل خلايا في 80 ميليلتر من جسم كوكتيل واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية محمية من الضوء. لعينات تتجاوز 2 × 10⁷ الخلايا، وزيادة حجم رد فعل المصبوغة تبعاً لذلك للحفاظ على < 2 × 10⁷ خلايا/100 ميليلتر.
6. غسل الخلايا بإضافة 3 مل من برنامج تلفزيوني، سينتريفوجينج في 500 x ز لمدة 3 دقائق، ويسفط المادة طافية.
7. دقة ريسوسبيند الخلايا في 300 – 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني والتصفية حسب بيبيتينج من خلال 35 ميكرون نايلون خلية مصفاة كاب. تبقى الخلايا على الجليد ومحمية من الضوء حتى الفرز.

4-إعداد لوحات جمع خلية وتنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز وكدنا إنشاء

1. الجمع بين المكونات RT preamp "رد فعل مزيج" (الجدول 3) التي بيبيتينج في أنبوب عقيم واحدة خالية من رناسي/الدناز.
   ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة قبل أو أثناء تلطيخ في الخطوة 3. قد أغفل الإنزيم RT هنا لتحديد مساهمة قالب الحمض النووي لإشارة قبكر.
2. استخدام ماصة متعددة القنوات للاستغناء عن 10 ميليلتر RT preamp "رد فعل" مزيج إلى العدد المطلوب من 96-بئر بكر فرز مجموعة لوحات. ختم اللوحات مع الفيلم لاصقة، ووضع اللوحات على كتل الألومنيوم 96-جيدا مبردة مسبقاً.
3. إنشاء خلية الفرز على cytometer تدفق مخطط النابضة بالحصول على البيانات من الخلايا تقريبا 20,000 العينة الملون. ضمان تطبيق مصفوفة التعويض للبيانات التي تم جمعها. رسم البوابات وتعريف الشجرة النابضة التي تحدد طوعيين الخلية من المصلحة أن تكون معزولة لتحليل التعبير الجيني.
   ملاحظة: يظهر الشجرة النابضة المستخدمة لجمع الخلايا فرنا⁺ سيف المحتملة في الشكل 3.
4. أدخل إعدادات الأداة المناسبة لتحديد عدد ومجموعة فرعية من الخلايا فرز في كل بئر. تعليمات مفصلة إضافية للفرز أما سلسلة إضعاف الحد خلية أو الخلايا المفردة وترد في الخطوتين 5 و 6، على التوالي.
5. نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا إلى 96-جيدا استعداد بكر جمع اللوحات. إزالة الختم لاصقة قبل الفرز واستبدل بختم جديدة بعد عملية الفرز.
   ملاحظة: الاحتفاظ اللوحات على كتل الألومنيوم مبردة مسبقاً في جميع الأوقات، بما في ذلك أثناء عملية الفرز.
6. لوحة جمع فورا بعد الفرز ودوامه وأجهزة الطرد المركزي في س 2,000 ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
7. ثيرموسيكلي اللوحة في جهاز PCR مع غطاء مسخن استخدام الشروط التالية: 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (RT)، 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها دورات 18 من 95 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 4 دقيقة (قبل التضخيم).
8. تمييع كدنا 1:5 بنقل 5 ميكروليتر من كدنا في 20 ميليلتر من الحمض النووي تعليق العازلة في صفيحة بكر 96-بئر جديدة. كدنا المخفف قد تكون مخزنة في 4 درجات مئوية أو-20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى في هذه المرحلة. كدنا جاهز الآن ليتم استخدامه كقالب ل qPCR (الخطوات 5، 2، 7، 4).
   ملاحظة: هذا تمييع يضمن أن الإشعال في رد فعل RT preamp لا تسهم qPCR المتلقين للمعلومات.

5-تباين ج: نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا إلى "سلسلة إضعاف الحد" لتحديد تواتر فرنا⁺ الخلايا أو القيام "مراقبة جودة التجريبية"

ملاحظة: قبل تنفيذ فرز خلية واحدة، قد يكون لاستخدامها لتحديد تواتر الخلايا ذات الاهتمام، بفرز الخلايا إلى تخفيف المسلسل في تكرار. هذه الخطوة أيضا ينص على مراقبة الجودة قيمة الفرز الكفاءة وتحلل الخلية والانتعاش الحمض النووي الريبي وتوليف كدنا، كما هو موضح في الخطوة 5، 3. يسمح تحديد مسبق للتردد خلية فرنا⁺ لتقدير أكثر دقة لعدد الخلايا المفردة التي يجب أن يتم فرز لتحقيق حجم عينة كافية لتحليل تعبير الجينات الخلية فرنا تعمل بشكل مناسب⁺ .

1. نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا إلى لوحات 96-جيدا على استعداد كما هو الحال في الخطوات 4، 1-4-2، وجمع الخلايا 1 – 1,000 كل بئر في replicates متعددة.
   ملاحظة: عدد الآبار نسخ متماثل في كل خلية تمييع يرتبط عادة عكسيا مع تركيز الخلية الواحدة وكذلك. عند الخلية المصابة والتردد أقل من 1%، ينبغي أن تركز تخفيف الخلية على خلايا 100 – 1,000 كل بئر. مخطط لوحة فرز مثال يرد في الشكل 1، أعلى اليسار. تزيد الخلايا 1,000 كل بئر ينبغي تجنبها بسبب الزيادات الناتجة عن ذلك في حجم رد الفعل والتدخل مع توليف كدنا المتلقين للمعلومات والقياس الكمي.
2. الجمع بين الكواشف qPCR في حل ميكس رئيسية في الجدول 4. حجم رد فعل 25 ميليلتر، يجمع ميليلتر 22.5 من مزيج الرئيسي مع 2.5 ميليلتر من قالب كدنا المخفف من الخطوة 3، 9. أداء qPCR استخدام شروط ركوب القياسية (مثلاً، 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها دورات 40 94 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة).
   ملاحظة: ينصح سينجليبليكس قبكر ردود الفعل باستخدام أداة قبكر في الوقت الحقيقي تقليدية تحليلاً أولياً اقتصادا لفحوصات واحد أو عدد قليل لإثبات كفاءة الخلية الفرز واستعادة الجيش الملكي النيبالي، وتوليف كدنا. يمكن استخدامه أيضا لحساب تواتر الخلايا فرنا⁺ . ردود الفعل qPCR متعدد باستخدام بيومارك تكون عادة أكثر ملاءمة لتحليلات واسعة النطاق لخلية واحدة.
3. لمراقبة الجودة، والأرض والقيم (Et = −_ماكس الأشعة المقطعية Ct) مقابل عدد من الخلايا يتم فرز كل بئر على نطاق₁₀ سجل وتطبيق إجراء تحليل انحدار خطي.
   ملاحظة: replicates متسقة والانحدار الخطي المنحدر من 3.3 (± 0.3) ص² > 0.9 تدل تجربة تتسم بالكفاءة. أمثلة للنوع الأمثل والأمثل، تظهر التجارب RT-preamp في الشكل 4.
4. لتحديد تواتر الخلايا فرنا⁺ ، ارسم أرقام الخلية فرز كل بئر على المحور السيني (سجل₁₀ مقياس) وجزء صغير من الآبار الإيجابية لفرنا في تمييع كل خلية على المحور ص. للحصول على مثال، راجع الشكل 1 (السفلي الأيسر، توزيع بواسون). تطبيق نموذج انحدار خطي للبيانات لتحديد عدد الخلايا التي تأوي خلية إيجابية واحدة في المتوسط، تناظر 63.2 في المائة من الآبار الإيجابية (0.632 على المحور ص)²¹. تحويل هذا العدد إضعاف الخلية (التقاطع المحور س) إلى التردد معبراً عنه كنسبة مئوية. على سبيل المثال، يكافئ خلية فرنا⁺ واحدة كل الخلايا 48 تردد 2.1 في المائة.

6-تباين باء: نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا لتحليل خلية واحدة

1. اتبع الخطوات 4، 1-4، 8، وحدد خلية واحدة فرز كل جيدا باستخدام ميزة فرز مؤشر التدفق في سيتوميتير لإنشاء ملفات FCS فردية لكل خلية تم فرزها، تعيين بواسطة الموقف جيدا.
   ملاحظة: إذا تجاوز عدد فرز مجموعة لوحات عدد ثيرموسيكليرس المتاحة، ركوب الدراجات يمكن أن يتوقف بعد الخطوة المنظمة المنتسخة العكسية (95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة) وكدنا يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية حتى ثيرموسيكليرس متوفرة. وفي هذه الحالة، يبدأ قبل التضخيم في الدورة الأولى من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
2. اختياري: إنشاء كدنا "تجمعات" تتألف من كدنا من دفعات واحدة من الخلايا المعرفة من قبل المستخدم إلى الشاشة لخلايا نادرة لمصلحة استخدام كدنا غير مخفف المتبقية. نقل 2 ميليلتر من غير مخفف خلية واحدة قبل تضخيم كدنا ماصة متعددة القنوات في لوحة 96-بئر جديدة. كرر قبل بيبيتينج ميليلتر 2 من كدنا من خلايا مفردة إضافية كل من تجمع المعين في نفس جيدا. شاشة مسابح كدنا ل gene(s) للفائدة (مثلاً، فرنا) لتحديد تلك التي تحتوي على الخلايا إيجابية باستخدام قبكر التقليدية. منذ تجميع يتطلب فقط قاسمة صغيرة من كدنا من كل خلية، ميليلتر ~ 8 المتبقية من كدنا لا تزال متاحة لتحليلات خلية واحدة.
   ملاحظة: يوصي بتجميع الاستراتيجيات قبل إجراء تحليل التعبير الجيني خلية واحدة في محاولة للحد من عدد الخلايا المفردة التي استجوبته qPCR متعدد كثيفة الاستخدام للموارد. ومن المناسب للحالات التي الخلايا للفائدة (مثلاً، مرناً سيف +) قد يحددها مقايسة qPCR أولية واحدة-من نوع plex. وتشمل الاستراتيجيات الفائق مباشرة إنشاء تجمعات كدنا الجمع بين 2 ميليلتر من كدنا غير مخفف من صفيحة فرز مجموعة الصفوف (أي 12 كافة الخلايا في الصف A) أو أعمدة (أي 8 كافة الخلايا في العمود 1)، في بئر واحدة في لوحة جديدة. لتحديد أفضل تجمع استراتيجية، النظر في تواتر المتوقعة من الخلايا للفائدة من الخطوة 5، 4. على سبيل المثال، إذا كان من المتوقع أن تكون إيجابية 10% خلايا، تجمعات تتألف من ست عينات لكدنا خلية واحدة كثيرا ما سيكون سلبيا ويمكن وبالتالي استبعاد الخلايا تمثل في أن التجمع من المصب خلية واحدة تحليلات.

7-متعدد qPCR على منصة بيومارك

ملاحظة: هذا المقطع قد اتبع الإصدار A أو B الموصوفة أعلاه. في الدراسة المبينة في هذا التقرير، أنه تم تطبيق حصرا لتحليل خلية واحدة.

1. إعداد لوحة الإنزيم qPCR ميليلتر 4 بيبيتينج لفحص كل من 2 × لوحة المقايسة (إعدادها في الخطوة 2، 2) في لوحة بكر 96-بئر جديدة تحتوي على 4 ميليلتر للمقايسة تحميل الكاشف في كل بئر. الحفاظ على لوحة الفحص في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: لوحة الفحص مستقر عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد، وفي-20 درجة مئوية لمدة شهر واحد. وهكذا، قد يكون من المفيد إعداد مواد كافية لرقائق متعددة وتخزين مناسبة.
2. الاستغناء عن السوائل خط السيطرة من المحاقن فتيلة في الصمامات اثنين من شرائح. قم بإزالة البلاستيك واقية تحت اللوحة. وضع الرقاقة على وحدة تحكم المؤسسة المالية الدولية مع الجانب مسنن الموضع A1. من القائمة الرئيسية، حدد البرنامج النصي "رئيس الوزراء". قم بتشغيل البرنامج النصي.
3. إعداد "مزيج التفاعل في الوقت الحقيقي" عن طريق خلط 50 ميكروليتر من عينة تحميل كاشف مع 500 ميليلتر من مزيج PCR الرئيسية (جدول المواد) لكل رقاقة موائع جزيئية. "الماصة؛" ميليلتر 4.4 في كل بئر من صفيحة بكر 96-بئر جديدة، المعين من الآن فصاعدا كلوحة "العينة".
4. "الماصة؛" ميليلتر 3.6 من كدنا المخفف 1:5 من الخطوة 4، 8 إلى لوحة عينة تحتوي على "مزيج التفاعل في الوقت الحقيقي".
   ملاحظة: إذا كان إجراء تشكيلة أسفل PCR الشاشة لنادرة (مثلاً، فرنا⁺) الخلايا لتحليل المتلقين للمعلومات كما ورد في الخطوة 6، 2، تشمل الخلايا ممثلة في مجمعات الإيجابية فقط.
5. بعد انتهاء فتيلة رقاقة، تحميل مداخل رقاقة بالاستغناء عن ميليلتر 5 من لوحة الفحص في المقابلة أيضا على الجانب مسنن (مقايسة) رقاقة، 5 ميليلتر من لوحة عينة في المقابلة لها في الجانب الآخر (عينة) من شرائح. إدراج شرائح في وحدة تحكم المؤسسة المالية الدولية، وتشغيل البرنامج النصي "تحميل ميكس".
6. نقل الرقاقة إلى منصة بيومارك أداء qPCR متعدد. المضي قدما في إعداد صك وبرمجة qPCR اتباع التعليمات خطوة بخطوة يقدمها البرنامج "تحليل PCR الوقت الحقيقي" واستخدام بروتوكول التعبير الجيني (جنرال الكتريك) 96.96 V.1 القياسية مع دورات 40 من بكر. احفظ الملف شبرون في مجلد معين.
   ملاحظة: يمكن تشغيل رقائق متعددة يوميا وعلى مدى عدة أيام.
7. تحليل البيانات قبكر.
   1. فتح برنامج تحليل PCR الوقت الحقيقي. افتح الملف "ChipRun.bml" من "الملف | القائمة المفتوحة ".
   2. تحديد موقع "مستكشف رقاقة" ورقاقة تشغيل الملخص "في الركن الأيمن العلوي من إطار البرنامج. التعرف على المكونات الثلاثة "ملخص تشغيل شريحة": تحليل وجهات النظر وإعداد نموذج للكشف عن الإعداد.
   3. انقر فوق "كشف برنامج الإعداد". تحت "المهام"، انقر فوق "جديد"، وحدد نوع الحاوية "SBS لوحة"، وتنسيق حاوية "SBS96". بجوار "التعيين"، انقر فوق... زر، وحدد "M96-التحليل-SBS96.dsp".
      1. اختياري: تعيين كل كاشف (مقايسة) رقم أو اسم في المقطع "اسم" لكل بئر بالنقر المزدوج فوق 1^st جيدا. الانتقال إلى التالي جيدا بالضغط على "F2".
   4. انقر فوق "نموذج" في برنامج الإعداد. ضمن "المهام" بجوار "التعيين"، انقر فوق... زر، وحدد "M96-عينة-SBS96.dsp".
   5. انقر فوق "تحليل وجهات النظر". ضمن "المهام" في علامة التبويب "قبكر"، حدد "تصحيح خط الأساس للخطى (مشتق)"، و "Ct عتبة الأسلوب المستخدم (كاشفات)". في علامة التبويب "Ct عتبات"، تحقق من "تهيئة مربع السيارات". انقر فوق الزر "تحليل" أعلاه.
   6. في الربع الأيمن العلوي من "تحليل وجهات النظر"، انقر فوق علامة التبويب الثانية "جدول النتائج". من القائمة المنسدلة، حدد "عرض خريطة الحرارة". سوف تظهر على خريطة الحرارة مع البيانات.
      1. اختياري: لضمان موحد روكس الأسفار عبر الرقاقة، حدد "عرض الصورة" بدلاً من "عرض خريطة الحرارة" من نفس القائمة. في الفترة الثانية من الإطار الأيمن فوق الخريطة الحرارة، حدد "روكس". في المرحلة الأولى من الإطار الأيمن، حدد واحدة من دورات 1-40. انقر فوق في الرابع من الإطار الأيمن للتبديل إلى عرض fluorescence روكس اللونين الأبيض والأسود. سوف تظهر صورة التي يبلغ يرش، الجسيمات، أو العيوب على الرقاقة. إذا صارخ هو حجب التوحيد روكس، إعادة تشغيل الرقاقة.
   7. إطار خريطة الحرارة، انقر فوق "عتبة" و "سجل الرسم البياني". ضبط عتبات Ct يدوياً لكل كاشف بالنقر على فحوصات (أعمدة خريطة الحرارة) وسحب العتبة اللازمة لتتقاطع مع منحنيات التضخيم في المرحلة الأسية. عند القيام بذلك، انقر فوق "تحليل".
8. تصدير بيانات qPCR كملف.csv. استيراد البيانات إلى جدول بيانات أو برامج التحليل الإحصائي (مثلاً، أحزاب اللقاء المشترك) ورسم خريطة لنتائج العينة وتحليل المواقف على الرقاقة. تنظيم الخلايا في مجموعات استناداً إلى التعبير عن الجينات الفيروسية، عن طريق إنشاء عمود جديد واستخدام صيغة شرطية. تحت "تحليل"، حدد "التي تناسب X Y" والمؤامرة تعبير الجينات مقابل مجموعة. تطبيق التحليل الإحصائي.
   ملاحظة: يتم تصوير الممثل التعبير الكمي خلية واحدة من أربعة أنواع من "الحمض النووي الريبي سيف" في مؤامرات المتغيرين في الشكل 5A. ويبين الشكل 5Bالمضيف الكمية التعبير الجيني في خلايا "الحمض النووي الريبي سيف"⁺ .
9. استخراج قيم التعبير كمية البروتين من بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية في خلية واحدة.
   1. .Fcs فتح الملفات من نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز (الخطوة 6.1) المقابلة للوحة 96-جيدا باستخدام فلوجو الإصدار 9. مع اسم الملف وأبرز، حدد "منصة | البوابة رقم الحدث | إنشاء نوع المفهرس غيتس ". سوف تظهر الخلايا الفردية المعروضة حسب الصف.
   2. تسليط الضوء على كافة الخلايا 96 (لا الصفوف) وحدد "مساحة العمل | تصدير | حدد فلورس تعويض كل شيء ". تحت "نوع البيانات"، حدد "FCS ملف"، انقر فوق "تصدير"، وحدد مجلد معين.
   3. اسحب الملفات.fcs الجديدة لخلايا فردية في مساحة عمل جديدة فلوجو. تسليط الضوء على كافة الخلايا، انقر فوق "إضافة إحصاءات" (الزر "Σ" في الزاوية اليسرى العليا) "| يعني | كافة المعلمات فلور ".
   4. فتح "محرر جدول" بواسطة النقر فوق الزر الرابع من اليسار في الزاوية اليسرى العليا. تسليط الضوء على جميع فلوريسنت الخلية الأولى واسحبها إلى نافذة محرر الجدول. في إطار محرر الجدول، انقر فوق الزر نفسه في أعلى "إنشاء وعرض جدول". سيقوم هذا بإنشاء جدول الخلايا 96 ومعلمة رقمية لكل فلور.
   5. نسخ الإخراج إلى برنامج قاعدة بيانات (مثلاً، MS Excel، أحزاب اللقاء المشترك)، أما النسخ/اللصق أو بالنقر فوق "حفظ وتشغيل التطبيق" (الرابع من الزر الأيسر أعلى الجدول).
      ملاحظة: هذا الإجراء محددة لإصدار 9 فلوجو. فلوجو الإصدار 10 يستخدم إجراء آخر لاستيراد البيانات المفهرسة. البيانات المفهرسة تدفق يمكن أيضا نسخ/لصق في أحزاب اللقاء المشترك مباشرة من ملفات.csv التي تم إنشاؤها بواسطة فارز الخلية.
10. دمج خلية واحدة نظام مراقبة الأصول الميدانية والبيانات قبكر برقم اللوحة وكذلك موقف. إجراء التحليلات الإحصائية والرسوم البيانية على الجينات خلية واحدة مجتمعة (qPCR) وبيانات التعبير (نظام مراقبة الأصول الميدانية) البروتين.
    ملاحظة: أمثلة من خلية واحدة جنبا إلى جنب قبكر ويتم عرض بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية في الشكل 6 (استضافة ملامح التعبير البروتين السطحية للخلايا المكاك الريسوسي فرنا المصابة بسيف، المقسمة⁺ )، الرقم 7 (التعبير الجينيCD4 مقابل السطح خلايا CD4 البروتين التعبير في الخلايا المكاك الريسوسي فرنا المقسمة⁺ )، ونشرت سابقا²⁰. تحديد الأثران أعرب عن الجينات في الخلية طوعيين للفائدة، وهي خلية واحدة تحليل الأساليب الموصوفة سابقا الموصى بها^20،22،،من²³²⁴، التي تستأثر نسبة الخلايا إيجابية لجينات، فضلا عن قيمة التعبير الجيني المستمر.

سير العمل للبروتوكول بأكمله هو مبين في الشكل 1. وهو يتألف من الاختلافات بين تعريف عدد من الخلايا التي تم فرزها: أما تمييع الحد أو كواحدة من الخلايا، كما هو موضح في النص. وترد أمثلة للتحقيق التمهيدي المؤهل التحليلات على إضعاف تخفيف الحمض النووي الريبي المسلسل في الشكل 2. ويرد في الشكل 3الاستراتيجية النابضة لتحديد خلايا سيف⁺ محتملة. وترد قبكر الفاشلة بنجاح ودون المستوى الأمثل في مجال مراقبة الجودة للجينات التدبير المنزلي جابده على نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا في الحد من التخفيف في الشكل 4. وترد في الشكل 5التعبير الكمي خلية واحدة من أربعة "سيف الجيش الملكي النيبالي" الأنواع ريسوس المكاك الجينات والتي أبديت متفاوتاً في الخلايا المصابة. الممثل المتغيرين، والرسم البياني، و scatterplots تصور الشخصية التعبير سطح البروتين من "الحمض النووي الريبي سيف"⁺ CD4⁺ تي الخلايا تقاس بالتدفق الخلوي في الشكل 6. وارسم فقاعة تريفارياتي (الشكل 7) يعرض العلاقة بين سطح البروتين CD4 أو CD3 CD3 أو مرناً CD4 وكمية المورثات الفيروسية (تأت/rev) التعبير في الخلايا المفردة.

الشكل 1 : يوضح التخطيطي لسير العمل التجريبي ثلاثة عناصر رئيسية: تدفق فرز سيتوميتريك، النسخ العكسي زائد على أساس PCR قبل التضخيم من كدنا (RT، أمبير قبل)، وقبكر. يمكن إجراء الفرز أما إضعاف الحد (A, خلفية خضراء) أو كخلايا مفردة (ب، خلفية برتقالية). مباشرة بعد هذا النوع من نظام مراقبة الأصول الميدانية، يتم تفكيك الخلايا والحمض النووي الريبي هو عكس يدون في كدنا وتضخيم مسبقاً (RT، PCR قبل أمبير) لإعداد قالب qPCR. يحد تمييع أنواع تحديد تواتر الخلايا إيجابية للجيش الملكي النيبالي الفيروسية باستخدام إحصاءات توزيع بواسون، فضلا عن الكفاءة التجريبية ونموذج الاسترداد. رأس السهم الأخضر يشير إلى العدد المقدر لخلايا فرز كل خلية واحدة تتضمن أيضا إيجابية لجين فيروسي (المقابلة لاحتمال 63.2 في المائة من هذه الآبار يجري جين الإيجابي)، التي يتم تحويلها إلى تردد خلية. يمكن استخدام تقديرات تواتر إبلاغ العدد الخلايا المفردة التي تم جمعها في فرز لاحقة (ب). الخلية الواحدة وكذلك نظام مراقبة الأصول الميدانية خلية واحدة المفهرسة الودائع فرز واحد ويقوم بإنشاء ملفات البيانات لكل خلية المشروح بالموقف جيدا داخل لوحة 96-جيدا. قبكر خلية واحدة يتم إجراؤها في متعدد للجينات 96 في وقت واحد. الجمع بين البروتين السطحي (نظام مراقبة الأصول الميدانية) والتعبير مرناً يسمح للتنميط الخلايا المفردة (العمود الأيمن). يمكن أداؤها قبكر اختياري لجينات فيروسية بين PCR قبل التضخيم ومتعدد قبكر (ب، الأوسط) إلى الخلايا المفردة الشاشة أو تجمعات كدنا خلية واحدة لأسفل حدد خلايا الحمض النووي الريبي⁺ الفيروسية أو تجمعات لتحليل متعدد qPCR. الحرارة خريطة يوضح التعبير الجيني (قيمة Ct) لفحوصات 96 (الأعمدة) وخلايا مفردة 96 (صفوف). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: تظهر البيانات qPCR الممثل من تجارب التأهيل التمهيدي للنجاح (اليسار والوسط) وفشل الاختبارات المتوفرة تجارياً (يمين) (CD6، سيف تأت/rev، و TLR3، على التوالي)- للجيش الملكي النيبالي CD6 و TLR3، يستخرج من المكاك الريسوسي فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية⁶ 10 خلايا CD4 ببمك⁺ تي-الخلايا باستخدام مجموعة أدوات تجارية. ثمانية وإنشاء نسخ متماثلة من سلسلة تمييع اثنا عشر-نقطة الجيش الملكي النيبالي شقين (0.023-48 نانوغرام الجيش الملكي النيبالي، المقابلة مكافئات خلية 1.2 – 2,400 على افتراض 20 بيكوغرام الحمض النووي الريبي لخلايا CD4⁺ تي خلية) تعرضوا ل RT-preamp وقبكر. لسيف تأت/rev، تم استخراج الحمض النووي الريبي من المكاك الريسوسي ببمكس المصابة في المختبر مع SIVmac239. وتم إعداد تخفيف الحمض النووي الريبي مكافئات الحمض النووي الريبي تمتد من 6 – 12,000 الخلايا. ويتم رسم القيم (40-Ct)، والتي تزيد مع التعبير الجيني، مقابل أرقام الخلية المقدرة. سلسلة تمييع العارضة R² > 0.97 والمنحدر من 3.32 ±0.3 تشير إلى التأهيل التمهيدي ناجحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: المؤامرات "المتغيرين نظام مراقبة الأصول الميدانية" مع مخطط لعزل الخلايا المكاك الريسوسي يحتمل أن تكون مصابة بسيف النابضة. بوابات متتابعة لتحديد الذاكرة (CD95 +) CD4⁺ تي تظهر الخلايا من أعلى اليسار إلى أسفل اليمين مع كل السكان الاسم المشار إليه. ويشار في المئة من الأرض الأم التي تقع ضمن كل باب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : الممثل التحقق التجريبي من قبكر يقوم على نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا في الحد من استخدام تمييع جابده الجينات التدبير المنزلي لثلاث تجارب مستقلة: نجاح (يسار)، دون المستوى الأمثل (الأوسط)، وفشل (على اليمين). وينبغي أن تمتد replicates الخلايا 10-100 في بئر Ets لا يزيد عن 2، و 300 – 1,000 خلية الآبار داخل 1 Et. يجب أن يكون ميل الانحدار الخطي 3.32 ± 0.3، ص² > 0.95. الفشل في تحقيق هذه المواصفات تشير إلى الصعوبات التقنية في الخطوات 1، 2، 3، أو مزيج منها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : خلية واحدة الكمية الفيروسية والمضيف التعبير الجيني في المكاك الريسوسي فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية CD4⁺ خلايا تي من الإصابة SIVmac251 بعد 10 أيام العقدة الليمفاوية المساريقي العلوي- التعبير الجيني الفيروسي (A) المتغيرين مؤامرات لضرب-تقسم (تأت/rev) وتقسم منفردة (الحياة الفطرية) سيف مرناً بأحادية الخلايا (إلى اليسار). تأت/rev⁺الحياة الفطرية^– الخلايا (خلايا خضراء خفيفة على طول المحور س) إكسبريس نسخ أقل من تأت/rev الجيش الملكي النيبالي من الخلايا الحياة الفطرية⁺ (أخضر داكن)، تمشيا مع مبكر مرحلة الإصابة وقبل تحقيق الاستقرار بوساطة البروتين Rev والصادرات النووية فرناس المقسمة جزئيا مثل الحياة الفطرية. الخلايا التي لا تعبر عن الرنا الفيروسي المقسمة يصور في الرمادي (لا الجيش الملكي النيبالي الفيروسية)، براون (اسكت⁺ و لتر⁺) أو تان (أما اسكت⁺ أو لتر⁺). أونسبليسيد (اسكت⁺) ومجموع التعبير مرناً سيف (لتر⁺) ويرد لنفس الخلايا (يمين). وفرة عالية أونسبليسيد اسكت الجيش الملكي النيبالي في تأت/rev⁺الحياة الفطرية⁺ الخلايا يتسق مع أواخر مرحلة العدوى الإنتاجية خلالها هو الإعراب عن وفرة المجينية الحمض النووي الريبي للتعبئة والتغليف في مهدها فيريونس. كمان (ب) يرسم الجينات المكاك الريسوسي الأثران المعرب عنها في مجموعة فرعية واحدة على الأقل من الخلايا المصابة بسيف مقارنة مع الخلايا مصابة (رمادي). تم إجراء التحليل الإحصائي كما هو موضح سابقا^20،22،،من²³²⁴. تشير العلامة النجمية إلى معدل اكتشاف كاذبة < 10% في احتمال مجتمعة نسبة اختبار المقارنات بالنسبة إلى الخلايا مصابة. يربط خط متوسط القيم عبر مجموعات خلية لكل الجينات. وقد تم تعديل هذا الرقم من بولتون et al. ²⁰ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 6: استضافة الممثل البروتين السطحي التعبير التشكيلات الجانبية لنظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا من 10 أيام بوست-SIVmac251 الإصابة بالعقدة الليمفاوية المساريقي العلوي المكاك الريسوسي. عرض سكاتيربلوت (A) التعبير البروتين السطحي CD3، خلايا CD4 ونظام ايكوس في مصابة (رمادي) و اسكت⁺تأت/rev^– (براون)، و اسكت⁺الخلاياتأت/rev⁺ (أخضر). كثافة fluorescence المرسومة لكل خلية (نقطة). تصور المؤامرات مربع الخارجة نطاق المجال (IQR) والوسيط (مربع)، نقاط أبعد داخل 1.5 x IQR من مربع (شعيرات)، وإمكانات المتطرفة (قطع نقطة). أشرطة أفقية في الأعلى تشير إلى اختلافات كبيرة (ف < 0.05، اختبار التصنيف الرتبي nonparametric). (ب) عرض بيفارياتي والرسم البياني للتعبير البروتين CD3 و CD4 السطحية للخلايا المبينة في (أ). ارسم نقطة (يسار) يشير إلى النسب المئوية لكل السكان خلية داخل رباعي. رسوم بيانية CD3 و CD4 (الأوسط) حق تصوير downregulation البروتين السطحية بين الخلاياتأت/rev⁺ اسكت⁺بالنسبة لغير مصاب و اسكت⁺الخلاياتأت/rev^– . (ج) اثنا عشر الممثل تأت/rev⁺ الخلايا المفردة من (أ – ب) ترد عبر ثلاث قطع المتغيرين للتعبير السطحي CD3/خلايا CD4 (يسار)، CD69/CD38 (الأوسط)، ونظام ايكوس/هلا-الدكتور (يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 7 : الأرض تريفارياتي عرض خلية واحدة المورثات الفيروسية (تأت/rev) والجينات المضيف (CD3 أو خلايا CD4) تعبير البروتين السطحي (CD3 أو خلايا CD4) المضيف في الذاكرة المصابة بسيف CD4⁺ تي الخلايا من العقدة الليمفاوية المساريقي العلوي 10 أيام العدوى بوست-SIVmac251- يتم رسم تعبير البروتين CD4 (الأسفار) ضد خلايا CD4 مرناً (qPCR)، بينما ينعكس مقدار تأت/rev أعربت عنها كل خلية بحجم نقطة. في تأت/خلاياالقس⁺ (الأخضر)، انخفض سطح التعبير البروتين CD4 و CD3 مع النصوص CD4 و CD3 المستدام، على التوالي، وتشير إلى أن التعبير البروتين السطحي وهو التضمين المصب التعبير الجيني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: الإشعال والمجسات المستخدمة للكشف عن الأحماض النووية سيف. عندما يتم الإشارة إلى تسلسلين للتمهيدي أو التحقيق، وقد استخدمت المبالغ اكويمولار لكل تسلسل. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 2: لوحة 96-الجينات المستخدمة كوانتيتاتيون أمبليكونس على صك بيومارك. يتم الإشارة إلى أربعة سيف فحوصات مع خلفية زرقاء. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 3: ميكس رد الفعل المستخدمة للنسخ العكسي والتضخيم قبل. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 4: ميكس رد فعل qPCR المستخدمة لبكر في الوقت الحقيقي يقوم على صك كوانت استوديو 6- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف الترميز الإضافي 1. تعليمات لتأهيل فحوصات التعبير الجيني- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

تكميلية ترميز الملف 2: قالب "نموذج لمخطط" في أحزاب اللقاء المشترك- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

تكميلية 3 ملف الترميز: قالب "مخطط التحقيق" في أحزاب اللقاء المشترك- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

تكميلية ترميز ملف 4: البرنامج النصي "التحليل التمهيدي" لأحزاب اللقاء المشترك- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف ترميز إضافي 5. تحليل piecewise البرنامج النصي لأحزاب اللقاء المشترك- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

البروتوكول هو موضح هنا، يسمى تسسيبتري، يدمج كوانتيتيشن البروتين وحيد الخلية السطحية بتدفق مولتيباراميتير الخلوي مع خلية واحدة مرناً التعبير الكمي ب qPCR RT كبير متعدد. تمكن الاتحاد من هذه التقنيات اثنين لقطات عالية المحتوى لمجموع النسخي والشخصية البروتين من الخلايا المفردة في شكل الفائق. نحن استخدام الأسلوب تحديد بعيد المنال حتى الآن الخلايا المصابة مع سيف في فيفو، ووصف المضيف الأثران عن الجينات والبروتينات. البروتوكول يمكن تكييفها لدراسة أي سكان الخلية من الفائدة يمكن تمييزها بالتعبير عن protein(s) السطحية، ومرناً، أو مزيج منها. وصف أساليب تعتمد على فرز دقيقة وحيدة الخلية وبيانات التسجيل عن طريق التدفق الخلوي يقترن الكواشف المتوفرة تجارياً قبكر ومتعدد الأجهزة PCR الوقت الحقيقي. الإخراج تقييم خلية واحدة الجمع بين البروتينات والجينات البيانات التعبير الحساسة، والكمية.

نهوج أخرى تربط بين تعبير البروتينات والجينات في الخلايا المفردة وقد وصف^1،25،،من²⁶²⁷. نظام مراقبة الأصول الميدانية المفهرسة الفرز متبوعاً رناسيق، طبقت بنجاح إلى توصيف الخلايا الجذعية المكونة للدم، يمثل نهج واعدة لا سيما²⁸. بيد بينما رناسيق مزايا عديدة أكثر من الجينات المستهدفة التعبير التحليلات، هي: تحليل الترنسكربيتوم كامل غير متحيزة، يخضع أعلى مقارنات متعددة تكلفة الإحصائية وقد تكون أقل حساسية للتحديد الكمي لنسخة منخفضة النصوص. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس حاليا مجدية اقتصاديا لإجراء رناسيق على آلاف خلايا بحثاً عن الخلايا المصابة نادرة في ترددات < 1% (مثلفيروس نقص المناعة البشرية، سيف). غيرها من التكنولوجيات الناشئة في خلية واحدة تهدف إلى توليد قراءات مفرد، أي بنظام مراقبة الأصول الميدانية أو بكر، للكشف عن البروتينات والأحماض النووية في الخلية نفسها. وهذه تشمل الكشف عن البروتينات بأجسام مضيئة ومرناً بالمسابير اليغنوكليوتيد نيون متبوعاً بنظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل (مرناً-تدفق-الأسماك)^14،15،،من²⁹³⁰. وبدلاً من ذلك، يمكن اكتشاف البروتينات بأزواج من يصرف اليغنوكليوتيد جسم يتم الكشف عنها بواسطة qPCR بالتوازي مع منصبه يدون مرناً^31،،^،من^3233،34 . توفر هذه النهج "الهجينة" الحمض النووي متزامنة وقياسات البروتين مع القرار خلية واحدة مماثلة إلى تسسيبتري، ولكنها محدودة حيث أنهم أما لا الكمية (مرناً-تدفق-الأسماك) أو قد تتطلب تخصيص جسم أو مرناً تحقيقات. نهجنا تسسيبتري الكمية لقياس كل من البروتين ومرناً وجميع الكواشف المتاحة تجارياً، مع الاستثناء المحتمل لفحوصات خاصة بمسببات المرض.

وينبغي تطبيق اهتماما خاصا إلى عدة خطوات في البروتوكول قبل تحليل العينات التجريبية. أولاً، يتطلب معلمة عالية التدفق الخلوي الأمثل حذراً من فريق من الأجسام المضادة الفلورسنت لضمان حساسية الكشف والقرار³⁵. ينبغي أن تيتراتيد كل جسم على حدة لتحديد التركيز الذي يحقق الانفصال الأمثل وتلوين خلفية الحد الأدنى، يليه التقييم لتلطيخ عندما تستخدم كل جسم يصرف في تركيبة. ومن الضروري تصميم تجريبية، والثانية للمقايسة التعبير الجيني qPCR المناسبة لقياس كل الجينات التي تهم. فحوصات المتاحة تجارياً متعددة متوفرة عادة لكل الجينات، لكن تجربتنا، كثير ليست الكمية في خلية واحدة المستوى⁶. وبالتالي، من المهم أن التأهل فحوصات كل المقترحة على التسلسل المخفف الحمض النووي الريبي قبل استخدامها للتعبير الجيني الكمي. الأمثل من هذه الكواشف مضيعة للوقت، ولكن قيمة اللوحات موثوقة يصرف جسم وفحوصات التعبير الجيني الذي يسمح للكشف عن جميع الجزيئات ذات الأهمية الحساسة يبرر استثمار الوقت. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إيلاء الأولوية لفحوصات المتاحة تجارياً التي تتضمن المسابير التي تمتد على تقاطعات إكسون-إكسون (المعينة مع لاحقة "m1") لتحسين النوعية مرناً، على الرغم من أن فحوصات بديلة قادرة على اكتشاف الحمض النووي (لاحقة "s1" أو "g1" ) تعتبر من غير المرجح أن تؤثر نتائج التعبير الجيني بسبب ما يعادل نسخ الكروموسومات في كل خلية. الحفاظ على الحمض النووي الريبي المنبع من الرايت أمر بالغ الأهمية، ويتحقق عن طريق حفظ العينات مبردة، وكما لوحظ في جميع أنحاء البروتوكول. وبالمثل، مدة الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية والفاصل الزمني بين الفرز وينبغي أن تظل RT-preamp إلى الحد أدنى. لكل تحد تمييع وفرز الخلايا المفردة، كدنا يمكن أولاً تحليل قبل قبكر التقليدية لتقييم الانتعاش الحمض النووي الريبي للغاية أعرب عن التدبير المنزلي الجينات. إذا كان التعبير الملاحظة ليست موحدة بين replicates من مثل أرقام الخلية، أو الميل لصالح الخطي للحد من تخفيف فشل التحقق من الصحة، ينبغي إجراء استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الخلية إجراءات الفرز والمتلقين للمعلومات.

وتشمل القيود المحتملة للنهج المذكور هنا (1) الكشف عن الحمض النووي بالإضافة إلى الجيش الملكي النيبالي، لا سيما لفحوصات محددة لا تقاطعات لصق مرناً، وعدد (2) مقيد من البروتينات السطحية والجينات قياس. ومع ذلك، الكشف عن الحمض النووي من المرجح أن تسهم إلى حد كبير إلى تحليل التعبير الجيني المضيف التفاضلية للسبب المذكور أعلاه. وعلاوة على ذلك، قمنا بقياس المدى الذي يسهم فيه الحمض النووي للإشارة قبكر في هذا البروتوكول بنهجين مباشرة: أ) باستثناء المنتسخة العكسية، وب) تعديل بروتوكول تحلل الخلية تعزيز تحلل الغشاء النووي. في غياب المنتسخة العكسية، تقسم على حد سواء، وكان لا يزال الكشف عن المورثات الفيروسية أونسبليسيد، ولكن أقل بكثير في التردد من حضور المنتسخة العكسية (~ تخفيضات 6-fold وإضعاف، على التوالي)²⁰. ومن ثم فقد نبالغ فحوصات تعبير الجينات الفيروسية كمية الحمض النووي الريبي الحالي في خلية بسبب وجود الحمض النووي الفيروسي المرتبط بالخلية الفيروسية. أننا نولي هذه النتيجة إلى هيولى RT المنتجات المتولدة أثناء العدوى الخلية المضيفة، المعروف تحدث "رنا" سيف، فيروس نقص المناعة البشرية المقسمة وأونسبليسيد على حد سواء الصادرة من الواردة فيريونس³⁶. وهكذا، قد يكون من المستصوب تخصيص جزء من التجارب في ظروف تفتقر إلى المنتسخة العكسية كوانتيتاتي قالب المستمدة من الحمض النووي لبعض التطبيقات. كما تجدر الإشارة إلى أن "الجيش الملكي النيبالي" أونسبليسيد سيف، فيروس نقص المناعة البشرية المستمدة من الفيروسات الواردة لا يمكن تمييزها حيثياته توليفها الرنا الفيروسي. ثانيا، نحن إدماج خطوة تحلل نووية البروتوكول RT-preamp ولاحظ زيادة هائلة في المتكاملة "سيف الحمض النووي" (Alu لتر) نسخاً (S3 الرقم من بولتون et al.) ²⁰-"الحمض النووي" فمن المحتمل أن تسهم إلى حد كبير في قالب الحمض النووي المستخرج من الطريقة تحلل الخلية المستخدمة هنا. ملاحظة، يمكن إضافة خطوة تحلل النووية مفيدة خلية واحدة في المستقبل دراسات تسعى إلى التحقيق في سيف أو غيرها خلايا الحمض النووي-إيجابي الفيروس، بما في ذلك الخلايا المصابة خفية.

عدد البروتينات السطحية حلل تمليها القدرة على فارز خلية سيتوميتريك التدفق. الصكوك الحالية المتاحة تجارياً لا تتجاوز 30 معلمات. الدراسات المستقبلية التي تستخدم أكثر تقدما التدفق الخلوي سيوسع البروتين التنميط القدرة لهذا النهج. كما يمكن توسيع عدد النصوص تتجاوز 96، والكواشف الداعمة المقدمة (مثلاً، كبسولة تفجير للتركيز العالي)، المعدات والآلات. وفي نهاية المطاف، ظهور تكنولوجيات الخلايا المفردة التي تجمع بين التحليل للبروتين (الكتلي)، الترنسكربيتوم (رناسيق)، والجينوم (دناسيق) سوف تحل محل النهج الموجهة لاكتشاف البحوث^{31،37، 38 , 39}-بيد سوف qPCR المستهدفة من المرجح أن تظل أداة قيمة للتحقق من صحة هذا النهج "اوميكس" كمعيار الذهب لتحليل التعبير الكمي.

تحليل البروتين والنسخ مجتمعة من تسسيبتري أداة قوية للتحقيق نادرة أو من الصعب تحديد الخلايا مثل تلك إيواء مسببات الأمراض، تحتوي على المسرطنة، أو خلاف ذلك نستعرض النمط الظاهري شاذة. ويمكن تحديد علامات جديدة للخلايا النشطة ترانسكريبتيونالي المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية/سيف بهذه الطريقة، فضلا عن اكتشاف آليات جديدة للمشاركة في الآلية المرضية لهذه الأمراض الفيروسية. تحديد الخلايا المصابة خفية سوف تتطلب مزيدا من التطوير بروتوكول المؤخرات الحمض النووي الفيروسي المتكاملة في جينوم مضيف. من المذكرة، وتردد خلايا المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية/سيف أقل بكثير في حالات العدوى المزمنة فيريميك أو المعالجة، التي سوف تشكل تحديا عمليا في دراسة الخلايا المصابة المستمدة من هذه الإعدادات. نهجنا يرسي الأساس لتقييم إليه سابقا مستعصية على الحل: أن التنظيم بوستترانسكريبشونال على مستوى الخلايا المفردة، وانطباق واسع للتفاعلات الممرض المضيفة، فضلا عن العمليات الخلوية أكثر عمومية.

وأيد هذا العمل (W81XWH-07-2-0067) اتفاق تعاون بين مؤسسة هنري م. جاكسون للنهوض بالطب العسكري, Inc.، وإدارة الولايات المتحدة للدفاع (DOD). الآراء التي أعرب عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي أن تفسر بتمثيل مواقف الجيش الأميركي أو وزارة الدفاع. بحوث أجريت في إطار بروتوكول المعتمد استخدام حيوانات في منشأة آآلاسي المعتمدة عملا "قانون رعاية الحيوان" وغيرها من القوانين الاتحادية واللوائح المتعلقة بالحيوانات وتجارب الحيوانات التي تنطوي وتتمسك بالمبادئ وذكر في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، نشر المجلس النرويجي للاجئين، طبعة 2011.

المؤلف يود أن يشكر نييد فكتوريا التدفق الخلوي الأساسية والمرافق مهرب التدفق الخلوي الأساسية لصيانة وتشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية أدوات ومعدات الفرز؛ ماريا مونتيرو، هرشيني شارما، أغنية كيمي لخبراء المساعدة التقنية؛ مايكل بيتك، الابن (متوفى) للحصول على المساعدة مع سيف qPCR المقايسة التصميم؛ وكيلي براندون، وماثيو سكارلوتا لسيف عزل تسلسل. الآراء التي أعرب عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي أن تفسر بتمثيل مواقف الجيش الأميركي أو وزارة الدفاع. بحوث أجريت في إطار بروتوكول المعتمد استخدام حيوانات في منشأة آآلاك المعتمدة عملا "قانون رعاية الحيوان" وغيرها من القوانين الاتحادية واللوائح المتعلقة بالحيوانات وتجارب الحيوانات التي تنطوي وتتمسك بالمبادئ وذكر في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، نشر المجلس النرويجي للاجئين، طبعة 2011.